Ajuste da química da superfície de polieteretercetona por revestimento de ouro e tratamento com plasma

Resumo

A poliéteretercetona (PEEK) tem boas propriedades químicas e biomecânicas excelentes para aplicações biomédicas. No entanto, PEEK exibe características hidrofóbicas e outras características de superfície que causam adesão celular limitada. Nós investigamos o potencial do tratamento com plasma Ar para a formação de uma superfície PEEK nanoestruturada, a fim de aumentar a adesão celular. O objetivo específico deste estudo foi revelar o efeito da interface de matrizes PEEK tratadas com plasma e revestidas com ouro na adesão e disseminação de fibroblastos embrionários de camundongo. As características da superfície (polaridade, química da superfície e estrutura) antes e depois do tratamento foram avaliadas por várias técnicas experimentais (gravimetria, goniometria, espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) e análise eletrocinética). Além disso, a microscopia de força atômica (AFM) foi empregada para examinar a morfologia e rugosidade da superfície PEEK. A resposta biológica das células para PEEK nanoestruturada foi avaliada em termos de adesão, propagação e proliferação celular. A morfologia celular detalhada foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Comparado ao tratamento de plasma, o revestimento de ouro melhorou a molhabilidade de PEEK. O método XPS mostrou uma diminuição na concentração de carbono com o aumento do tempo de tratamento com plasma. A adesão celular determinada na interface entre as matrizes PEEK tratadas com plasma e revestidas com ouro foi diretamente proporcional à espessura de uma camada de ouro em uma amostra. Nossos resultados sugerem que o tratamento de plasma em combinação com revestimento de ouro pode ser usado em aplicações biomédicas que requerem adesão celular aprimorada.

Histórico

Um dos problemas do envelhecimento humano é o desgaste das articulações, que está relacionado a um aumento acentuado na abundância de várias aflições do sistema esquelético e articular, incluindo fraturas, degenerações vertebrais, artrite e tumores ósseos. As cirurgias ortopédicas com implantes artificiais são atualmente o principal método utilizado para a renovação estrutural e funcional de ossos e articulações lesados. Os materiais comumente usados ​​para implantes ortopédicos são especialmente metais, cerâmicas, polímeros e compostos. Implantes de metal (por exemplo, ouro) são amplamente usados ​​na prática clínica como substituições permanentes (por exemplo, substituições de quadril, dentes artificiais) ou como próteses temporais (por exemplo, discos, dobradiças, parafusos e hastes usadas para corrigir fraturas). Os metais são favorecidos por sua resistência mecânica, resistência ao desgaste e não toxicidade [1,2,3]. Por outro lado, sua alta resistência mecânica e baixa elasticidade são incompatíveis com o tecido esquelético humano. Isso pode ter um impacto negativo em um implante ósseo, o que pode levar à absorção de um tecido ósseo adjacente e à liberação do implante. Polímeros como polietileno de peso molecular ultra-alto (UHMWPE), politetrafluoretileno (PTFE), polimetilmetacrilato (PMMA), polilactídeo (PLA), poliglicólido (PGA) e polihidroxibutirato (PHB) são amplamente usados ​​em várias aplicações biomédicas. Mas apenas um número limitado de polímeros tem sido usado como substitutos ósseos ou articulares, uma vez que eles tendem a ser muito flexíveis e fracos para atender às demandas colocadas em implantes ortopédicos mecânicos [4, 5].

A poliéteretercetona (PEEK) é um polímero termoplástico aromático policíclico linear semicristalino sintetizado pela primeira vez em 1978 [6]. PEEK é comumente usado como um material para espaçadores intervertebrais e parafusos ósseos [7, 8]. Devido à sua estrutura química especial, o PEEK possui alta resistência às mudanças químicas e físicas [6, 9, 10]; além disso, é resistente ao desgaste e estável sob altas temperaturas [6]. Além disso, a biocompatibilidade do PEEK foi comprovada tanto in vitro quanto in vivo e não causa nenhum efeito tóxico ou mutagênico [11,12,13]. Sua grande vantagem é a elasticidade semelhante à de um osso humano, que permite uma distribuição equilibrada do peso entre um implante e um osso; portanto, não há efeito de proteção contra estresse após a implantação. No entanto, PEEK exibe propriedades hidrofóbicas e bioinerte, que não são favoráveis ​​para a adsorção de proteínas e adesão celular [14, 15]. Assim, para melhorar essas propriedades, a superfície PEEK precisa ser modificada.

As características da superfície dos materiais podem ser ajustadas por várias técnicas [16]. Um desses métodos é a modificação de uma superfície de biopolímero por plasma, que utiliza gás ionizado produzido em sistema de reator fechado contendo gás sob baixa pressão e aparelhos para excitação eletromagnética de gases. Em comparação com as técnicas úmidas, a modificação por plasma de uma superfície de biopolímero é vantajosa para a flexibilidade química. Partículas reativas geradas eletromagneticamente interagem com a superfície do biopolímero em um reator, causando uma mudança em suas propriedades físicas e químicas. As propriedades mecânicas, elétricas e ópticas do volume do material, relevantes para sua aplicação, permanecem inalteradas [17], o que é vantajoso no projeto, desenvolvimento e fabricação de polímeros biocompatíveis. Outro método usado para melhorar as propriedades da superfície do polímero é a pulverização catódica. A integração de nanopartículas de ouro em um filme fino é importante para várias aplicações, por exemplo, engenharia de tecidos e sensoriamento biológico [18]. O tamanho das nanopartículas influencia o comportamento e as propriedades da superfície do material (por exemplo, densidade, parâmetro de rede, propriedades elétricas e ópticas) [19]. Especialmente as nanopartículas menores que 100 nm freqüentemente aumentam a adesão e proliferação celular [20].

O objetivo deste trabalho foi formar nanoestruturas em PEEK por tratamento de plasma e deposição de ouro para melhorar a adesão e proliferação celular, especificamente de fibroblastos embrionários de camundongo (L929). As características da superfície (polaridade, química da superfície e estrutura) antes e depois do tratamento foram avaliadas por várias técnicas (gravimetria, goniometria, espectroscopia de fotoelétrons de raios-X e análise eletrocinética). Além disso, a microscopia de força atômica foi empregada para examinar a morfologia e rugosidade da superfície PEEK. Os resultados são discutidos no contexto de potenciais aplicações biomédicas, principalmente para possível utilização na construção de implantes espinhais e outros substitutos para ortopedia e traumatologia.

Métodos

Materiais e modificações

Uma folha PEEK (a espessura de 50 μm, a densidade de 1,26 g cm ⁻³ , fornecido por Goodfellow Ltd., Reino Unido) foi utilizado para todas as experiências. Todas as amostras PEEK (circular, ø =2 cm) foram tratados com plasma que foi seguido por metade de revestimento de ouro de cada amostra. As amostras PEEK foram tratadas em direto (brilho, diodo) Ar ⁺ plasma usando dispositivo Balzers SCD 050 (BalTec AG, Pfäffikon, CH) sob as condições descritas em [18, 21]. Os tempos de tratamento foram 60 e 240 s, e a potência de descarga foi de 8,3 W. O revestimento de ouro de PEEK foi realizado pelo dispositivo Balzers SCD 050 a partir de um alvo de ouro (pureza de 99,95%, fornecido por Safina Ltd., CZ). As condições de deposição foram DC Ar ⁺ plasma; pureza do gás de 99,995%; tempos de sputtering de 30, 150 e 300 s, corrente de 40 mA (potência de descarga 15 W); e total Ar ⁺ pressão. A distância do eletrodo, a densidade de potência e a taxa média de deposição foram ajustadas da mesma forma como descrito em [18, 22]. As amostras preparadas foram armazenadas em condições de laboratório (24 ° C, 40-60% de umidade) [23].

Técnicas de medição

Gravimetria

A espessura média dos filmes de ouro foi medida por gravimetria usando a microbalança Mettler Toledo UMX2. A espessura foi calculada a partir dos pesos da amostra antes e depois da pulverização catódica usando a densidade aparente do ouro. Dez amostras de cada tipo de modificação foram usadas para a medição. O erro da medição gravimétrica ficou abaixo de 15%.

Ângulo de contato

A molhabilidade das amostras foi determinada pela medição de seus ângulos de contato com a água de superfície (WCA). Além disso, a caracterização das alterações estruturais e composicionais causadas pelo tratamento de plasma e deposição de ouro foi determinada pelo Sistema de Análise de Forma de Gota DSA 100 (KRÜSS GmbH, DE) em temperatura ambiente (24 ° C, umidade de 40-60%) [23]. Gotas de água de 2,0 ± 0,2 μL foram depositadas nas amostras testadas usando uma agulha de aço inoxidável. Imagens das gotas foram tiradas após um atraso de 2 s. Em seguida, os ângulos de contato foram avaliados com o Sistema ADVANCE. Foram realizadas pelo menos sete medições de posições diferentes em pelo menos três réplicas de cada amostra e calculada a média para produzir o WCA final e seu desvio padrão. A medição de WCA foi realizada em amostras “envelhecidas” por 14 dias.

Espectroscopia de fotoelétrons de raios-X

A composição química das amostras preparadas foi determinada a partir de espectros de fotoelétrons de raios-X (XPS) medidos (três medições) pelo espectrômetro ESCAProbeP da Omicron Nanotechnology (fornecido pela Omicron Nanotechnology GmbH, DE) com o erro relativo de 10%. A dimensão da área exposta e analisada foi de 2 × 3 mm ² . As condições de medição foram descritas em [18, 21]. O carbono característico (1 s ), oxigênio (1 s ) e ouro (4 f ) picos foram pesquisados. A medição foi realizada em vácuo ultraleve. A avaliação dos espectros adquiridos foi realizada pelo código CasaXPS [24]. As amostras usadas para medição foram “envelhecidas” por 14 dias. Antes da medição, as amostras foram armazenadas em condições laboratoriais padrão.

Potencial Zeta

A análise eletrocinética (potencial eletrocinético, potencial zeta) de todas as amostras foi determinada pelo instrumento SurPASS (Anton Paar). As amostras foram estudadas dentro de uma célula gap ajustável no contato com um eletrólito (0,001 mol L ⁻¹ KCl), bem como em uma solução tamponada (solução salina tamponada com fosfato (PBS)). Para cada medição, um par de filmes de polímero com a mesma camada superior foi fixado em dois suportes de amostra (com uma seção transversal de 20 × 10 mm ² e uma lacuna entre eles de 100 μm). Todas as amostras foram preparadas em duas repetições; todos eles foram medidos três vezes com pH constante de 6,8 com erro experimental de 5%. Para a determinação do potencial zeta, o método da corrente contínua foi usado e a equação de Helmholtz – Smoluchowski foi aplicada para calcular o potencial zeta [25,26,27]. As amostras envelhecidas usadas para medição do potencial zeta foram “envelhecidas” por 14 dias.

Microscopia de força atômica

A morfologia da superfície das amostras foi examinada por microscopia de força atômica (AFM) usando o sistema VEECO CP II (Bruker Corporation, Billerica, MA, EUA). A superfície foi medida em um "modo de toque" usando a sonda dopada com silício P RTESPA-CP com a constante de mola de 20–80 N m ⁻¹ (Bruker Corporation, Billerica, MA, EUA). Por medições repetidas da mesma região (1 × 1 μm ² ), verificamos que a morfologia da superfície não mudou após três varreduras consecutivas. As amostras utilizadas para a medição foram envelhecidas por 14 dias.

Espectroscopia de massa de plasma indutivamente acoplada

Plasma indutivamente acoplado com detector de espectroscopia de massa (ICP-MS) foi usado para determinar a quantidade de íons Au liberados em PBS (pH =7,4). A análise de oligoelementos de lixiviados de Au foi conduzida usando o espectrômetro triplo quadrupolo Agilent 8800 (Agilent Technologies, Japão) conectado a um auto-amostrador. A nebulização da amostra foi realizada usando um dispositivo MicroMist equipado com uma bomba peristáltica. A incerteza da medição (triplicados de cada amostra) foi inferior a 3%. Os lixiviados para ICP-MS foram preparados por incubação estática das amostras em PBS em atmosfera umidificada com 5% de CO ₂ a 37 ° C durante 6, 24 e 72 h. Os lixiviados foram diluídos com água destilada na proporção de 1:8 e analisados.

Cultura de células

De acordo com o padrão internacional EN ISO 10993-5, o teste de citocompatibilidade foi realizado in vitro usando a linha celular L929 de fibroblastos de camundongo (Sigma, EUA). Amostras de PEEK (puras, tratadas com plasma e revestidas com ouro) foram esterilizadas em etanol 70% em frascos de contador de cintilação por 20 min, inseridas em placas de 12 poços (Jet Biofil, Ø 2,14 cm), lavadas por PBS e montadas no poço fundo com cilindros plásticos ocos de poli (metacrilato de metila). As células L929 foram semeadas no topo das amostras na densidade de 30.000 células por poço em 1 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco de alta glicose (DMEM, Sigma, EUA) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS, Invitrogen, EUA) e 2 mM l-glutamina estável (l-alanil-l-glutamina, Sigma, EUA). As células L929 foram mantidas a 37 ° C em atmosfera umidificada com 5% de CO ₂ .

Microscopia de fluorescência

Após o tempo de incubação desejado (6, 24 e 72 h), as células foram fixadas e coradas de forma semelhante ao descrito em [28, 29]. As células L929 foram lavadas com PBS e fixadas com formaldeído a 4% (Thermo Scientific, EUA) em PBS (37 ° C, 20 min). Após a lavagem com PBS, F-actina do citoesqueleto celular foi marcada com faloidina-Atto 565 (Sigma, EUA) em PBS por 20 min. Em seguida, os núcleos das células foram corados com DAPI (dicloridrato de 4 ′, 6-diaminido-2-fenilindol, Sigma, EUA) por 10 min, e as células foram enxaguadas com PBS, cobertas com meio de montagem (Vector Laboratories, EUA), e montado entre uma lâmina de vidro microscópica e uma lamela. Todas as amostras (“envelhecidas” durante 14 dias) foram testadas em triplicado.

Microscopia Eletrônica de Varredura

A morfologia detalhada das células examinadas crescendo em PEEK puro, interface plasma / ouro e um controle (lamela de vidro) foi caracterizada por microscopia eletrônica de varredura (SEM) TESCAN LYRA3 GMU (Tescan, CZ) em um modo de elétron secundário. As células destinadas à análise por MEV foram lavadas com PBS, fixadas por solução de Karnovsky [30, 31] em tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,2), e desidratadas (aumento da porcentagem de etanol seguido de duas etapas finais de incubação de 10 min em hexametildisilazano e secagem em estufa a 40 ° C por 2 h). As amostras desidratadas foram revestidas por uma camada de ouro de 10 nm.

Resultados e discussão

Todas as medições foram realizadas usando amostras “envelhecidas” 14 dias após o tratamento de plasma e pulverização catódica de ouro. É bem conhecido que grupos funcionais formados em uma superfície de polímero tratada com plasma não são estáveis ​​e mudam com o tempo [32]. A superfície do material tende a se recuperar ao seu estado não tratado [33]. Portanto, ocorre a mudança da reorientação dos grupos químicos produzidos pelo tratamento de plasma para a maior parte do material [34, 35].

A ablação de PEEK durante o tratamento com plasma seguido de pulverização catódica com Au foi estudada por gravimetria. A perda de massa de um polímero causada por ablação e o crescimento de massa por pulverização catódica foram consecutivamente convertidos em espessura de polímero. As perdas de massa determinadas após o tratamento com plasma (60 e 240 s, a potência de 8,3 W) são mostradas na Tabela 1. A perda de ablação pronunciada foi aparente com o aumento do tempo de exposição, mas foi apenas duplicada. A perda moderada foi causada provavelmente pelo caráter aromático de PEEK, que resultou em maior resistência à clivagem do que no caso de, por exemplo, cadeias alifáticas de poliolefinas (UHMWPE). Para sputtering de ouro, os períodos de tempo de 30 e 300 s foram determinados como exemplos representativos de camadas descontínuas e contínuas [19, 36]. A diminuição das perdas por ablação resultou em melhor ancoragem de ouro na superfície PEEK, como é óbvio para amostras com revestimento de ouro de 150 e 300 s.

Os valores do ângulo de contato com a água de amostras medidos em dependência do tratamento de plasma e do tempo de pulverização de ouro são mostrados na Tabela 2. Após o tratamento de plasma, o WCA aumentou de 79,5 ± 2,4 ° (PEEK puro não modificado) para 94,0 ± 5,5 ° e para 95,6 ± 2,1 ° (PEEK tratado por plasma por 60 e 240 s, respectivamente). A diferença nos valores de WCA após o tratamento com plasma é insignificante em comparação com os desvios dos valores. O WCA diminui com o revestimento de Au e a superfície se torna mais hidrofílica em comparação com as amostras tratadas com plasma.

A concentração do elemento na superfície do polímero (a profundidade acessível de seis a oito camadas atômicas) foi examinada pelo método XPS; os resultados estão resumidos na Tabela 2. Os dados XPS foram obtidos para PEEK puro, uma amostra tratada com plasma e uma amostra tratada com plasma seguida de revestimento de Au. Pela medição de XPS, pode-se ver que a concentração de oxigênio aumentou com o tratamento prolongado. Isso provavelmente foi causado pela reorientação dos grupos contendo oxigênio no volume do polímero [37,38,39]. Foi comprovado que a orientação dos grupos ocorre imediatamente após o tratamento com plasma; assim, no “processo de envelhecimento” da amostra, ocorrem alterações em sua superfície. Por esse motivo, as amostras foram medidas por 14 dias após o tratamento com plasma, quando o estado de “envelhecimento” de uma amostra se estabilizou [40, 41]. A concentração de oxigênio aumentou com o tratamento prolongado com plasma. A superfície do polímero é interrompida por descarga de plasma mais forte com a criação de sítios radicais na superfície; quanto maior a potência do plasma, mais pronunciada será a modificação do polímero. Esses locais reagem com o oxigênio presente no ar e aumentando a concentração de oxigênio na superfície tratada [42, 43]. Após a pulverização do ouro, a concentração de oxigênio diminui às custas da camada de ouro. A concentração do ouro foi aumentada com menor tempo de pulverização catódica, quando a superfície não foi tão perturbada.

A Figura 1 mostra a morfologia da superfície PEEK obtida por meio de AFM. O tratamento com plasma causou mudanças detectáveis ​​na superfície PEEK para ambos os tempos de exposição (60 e 240 s), mas como esperado, uma exposição mais longa ao plasma resultou em uma superfície mais áspera que causou uma diferença na metalização das amostras. Amostras tratadas por plasma por mais tempo formaram aglomerados de metal mais bem definidos. Este efeito foi especialmente evidente em amostras com camadas de ouro espessas (pulverizadas por 300 s) e também muito finas (pulverizadas por 30 s). Amostras tratadas com plasma por um curto período (60 s) formaram menor número de aglomerados maiores e irregulares. Quanto às camadas pulverizadas apenas por 30 s, os aglomerados de metal foram facilmente reconhecíveis apenas no substrato tratado com plasma por 240 s. Como esperado, o tamanho do cluster e a rugosidade da superfície geralmente aumentam com o tempo prolongado de pulverização catódica do ouro. Este comportamento corresponde bem à medição XPS. Amostras pulverizadas com metal por 30 s já tinham a maior parte de sua superfície coberta por metal e a pulverização adicional causou o crescimento vertical dos aglomerados; portanto, não teve um impacto tão significativo na concentração de ouro e ainda deixou uma superfície de polímero parcialmente descoberta. Além disso, uma diferença na forma dos aglomerados na dependência da duração do tratamento com plasma correspondeu bem aos achados de XPS. Grandes aglomerados irregulares em amostras tratadas com plasma apenas por um curto período (60 s) cobriram uma porção relativamente grande da superfície PEEK; portanto, a concentração de ouro determinada por meio de XPS foi ligeiramente aumentada. As diferenças morfológicas entre materiais primitivos pulverizados com uma camada de metal de espessura diferente podem ser comparadas aos dados obtidos para ácido poli-L-láctico (PLLA) [44] e politetrafluoretileno (PTFE) [45]. O PTFE puro tem uma superfície muito áspera; portanto, não observamos a formação de pequenos aglomerados de metal, mas uma diminuição geral na rugosidade da superfície. Isso é causado por um fenômeno em que um metal pulverizado prefere preencher "vales" na superfície do polímero para permanecer em "picos". Por outro lado, a superfície do PLLA apresenta maior granulação e formação de estruturas semelhantes às estruturas do PEEK, porém com menor regularidade. Esses dados sugerem que a formação de uma estrutura granular regular em polímeros pulverizados é fortemente influenciada pela regularidade da superfície do polímero; portanto, PEEK (polímero com a menor rugosidade de superfície entre PEEK, PLLA e PTFE) permite a formação da maioria dos aglomerados de metal regulares na superfície.

Imagens de AFM de PEEK puro, PEEK tratado por plasma (pl) por 60 e 240 s, e ouro (Au) pulverizado por 30, 150 e 300 s

A análise eletrocinética mostrou mudanças na química da superfície PEEK e carga após etapas individuais de modificação da superfície. Na primeira etapa, o tratamento com plasma levou à criação de novos grupos polares na superfície PEEK que resultou em um aumento no potencial zeta [19, 25,26,27]. Na segunda modificação, a deposição de aglomerados de ouro na superfície da amostra também teve um impacto na química da superfície e no potencial zeta (Fig. 2). Devido à presença de um metal na superfície do polímero, o efeito de uma mudança de carga superficial desempenha um papel importante - acúmulo de elétrons [27, 46]. Também observamos diferentes potenciais zeta para amostras frescas e “envelhecidas”. Mudanças mais dramáticas foram detectadas para o potencial zeta medido em PBS, que foi dado por íons de diferentes concentrações. Enquanto em solução de KCl, a concentração de KCl é 0,001 mol L ⁻¹ ; no PBS, a concentração de íons é três ordens maior. Uma concentração mais alta de íons em PBS causa a compressão de uma camada dupla elétrica e resulta em potencial zeta diminuído (em valor absoluto) [27, 46]. Portanto, a concentração muito maior de íons causou uma mudança na carga superficial, mesmo de valores negativos para positivos. Assim, as alterações do potencial zeta PEEK determinado na solução de PBS foram mais dramáticas e as alterações na química da superfície e carga foram mais pronunciadas. Portanto, está claro que o tratamento com plasma e a subsequente deposição de Au levam a mudanças dramáticas na química da superfície do polímero e na carga que dependem da duração do tratamento com plasma, bem como da deposição de Au. Esses resultados confirmaram outras análises realizadas.

Potencial zeta de PEEK tratado com plasma (60 e 240 s) e pulverizado com Au (30, 150 e 300 s; corrente 40 mA) amostras de PEEK em solução de KCl 1 mM ( colunas verdes —Mostras novas; colunas marrons - amostras envelhecidas) e em solução PBS ( colunas cinza )

Para determinar a concentração de ouro liberado em um meio de cultivo durante o cultivo de células, usamos um sistema aquoso simples de PBS para simular essas condições. Ouro liberado em PBS após 6 (tempo de adesão celular) e 72 h (proliferação celular) de incubação estática foi medido por ICP-MS, e os resultados estão resumidos na Tabela 3. PBS tem o mesmo pH e osmolaridade que o meio de cultura de células; portanto, foi usado para a medição de ICP-MS. Por um lado, o PBS é um sistema simplificado; por outro, não há componentes que possam interferir na medição de ICP-MS, como no caso de um meio de cultura celular completo. Descobrimos que a concentração de Au liberado no PBS foi maior para amostras PEEK revestidas com Au por 30 s do que por 300 s. Isso pode ser causado por um caráter descontínuo da camada de ouro, possivelmente formando pequenos aglomerados de ouro que são dissolvidos mais rapidamente [47]. O ouro foi liberado em maior extensão da amostra PEEK / 60/300 do que do PEEK / 240/300, uma vez que sua superfície foi menos ablacionada e o ouro aparentemente menos ancorado.

Na próxima etapa, foi examinado se a modificação da superfície dos polímeros pode promover a adesão das células endoteliais. A superfície PEEK foi ativada por tratamento de plasma e pulverização catódica de ouro. A citocompatibilidade de PEEK foi determinada com base nos resultados de adesão celular (6 h) e proliferação (24 e 72 h), conforme mostrado na Fig. 3. Cada duas colunas (PEEK / plasma (ab) e PEEK / (ab) / Au (cde)) representam duas metades de uma amostra. As diferenças no número de células L929 crescendo em PEEK puro e poliestireno de cultura de tecido de controle (TCPS) estão na faixa do erro de medição. A adesão celular foi monitorada 6 h após a semeadura das células na superfície da amostra. É óbvio que o número de células de PEEK puro aumentou quando comparado ao das amostras tratadas. Após 24 h de crescimento celular, observamos apenas um aumento muito leve no número de células, que pode ser causado por uma fase de latência, quando as células se adaptam ao novo ambiente [48]. É aparente que 72 h após a semeadura, havia um número muito pequeno de células crescendo em amostras depositadas por 30 s (60 e 240 s com plasma tratado) quando comparado com outras amostras medidas. Esses valores correspondem aos resultados das medições de ICP-MS, nas quais o ouro foi liberado em PBS na maior extensão. Nesse caso, a camada de Au depositada no PEEK (por 30 s) teve um caráter descontínuo [36]; assim, os aglomerados de Au podem ser liberados no meio de cultura de células. Por esse processo, o meio pode se tornar tóxico para as células cultivadas. O maior número de células crescendo em uma camada de ouro (em comparação com a amostra tratada com plasma) foi observado na amostra PEEK / pl 60 s / 150 s, na qual a camada de ouro era contínua. A seguir, 72 h após a semeadura, o ambiente mais adequado para o crescimento das células L929 foi nas amostras tratadas com plasma por 60 ou 240 s e subsequentemente revestidas com ouro por 300 s. A camada de Au nessas amostras também era contínua [36]. De acordo com os dados do ICP-MS, apenas uma pequena quantidade de Au foi liberada no meio de cultura de células. No entanto, esse ouro liberado foi a causa provável do aumento da proliferação celular na superfície tratada com plasma.

Número de células L929 após 6, 24 e 72 h de cultivo em TCPS, PEEK puro e PEEK com interfaces de ouro de regiões tratadas com plasma (60 e 240 s) e pulverizadas com Au (30, 150 e 300 s)

Para avaliar ainda mais a morfologia celular e as conexões intercelulares com mais detalhes, realizamos microscopia eletrônica de varredura de alta resolução de células L929 crescendo nos substratos testados; os resultados são mostrados na Fig. 4. As varreduras da análise SEM foram realizadas após 72 h de crescimento celular em PEEK puro e PEEK tratado com plasma e revestido com ouro, e uma lamela de vidro, que serviu como um controle (é comumente usada para análise SEM [49], bem como para estudos de imunofluorescência [29]). A partir da Fig. 4, é evidente que as células crescendo em PEEK puro, PEEK tratado por plasma por 60 s (a segunda metade é Au de 300 s) e por 240 s (a segunda metade é Au de 150 e 300 s), e em uma lamela de vidro tinha forma semelhante após 72 h de cultivo. As células foram totalmente espalhadas na superfície tratada com plasma e, acima desta camada de células, é aparente a formação de uma nova camada de células em proliferação. As células apresentavam formato esférico na superfície de PEEK / 60 (segunda metade é 150 s Au) e PEEK / 240/30 s Au, embora o ambiente não fosse adequado para proliferação celular. As células mais arredondadas foram observadas em PEEK / 240/300 s Au, que se correlaciona totalmente com os dados apresentados na Fig. 3.

Imagens de SEM de células L929 cultivadas por 72 h em PEEK puro, PEEK tratado por plasma (60 e 240 s) e suas partes revestidas de ouro pulverizadas por 30 e 300 s (lamínula de vidro microscópica serviu como controle). A barra de escala corresponde a 10 μm

Conclusões

Comparamos duas formas diferentes de modificações PEEK para criar um material com adesão e crescimento celular aprimorados. Os resultados obtidos confirmaram mudanças variáveis ​​nas propriedades da superfície após etapas de modificação individuais. Ambas as formas de modificação empregadas resultaram em mudanças na química da superfície, morfologia, molhabilidade e carga. O tratamento com plasma por 240 s causou perda de peso até duas vezes maior de PEEK do que o tratamento por 60 s. A molhabilidade da superfície PEEK não foi alterada significativamente pelo tratamento de plasma. A medição XPS confirmou o fato geral de que com o aumento do tempo de tratamento com plasma, a concentração de carbono diminuiu na superfície PEEK, ao contrário do que, a concentração de oxigênio aumentou. A espessura de um filme de ouro depositado foi maior após o tratamento com plasma por 60 s. A pulverização catódica de ouro aumentou a molhabilidade da superfície de PEEK. Os resultados da análise XPS mostraram as mesmas tendências para ambas as amostras tratadas com plasma (60 e 240 s), e as concentrações de carbono e oxigênio diminuíram com o aumento do tempo de deposição em favor da concentração crescente de ouro. As imagens AFM também confirmaram as medições de XPS, especialmente para amostras tratadas com plasma por 60 s e revestidas com ouro por 300 s, nas quais grandes aglomerados irregulares cobriram uma porção relativamente grande da superfície PEEK; portanto, a concentração de ouro foi ligeiramente aumentada. Verificou-se também que amostras com uma camada fina e também mais espessa de ouro não são adequadas para propagação celular.

Esta pesquisa mostra que o tratamento com plasma melhora a citocompatibilidade de PEEK em comparação com o puro. Além disso, o tratamento com plasma é um método melhor para a modificação do polímero para o crescimento celular do que a pulverização catódica de ouro, quando o ouro é liberado no meio de cultura celular.

Abreviações

AFM:

Força atômica microscópica

CO ₂ :

Dióxido de carbono

DAPI:

4 ′, 6-diaminido-2-fenilindol dicloridrato

DMEM:

Meio Eagle modificado por Dulbecco

FBS:

Soro fetal bovino

ICP-MS:

Inductively coupled plasma mass spectrometry

KCl:

Potassium chloride

L929:

Mouse embryonic fibroblasts

PBS:

Phosphate-buffered saline

PEEK:

Polyetheretherketone

PGA:

Polyglycolide

PHB:

Polyhydroxybutyrate

PLA:

Poly(l-lactide)

PMMA:

Polymethylmethacrylate

PTFE:

Polytetrafluorethylene

SEM:

Scanning electron microscopy

TCPS:

Tissue culture polystyrene

UHMWPE:

Ultra-high-molecular-weight polyethylene

WCA:

Water contact angle

XPS:

X-ray photoelectron spectroscopy

Características ópticas e elétricas de nanofios de silício preparados por corrosão eletrolítica Peculiaridades estruturais de compósitos poliméricos orgânicos-inorgânicos condutores de íons baseados em resina epóxi alifática e sal de perclorato de lítio