Nanodetecção de câncer de cabeça e pescoço na superfície de detecção de óxido de titânio

Resumo

O câncer de cabeça e pescoço é uma doença heterogênea, originada nas células escamosas que revestem a laringe (caixa vocal), boca, faringe (garganta), cavidade nasal e glândulas salivares. O diagnóstico de câncer de cabeça e pescoço em um estágio posterior está influenciando muito a taxa de sobrevivência do paciente. Torna uma situação obrigatória identificar esse câncer nos estágios iniciais de desenvolvimento com um biomarcador adequado. O antígeno do carcinoma de células escamosas (SCC-Ag) é um biomarcador de tumor sérico circulante, e o nível elevado foi encontrado em pacientes com câncer de cabeça e pescoço e está altamente correlacionado com o volume do tumor. A presente pesquisa foi realizada para detectar e quantificar o nível de SCC-Ag sobre óxido de titânio (TiO ₂ ) sensor de eletrodo interdigitado modificado (IDE) por anticorpo SCC-Ag. A detecção de SCC-Ag foi encontrada no nível de 100 fM, enquanto foi melhorada para 10 fM quando o anticorpo foi conjugado com nanostar de ouro, representando uma melhoria de 10 vezes. Curiosamente, esse aumento na sensibilidade é 1000 vezes maior do que outros substratos. Além disso, a análise de especificidade foi realizada usando duas proteínas de controle diferentes e percebeu que o anticorpo só reconheceu SCC-Ag, indicando a detecção específica em IDE-TiO ₂ superfície de detecção.

Introdução

O câncer de cabeça e pescoço mostra o crescimento anormal de células na área da cabeça e pescoço e é amplamente divulgado. Origina-se da garganta, boca, mucosa, epitélio da cavidade oral, glândulas salivares e cavidade nasal [1]; é o sexto câncer mais comumente relatado em todo o mundo; e afeta mais de 644.000 pessoas todos os anos [2]. A maioria dos pacientes afetados são diagnosticados em estágios avançados e afetam fortemente sua sobrevivência. A identificação em estágio inicial do câncer de cabeça e pescoço é obrigatória para melhorar a sobrevida e o estilo de vida. Marcadores sorológicos de tumor têm sido usados para diagnosticar e gerenciar o tratamento de acompanhamento do câncer de cabeça e pescoço. A célula escamosa libera um antígeno de carcinoma de células escamosas predominante (SCC-Ag), sua presença elevada em pacientes com câncer e SCC-Ag tem se mostrado um marcador tumoral promissor com cânceres relacionados a células escamosas, como câncer ginecológico, pulmonar, esofágico e anal [3, 4]. Considerando o câncer de cabeça e pescoço, níveis mais elevados de SCC-Ag têm sido associados à metástase da doença, recorrência e mortalidade, conforme atestado em diferentes estudos com pacientes com câncer [5,6,7]. Os pesquisadores descobriram que o SCC-Ag sérico tinha um nível de risco significativo para câncer na hipofaringe, cavidade oral e laringe [8, 9]. Além disso, houve uma correlação entre o nível de SCC-Ag e o volume do tumor em pacientes com câncer de cabeça e pescoço [10]. É aconselhável quantificar o nível de SCC-Ag para identificar a condição do câncer de cabeça e pescoço, a fim de fornecer o tratamento mais precoce. A pesquisa atual foi focada na detecção de SCC-Ag em seu nível inferior usando a nanopartícula em sensor de eletrodo interdigitado (IDE) por anticorpo SCC-Ag.

IDE é um biossensor eletroquímico com características promissoras como baixo custo, portátil e sensível, possui uma ampla gama de aplicações, em particular com monitoramento ambiental e diagnóstico médico [11, 12]. Aumentar a propriedade elétrica na superfície de detecção melhora a detecção de biomoléculas. A aplicação de nanomateriais tem sido amplamente utilizada no biossensor para melhorar a detecção biomolecular em superfícies de detecção. Os nanomateriais são menores em tamanho, possuem área superficial maior, apresentam boa condutividade térmica e elétrica, são compatíveis com biomoléculas e apresentam uma tremenda capacidade de aplicação no campo de biossensores [13, 14]. O nanomaterial tem sido aplicado de duas maneiras diferentes para fins:uma é a funcionalização da superfície e outra é a conjugação do analito ou alvo para melhorar a detecção [15]. O ouro é um dos nanomateriais bem estabelecidos e aplicado em vários sensores, que incluem ressonância plasmônica de superfície, sensor de modo de guia de onda, sensor eletroquímico e colorimetria [16,17,18]. Além disso, nanomateriais de prata, grafeno, cobre e titânio também foram aplicados em diversas aplicações biomédicas. Como um semicondutor ecológico e de baixo custo, óxido de titânio (TiO ₂ ) tem um largo intervalo de banda utilizado aqui para a modificação de superfície no IDE para detectar SCC-Ag. Devido às altas propriedades elétricas e ópticas do TiO ₂ , é amplamente utilizado para fins de supercapacidade, conversões fotocatalíticas e fotoelétricas [19,20,21,22,23]. Além disso, sua natureza de hidrofilicidade e área de superfície maior são adequadas para a modificação da superfície e ajudam a detectar as biomoléculas em um nível inferior. Nesta pesquisa, TiO ₂ foi revestido na superfície de detecção IDE para aumentar o fluxo elétrico quando a interação de biomoléculas está acontecendo. Para melhorar a detecção de SCC-Ag, um anticorpo foi conjugado com nanostar de ouro (anticorpo GNS) e imobilizado em TiO ₂ -superfície revestida. Uma vez que foi comprovado que as biomoléculas conjugadas com nanomaterial de ouro exibem uma maior estabilidade e fornecem as biomoléculas imobilizadas na superfície adequadamente orientadas, ela tem a capacidade de melhorar o limite de detecção [24, 25]. Além disso, mais biomoléculas podem ser imobilizadas em uma única partícula de ouro, o que leva a atrair os níveis elevados da molécula alvo. Neste trabalho, dois nanomateriais diferentes, a saber TiO ₂ (para modificação de superfície) e GNS (para conjugação de anticorpos), foram usados para melhorar a detecção de SCC-Ag na superfície de detecção IDE. Espera-se que a aplicação do GNS melhore o desempenho com o sensor de corrente por sua superfície maior para capturar o maior número de anticorpos.

Materiais e métodos

Reagentes e biomoléculas

O antígeno SCC (uma glicoproteína com isoformas variando de 45 a 55 kDa) foi adquirido na Randox Life Sciences (Malásia). O anticorpo anti-SCC foi adquirido na Next Gene (Malásia). (3-aminopropil) trietoxissilano (APTES), etanolamina, albumina (uma proteína importante do sangue a 45 mg / mL; 50-70% da proteína do sangue com um peso molecular de 66,5 kDa), solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) e o isopropóxido de titânio IV eram da Sigma Aldrich (EUA). Serpina (uma inibição de serina protease comumente distribuída com um peso molecular de 40 a 50 kDa) era da Sino Biological (China). A nanostar de ouro foi sintetizada conforme descrito por Shan et al. [26]. Todos os reagentes e produtos químicos obtidos foram armazenados em local recomendado pelo fabricante.

Fabricação de eletrodos interdigitados

O projeto básico e a fabricação de IDE foram seguidos conforme relatado anteriormente [27]. Inicialmente, o wafer de silício foi limpo pelas soluções de limpeza padrão e o eletrodo IDE de alumínio foi depositado pelo método tradicional de corrosão úmida no wafer de silício. Em seguida, o fotorresiste positivo foi depositado na superfície do wafer de silício, seguindo-se a oxidação térmica. A deposição de alumínio foi realizada pela técnica de fotolitografia. Três etapas foram envolvidas, sendo a etapa 1 com 1200 rpm por 10 s e a etapa 2 com 3500 rpm por 20 s, seguida de 500 rpm por 10 s. E então, a luz ultravioleta (UV) foi exposta na superfície de detecção para transferir o padrão de IDE para a superfície da amostra. Depois disso, o desenvolvedor RD-6 foi usado por 15 s para realizar o processo de desenvolvimento. A resistência à foto foi feita para eliminar as regiões não expostas. A amostra desenvolvida foi cozida a 100 °° C para limpar a umidade desnecessária e melhorar a adesão entre o SiO ₂ camada e o alumínio. Finalmente, usando 23 s de ácido de alumínio, a área não exposta foi removida e limpa com acetona. A superfície final foi modificada por TiO ₂ para detectar SCC-Ag. A superfície IDE fabricada foi observada sob microscopia de alta potência e nanoprofiler 3D. As imagens foram capturadas usando o sistema associado com aumento de 50 ×.

Revestimento de TiO ₂ na superfície de detecção IDE

Na superfície IDE fabricada, TiO ₂ solução foi revestida e isopropóxido de titânio IV foi usado como um precursor para preparar a solução de TiO ₂ . Para isso, o etanol foi misturado com isopropóxido de titânio IV e agitado vigorosamente por 5 min. E então, o estabilizador (100 μL de ácido acético) foi colocado sob a condição de agitação e, em seguida, aquecido em uma placa quente a uma temperatura de 85 ° C. A razão molar da mistura foi fixada como 9:1:0,1 (etanol para TIP para ácido acético). Após 3 h de mistura, foi obtida uma solução límpida. Após 24 h do processo de envelhecimento, a solução foi despejada em dióxido de silício (SiO ₂ ) substratos usando o aplicador de centrifugação a uma velocidade de 2.000 rpm. Após o revestimento, a superfície foi seca durante 15 min a uma temperatura de 175 ° C e recozida durante 1 h a 450 ° C. O TiO ₂ o filme fino adquire uma espessura suficiente após o revestimento de três camadas.

Preparação de anti-SCC-Ag conjugado com GNS

O anticorpo SCC-Ag foi imobilizado em GNS usando o ligante ácido 16-mercaptoundecanóico (16-MDA). Inicialmente, 5 mM de 16-MDA diluído foram misturados com 100 μL de GNS e mantidos em temperatura ambiente (TA) por 30 min. O 16-MDA ligado com GNS foi removido por centrifugação a 13.000 × g , 5 min. Em seguida, o pellet de ouro coletado foi ativado por EDC (400 mM) e NHS (50 mM) na proporção de 1:1 por incubação por 15 min em temperatura ambiente. O EDC não ligado e NHS da mistura de solução foram eliminados por centrifugação a 13.000 × g , 5 min. O sedimento contendo o GNS ativado foi coletado para conjugar o anticorpo. Seguido por 200 nM de anticorpo SCC-Ag foi misturado com EDC-NHS-GNS ativado e mantido em temperatura ambiente por 1 h. Finalmente, os anticorpos não ligados foram removidos por centrifugação a 13.000 × g , 5 min. O anticorpo conjugado com GNS foi mantido a 4 ° C para uso posterior, e a conjugação foi confirmada por varredura de espectroscopia UV-Vis. A varredura foi realizada na região entre 480 e 560 nM, e os máximos de pico foram encontrados.

Imobilização em anticorpo GNS em TiO ₂ -IDE Surface

O TiO ₂ A superfície IDE revestida foi ainda modificada em amina por APTES para imobilizar o anticorpo GNS. APTES com 3% (diluído em etanol 30%) foi derramado em TiO ₂ superfície e mantida por 3 h em temperatura ambiente. A superfície foi lavada três vezes com etanol a 30% para remover APTES não ligados. Para imobilizar o anticorpo, a etapa de ativação foi seguida conforme mencionado acima. O anticorpo ou anticorpo GNS foi descartado nas superfícies e aguardado 1 h para completar o processo de imobilização. Finalmente, a superfície foi lavada cinco vezes com tampão PBS para eliminar completamente os anticorpos não ligados. Estas superfícies modificadas com anticorpos ou GNS foram utilizadas para detectar o SCC-Ag e comparadas. O TiO ₂ imobilizado com anticorpo GNS superfície foi analisada por microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de transmissão de emissão de campo (FETEM) e analisador de energia dispersiva de raios-X (EDX) conforme descrito anteriormente [15]. As observações de AFM estavam na escala de 5 μm, enquanto o SEM estava na escala de 100 nM operado com 15 kV. A presença dos elementos foi constatada por EDX.

Detecção de antígeno SCC em superfícies de anticorpo nanostar ouro / ouro

Para detectar SCC-Ag, anticorpo ou TiO modificado com anticorpo nanostar de ouro ₂ As superfícies -IDE foram bloqueadas por etanolamina 1 M para mascarar as áreas de superfície livres de anticorpos e mantidas por 30 min em temperatura ambiente. Na superfície bloqueada com etanolamina, 1 nM de SCC-Ag interagiu e as respostas de corrente foram observadas antes e após a adição de SCC-Ag. Para avaliar o limite de detecção, SCC-Ag foi titulado de 10 fM a 1 nM e descartado individualmente no anticorpo ou nas superfícies modificadas do anticorpo GNS e as respostas com a corrente foram anotadas. As experiências foram realizadas em triplicado e calculadas as estatísticas. Uma tensão de varredura linear de 0 a 2 V a uma tensão de passo de 0,01 V foi seguida para as medições. O limite de detecção (LOD) foi considerado a concentração mais baixa de um analito (da linha de calibração em baixas concentrações) contra o sinal de fundo ( S / N =3:1), em outras palavras, LOD =desvio padrão da linha de base + 3 σ .

Detecção seletiva de SCC-Ag

Para verificar a interação seletiva do SCC-Ag com o seu anticorpo, foram realizados experimentos de controle com duas proteínas diferentes, a saber, serpina e albumina. Uma concentração de 1 nM dessas proteínas de controle foi descartada no anticorpo ou nas superfícies modificadas do anticorpo GNS, e as mudanças na corrente foram observadas antes e depois da interação. Estes níveis atuais foram comparados com a detecção específica de SCC-Ag por seu anticorpo e anticorpo GNS. Outras configurações experimentais de controle incluem a interação de SCC-Ag com GNS sozinho e SCC-Ag com TiO ₂ Superfície de -IDE revestida por GNS não imune marcado com anticorpo. As experiências foram realizadas em triplicado e calculadas as estatísticas. Uma tensão de varredura linear de 0 a 2 V a uma tensão de passo de 0,01 V foi seguida para as medições.

Resultados e discussão

O câncer de cabeça e pescoço tem sido descrito como diferentes tumores que se desenvolvem dentro ou ao redor do nariz, boca, laringe e seios da face [28]. O diagnóstico precoce e o tratamento com um biomarcador adequado são obrigatórios para melhorar a taxa de sobrevida dos pacientes. SCC-Ag foi encontrado como um biomarcador sérico adequado para câncer de cabeça e pescoço; aqui, os experimentos foram realizados para detectar e quantificar o nível de SCC-Ag em TiO ₂ sensor de eletrodo interdigitado (IDE) modificado por seu anticorpo. TiO ₂ é usado aqui para melhorar a resposta atual durante a interação de biomoléculas. Comparado com outros nanomateriais, TiO ₂ é considerado atrativo no sensor eletroquímico devido ao seu comportamento ativo na superfície ao longo dos eletrodos e melhora da atividade eletrocatalítica. Além disso, confere mais estabilidade à superfície, o que proporciona a repetibilidade da resposta do eletrodo e o aprimoramento do limite de detecção pelo aumento da corrente de pico [29,30,31]. Para utilizar esse recurso positivo, nesta pesquisa, TiO revestido ₂ na superfície IDE (IDE-TiO ₂ ) melhora o fluxo de corrente. Outro nanomaterial GNS foi usado para imobilizar o anticorpo anti-SCC-Ag no IDE-TiO ₂ superfície e para aumentar o limite de deleção. Uma vez que foi provado que a superfície imobilizada por biomolécula conjugada com ouro melhora a detecção do alvo [32, 33], aqui, SCC-Ag foi detectado e comparado com anticorpo e GNS IDE-TiO modificado ₂ superfícies. Como generalizado em outro lugar, com um aumento na área de superfície da nanopartícula, haverá um aprimoramento na fixação biomolecular. Nesse contexto, o GNS tem uma superfície maior em comparação com a nanopartícula esférica de ouro. Para implementar essa ideia, o experimento atual foi realizado usando GNS para aumentar a sensibilidade.

Caracterização de superfície e imobilização de anticorpo GNS

A Figura 1 mostra a representação esquemática da detecção de SCC-Ag no IDE-TiO ₂ superfície de detecção. Conforme exibido na Fig. 1a, inicialmente, a superfície de detecção IDE foi revestida com TiO ₂ e então o anticorpo foi imobilizado com ou sem conjugação GNS. Estas superfícies modificadas com anticorpos foram utilizadas para detectar o nível de SCC-Ag. Antes de realizar a detecção, a conjugação do GNS com o anticorpo foi confirmada por espectroscopia UV-Vis. Os perfis de varredura GNS com a faixa de comprimento de onda desejada antes e depois da conjugação com o anticorpo foram determinados. Foi visto claramente que após a imobilização, o turno foi movido de 535 para 545 nM (Fig. 1b). Este resultado confirma a conjugação de anticorpos na superfície do GNS. Por outro lado, a superfície de detecção fabricada foi observada morfologicamente. A Figura 2a exibe a imagem de microscopia de alta potência, enquanto a Fig. 2b descreve a imagem capturada da imagem de nanoprofiler 3D. Ambos os perfis de imagem são claramente mostrados com lacunas e regiões de eletrodo, que formam os dedos. O arranjo das lacunas e dedos parecia ser uniforme e intacto.

a Representação esquemática para a detecção de SCC-Ag. IDE-TiO ₂ a superfície foi modificada em amina por APTES seguido pela imobilização do anticorpo ou anticorpo GNS. O grupo amina de APTES reage com o grupo carboxila no anticorpo. O SCC-Ag foi detectado pela interação na região antigênica e comparado. b Medições de espectroscopia UV-Vis com GNS. A varredura estava na região entre 480 e 560 nM, e os máximos de pico foram ~ 530 nM. GNS com e sem anticorpo são indicados pelas setas

a Imagem de microscopia de alta potência na superfície IDE. As imagens foram capturadas em × 50. b Imagem do nanoprofiler 3D na superfície IDE. As imagens foram capturadas em × 50. Eletrodo e regiões de lacuna são mostradas. As lacunas são indicadas por estrelas. Arranjos uniformes indicam a fabricação bem-sucedida. c Imagem de microscopia de força atômica. AFM exibe uma discriminação clara entre TiO ₂ e GNS por pontos escuros e brilhantes, respectivamente. d Imagem de microscopia eletrônica de transmissão de emissão de campo. e Análise de raios-X por dispersão de energia. Indicou os elementos encontrados na superfície

Comparação de TiO de imobilização de anticorpo e GNS ₂ -IDE Sensing Surfaces

SCC-Ag foi detectado em TiO ₂ Superfície -IDE por superfícies imobilizadas com anticorpo ou GNS. O anexo do GNS no TiO ₂ superfície foi confirmada por AFM, observações SEM e análise EDX (Fig. 2c). Sob observação do AFM, uma clara discriminação foi observada entre TiO ₂ e GNS por pontos escuros e brilhantes, respectivamente. Isso foi apoiado por análises de SEM e EDX, nas quais foram observados picos proeminentes de ouro e moderados de titânio. Esses resultados evidenciam a ocorrência de GNS no TiO ₂ superfície. A Figura 3 mostra os processos de imobilização do anticorpo e do anticorpo GNS no IDE-TiO modificado com amina ₂ superfícies de detecção. TiO ₂ a superfície de detecção IDE modificada mostra o nível de corrente como 4,65E-12 (Fig. 3a). Depois de adicionar APTES, o nível atual foi aumentado para 5,37E-11; este incremento na corrente indicou que a superfície foi modificada em amina por APTES. Quando o anticorpo foi imobilizado, o nível atual foi alterado de 5,375E-11 para 1,05E-9. A diferença na corrente foi observada como 1.04E − 9 (Fig. 3a). Essa imobilização ocorreu devido à interação química do grupo amina do grupo APTES e COOH no anticorpo [18]. As mudanças na corrente confirmaram a ligação do anticorpo na superfície modificada por APTES. Depois disso, a superfície restante foi coberta por etanolamina 1 M para reduzir o efeito de bioincrustação da ligação não específica de biomoléculas na superfície de detecção. Da mesma forma, o anticorpo GNS foi imobilizado em TiO ₂ -IDE superfície, e quando o anticorpo GNS foi imobilizado na superfície modificada por APTES, o nível de corrente foi aumentado de 4,41E-12 para 1,23E-9 (Fig. 3b). Verificou-se claramente que, quando o anticorpo foi imobilizado na superfície GNS, mostra a maior resposta na superfície modificada com amina. Isso pode ser devido ao maior número de anticorpos que se ligam na superfície de um único GNS e à forte ligação desse complexo na superfície modificada com amina. Esta ligação aconteceu devido ao grupo do terminal amino no APTES deslocar os grupos citrato no GNS e fixados quimicamente na superfície IDE modificada pelo APTES [34]. É bem conhecido que a detecção de biomoléculas nas superfícies de detecção depende principalmente de dois fatores, a saber, a afinidade de ligação de moléculas interativas e a imobilização de superfície adequada de moléculas na superfície de detecção. A imobilização biomolecular mais alta na superfície de detecção melhorou drasticamente a detecção de um alvo em seu nível inferior. Nesta pesquisa, o GNS foi usado para imobilizar o anticorpo anti-SCC-Ag em IDE-TiO ₂ superfície a fim de aumentar a chance de maior ligação do anticorpo, o que leva a detecção eficiente de SCC-Ag.

Processos de imobilização em IDE-TiO ₂ superfícies. a Com anticorpo. b Com anticorpo GNS. As modificações de superfície foram iniciadas por APTES a 3%, seguidas por EDC e ativação de NHS para imobilizar o anticorpo; 1 M de etanolamina foi usado para bloquear a região não ligada do anticorpo. Uma tensão de varredura linear de 0 a 2 V a uma tensão de passo de 0,01 V foi seguida para as medições. Mudanças adequadas na corrente após cada imobilização foram confirmadas a ligação do anticorpo e do anticorpo GNS nas superfícies de detecção

Detecção comparativa de SCC-Ag em IDE-TiO ₂ Superfície por anticorpo ou anticorpo GNS

Uma vez que o anticorpo GNS mostra a imobilização eficiente em IDE-TiO ₂ superfície, a concentração semelhante de 1 nM de SCC-Ag foi detectada em ambas as superfícies do anticorpo e do anticorpo GNS e comparou as mudanças no nível atual. A Figura 4a mostra 1 nM de detecção de SCC-Ag em uma superfície modificada com anticorpo. Antes de realizar a detecção, a superfície modificada com anticorpo foi coberta pelo agente bloqueador etanolamina para evitar a ligação não específica de biomoléculas. A etanolamina mostra a mudança atual como 4,65E-12. Depois de adicionar 1 nM de SCC-Ag, o nível atual foi aumentado para 1,33E-09. Essas mudanças atuais indicaram claramente a ligação do SCC-Ag ao seu anticorpo. No caso da superfície do anticorpo GNS, a etanolamina mostra o nível atual como 1,33E-11; após adicionar 1 nM de SCC-Ag, foi aumentado para 1,62E-09 (Fig. 4b). As alterações atuais com o anticorpo GNS foram maiores em comparação com apenas a superfície modificada com anticorpo para uma concentração semelhante de SCC-Ag. Isso pode ser devido ao maior número de anticorpos ligados em IDE-TiO ₂ superfície através do GNS.

Detecção de SCC-Ag com a anticorpo e b Anticorpo GNS. Testado em IDE-TiO ₂ superfícies com as etapas acima até 1 M de bloqueio de etanolamina. Uma tensão de varredura linear de 0 a 2 V a uma tensão de passo de 0,01 V foi seguida para as medições. Após interagir 1 nM de SCC-Ag, os níveis atuais foram aumentados em ambos os casos; ao mesmo tempo, mostra uma mudança de corrente mais alta com o anticorpo GNS

Limite de detecção de SCC-Ag em IDE-TiO ₂ Superfície por anticorpo ou anticorpo GNS

As superfícies modificadas com anticorpo ou GNS mostram uma detecção clara de SCC-Ag e o limite de detecção foi estimado em ambas as superfícies para comparação (Figura 5a, b). Para isso, as concentrações de 10 fM a 1 nM de SCC-Ag foram diluídas e descartadas nessas superfícies individualmente e observadas as mudanças na corrente. A Figura 5a mostra as diferentes concentrações de ligação SCC-Ag na superfície modificada com anticorpo. Após a etanolamina, 10 fM de SCC-Ag interagiram e não houve alteração da corrente observada. Quando aumentou a concentração para 100 fM, houve uma pequena mudança na corrente de 4,65E-12 para 6,54E-11. Além disso, as concentrações aumentaram para 1 pM, 10 pM, 100 pM e 1 nM, e os níveis atuais aumentaram para 4,69E-10, 7,91E-10, 8,78E-10 e 1,33E-09, respectivamente. Esses resultados indicam claramente que, com o aumento das concentrações, a ligação também aumenta. O limite de detecção foi calculado com base em 3 σ , e estava a 100 fM (Fig. 6a).

Interações dependentes da dose com a anticorpo e b Anticorpo GNS em IDE-TiO ₂ superfícies. A superfície está com as etapas anteriores até 1 M de bloqueio de etanolamina. Uma tensão de varredura linear de 0 a 2 V a uma tensão de passo de 0,01 V foi seguida para as medições. As concentrações de SCC-Ag de 10 fM a 10 nM interagiram em ambas as superfícies e as mudanças atuais foram notadas. A lavagem foi realizada por cinco volumes de reação em cada etapa usando PBS 10 mM (pH 7,4). Com o aumento das concentrações de SCC-Ag, os níveis atuais foram aumentados gradualmente em ambos os casos. O anticorpo GNS mostra as alterações atuais de 10 fM, enquanto alterações de 100 fM foram observadas apenas com o anticorpo. Em ambos os casos (anticorpo e anticorpo GNS), 1 nM SCC-Ag exibiu a saturação. Quando a concentração é aumentada ainda mais, quaisquer mudanças significativas na corrente não puderam ser observadas

Comparação das alterações atuais com diferentes concentrações de SCC-Ag em superfícies modificadas com anticorpos e GNS. a Gráfico de regressão linear para o limite de detecção de SCC-Ag. Com anticorpo (linha vermelha) e com anticorpo GNS (linha azul) são exibidos. O limite de detecção foi encontrado em 10 fM com anticorpo GNS e 100 fM com apenas anticorpo. b Mudanças atuais com SCC-Ag e interação de anticorpos. Com todas as concentrações, um nível mais alto de alterações de corrente foi encontrado na superfície do anticorpo GNS. Uma tensão de varredura linear de 0 a 2 V a uma tensão de passo de 0,01 V foi seguida para as medições. A barra de erro indica os valores médios de triplicados ( n =3) com os desvios padrão estão na faixa de ± 0,1 a 0,15 × 10 ⁻⁹ A. O limite de detecção (LOD) foi considerado a concentração mais baixa de um analito (da linha de calibração em baixas concentrações) contra o sinal de fundo ( S / N =3:1), em outras palavras, LOD =desvio padrão da linha de base + 3 σ

As mesmas concentrações de SCC-Ag interagiram independentemente em superfícies modificadas com anticorpos GNS. Quando 10 fM de SCC-Ag caiu na superfície, ele mudou claramente a corrente de 1,33E-11 para 3,74E-11. Este resultado mostra que mesmo 10 fM de SCC-Ag pode interagir claramente com a superfície imobilizada do anticorpo GNS, o que não pode ser detectado no caso apenas com o anticorpo. Além disso, quando as concentrações aumentaram para 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM e 1 nM, os níveis de corrente aumentaram ainda mais para 4,69E-10, 9,23E-10, 1,41E-09, 1,48E-09 e 1.62E-09, respectivamente (Fig. 5b). Os cálculos estatísticos com os desvios padrão estão na faixa de ± 0,1 a 0,15 × 10 ⁻⁹ A. Quando comparada com a detecção nas duas superfícies acima, a superfície modificada com anticorpo GNS mostra as mudanças mais altas na corrente com todas as concentrações de SCC-Ag testadas (Fig. 6b). Baseado em 3 σ , ele poderia encontrar o limite de detecção como 10 fM (Fig. 6a), isso é 10 vezes melhor (menor) detecção em comparação com apenas a superfície modificada com anticorpo. O cálculo estatístico com os desvios padrão está na faixa de ± 0,1 a 0,15 × 10 ⁻⁹ A. Anteriormente, o SCC-Ag foi avaliado em diferentes nanomateriais, como nanopartículas de estrôncio e grafeno; no entanto, essas superfícies exibiram sensibilidade ~ 1000 vezes menor em comparação com o estudo atual [35].

Detecção seletiva de SCC-Ag em superfícies modificadas com anticorpos / GNS

A detecção seletiva de SCC-Ag foi comparada com duas proteínas de controle, a saber, serpina e albumina, que são abundantes na corrente sanguínea. Serpina é um inibidor de protease que desempenha diferentes funções fisiológicas e processos biológicos humanos, enquanto a albumina é responsável por 45 mg mL ⁻¹ e contribui com 50–70% no soro sanguíneo. Como mostrado na figura, a concentração de 1 nM dessas duas proteínas de controle e SCC-Ag foi descartada individualmente nas superfícies do anticorpo ou do anticorpo GNS (Fig. 7a); foi claramente visto que as alterações atuais só foram notadas com SCC-Ag em ambos os casos, indicando que o anticorpo é capaz de reconhecer apenas SCC-Ag. Não há mudanças significativas notadas na corrente com a interação das proteínas de controle. Este experimento confirma que a configuração experimental atual pode detectar / diagnosticar especificamente o SCC-Ag. Suportes adicionais foram fornecidos por outros experimentos de controle pelas interações de SCC-Ag com GNS sozinho e SCC-Ag com TiO ₂ Superfície -IDE revestida com GNS marcado com anticorpo não imune. Não houve mudanças significativas na corrente observada em comparação com a interação específica (Fig. 7b).

a Detecção seletiva de SCC-Ag em superfícies modificadas com anticorpos e GNS. Interações com C1-serpina e C-2-albumina foram realizadas. A superfície está com as etapas anteriores até 1 M de bloqueio de etanolamina. Os valores foram calculados em triplicado. Em ambos os casos, o anticorpo reconheceu apenas o SCC-Ag, indicando a detecção específica. b Medições de controle. As interações de especificidade são comparadas com as interações não específicas. Foram notadas discriminações claras. Uma tensão de varredura linear de 0 a 2 V a uma tensão de passo de 0,01 V foi seguida para as medições. A barra de erro indica os valores médios de triplicados ( n =3) com os desvios padrão na faixa de ± 0,1 a 0,15 × 10 ⁻⁹ UMA

Conclusão

O câncer de cabeça e pescoço é um câncer comum que afeta as áreas da boca, garganta e glândulas salivares. Diagnosing head and neck cancer with a suitable biomarker is mandatory to give the necessary treatment to the patients and improve their lifestyle. SCC-Ag has been found to be one of the important biomarkers for cancers; herein, SCC-Ag was detected on the titanium oxide-coated interdigitated electrode sensing surface (IDE-TiO₂ ) Antibody for SCC-Ag was immobilized on IDE-TiO₂ surface and detected the SCC-Ag. The detection limit was found as 100 fM, and further increment in the limit of detection was attained by conjugating the antibody with gold nanostar (GNS antibody). The limit of detection was improved by 10-folds (to 10 fM), this might be due to the larger number of antibody bound on the amine-modified TiO₂ surface through GNS. Moreover, control experiments were carried out with two different proteins and not able to recognize by the anti-SCC-Ag, indicating the selective detection of SCC-Ag. The demonstrated IDE-TiO₂ sensing surface helps to diagnose the head and neck cancer, a strategy can be followed for the earlier detection.