MicroRNA mediada por HDAC1-124-5p regula NPY para afetar habilidades de aprendizagem e memória em ratos com depressão

Resumo

Pesquisas com base nas histonas desacetilases (HDACs) na depressão foram excessivamente conduzidas, mas não muito em HDAC1. Nesse sentido, o presente estudo é lançado para divulgar o mecanismo do eixo HDAC1 / microRNA (miR) -124-5p / neuropeptídeo Y (NPY) na depressão. Ratos Sprague Dawley foram estimulados por estresse crônico imprevisível leve para estabelecer modelos de depressão. Ratos deprimidos foram injetados com HDAC1 inibido ou miR-124-5p suprimido para explorar seus papéis no peso corporal, habilidades de aprendizagem e memória, estresse oxidativo e inflamação no soro e expressão de neurotransmissores nos tecidos do hipocampo. A expressão de MiR-124-5p, HDAC1 e NPY no hipocampo foi testada. As interações da expressão de miR-124-5p, HDAC1 e NPY também foram confirmadas. Maiores miR-124-5p e HDAC1 e menores níveis de expressão de NPY foram encontrados no hipocampo de ratos deprimidos. MiR-124-5p inibido ou HDAC1 suprimido habilidades de aprendizagem e memória atenuadas e aumento do peso corporal de ratos deprimidos. O knockdown de miR-124-5p ou a inibição de HDAC1 suprimiu o estresse oxidativo e a inflamação e promoveu a expressão de neurotransmissores em ratos deprimidos. O HDAC1 mediou o miR-124-5p para regular o NPY. O knockdown de NPY aboliu os efeitos protetores do miR-124-5p inibido em ratos deprimidos. Nosso estudo ilustra que a supressão de miR-124-5p ou HDAC1 regula o NPY para melhorar a memória e as habilidades de aprendizagem em ratos deprimidos, o que pode atualizar o conhecimento existente sobre a depressão e fornecer uma nova referência para o tratamento da depressão.

Introdução

A depressão se refere a uma psicose incapacitante grave que causa graves encargos econômicos e consequências sociais em todo o mundo [1]. A depressão é caracterizada por mudanças fisiológicas, cognitivas e comportamentais que ameaçam a saúde geral dos pacientes [2]. Os tratamentos acessíveis à depressão se desenvolveram com a aplicação da cetamina como antidepressivo de ação rápida e o refinamento de equipamentos capazes de atender seletivamente a atividade de populações de subtipos neuronais [3]. Além disso, nanoarquiteturas versáteis, como pontos de carbono, são aplicáveis ​​para distúrbios neurológicos [4]. No entanto, o tratamento inadequado para a depressão pode resultar em mau desempenho, disfunções de comportamento, doenças físicas, abuso de substâncias e até suicídio [5]. Portanto, há uma necessidade desesperada de descobrir agentes inovadores no tratamento da depressão.

Foi documentado anteriormente que o nível de microRNA (miR) -124 aumenta no plasma com depressão e antidepressivos [6]. Durante a depressão induzida por estresse leve imprevisível crônico (CUMS), a expressão de miR-124 no hipocampo mostra variações dinâmicas, indicando várias mudanças patológicas em diferentes estágios de depressão [7]. Além disso, miR-124 é o candidato a melhorar comportamentos semelhantes aos da depressão no transtorno depressivo maior [8]. Além disso, a supressão do miR-124 serve como um antidepressivo no córtex pré-frontal, conforme refletido por comportamentos semelhantes à depressão atenuada em camundongos [9]. A histona desacetilase 1 (HDAC1) é um mediador do miR-124 [10] que forma um complexo multiproteico para regulação da transcrição e modificação epigenética [11]. Até onde sabemos, um comprometimento da atividade de HDAC1 promove resiliência no transtorno depressivo maior [12]. Além disso, a supressão de HDAC1 no cérebro pode melhorar os transtornos de humor e outras doenças cerebrais alteradas neuroplasticamente [13]. Os inibidores de HDAC podem atenuar comportamentos semelhantes aos de ansiedade e consumo de álcool, e podem elevar a expressão do neuropeptídeo Y (NPY) [14]. Além disso, o comprometimento da atividade de HDAC pode levar a um aumento na expressão de NPY no núcleo central da amígdala e no núcleo medial da amígdala [15]. NPY é um neuropeptídeo orexígeno hipotalâmico que é suficiente para prevenir ansiedade, distúrbios sociais e sintomas depressivos [16]. Além disso, foi demonstrado que o NPY e seus receptores impõem efeitos antiinflamatórios e antidepressivos em modelos de ratos com depressão induzida por lipopolissacarídeos [17]. Tomados em conjunto, a interação combinada do eixo HDAC1 / miR-124-5p / NPY na depressão é ambígua. Assim, este estudo pretende desvelar o mecanismo desse eixo para investigar um candidato curativo à terapia da depressão.

Materiais e métodos

Declaração de Ética

Os experimentos com animais envolvidos neste estudo obedeceram aos requisitos de ética em animais experimentais do The First Affiliated Hospital da Harbin Medical University. Os experimentos foram otimizados para melhorar as condições de alimentação dos animais experimentais, reduzir o número de animais usados ​​e aliviar o sofrimento animal.

Animais Experimentais

Ratos machos Sprague-Dawley (SD) de grau isento de patógenos específicos (SPF), pesando 200–220 g, foram fornecidos pelo Animal Research Center, First Affiliated Hospital da Harbin Medical University (Harbin, China). Os ratos foram mantidos em um ambiente de grau FPS (22–24 ° C, 60–64% de umidade, ciclos de luz e escuridão de 12 horas). Exceto pelo período durante a modelagem e outros momentos específicos, os ratos estavam livres para obter água e comida.

Agrupamento de ratos e estabelecimento modelo

Os ratos modelados foram divididos aleatoriamente em 8 grupos ( n =10):grupo normal (ratos sem qualquer tratamento), grupo CUMS (ratos com depressão induzida por CUMS), grupo controle sh-negativo (NC) (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com sh-HDAC1 lentivírus NC), grupo sh-HDAC1 (Ratos com depressão induzida por CUMS injetados com lentivírus sh-HDAC1), grupo anti-miR-NC (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com anti-miR-124-5p lentivírus NC), grupo anti-miR-124-5p (CUMS- ratos com depressão induzida injetados com anti-miR-124-5p lentivírus), grupo anti-miR-124-5p + sh-NC (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com anti-miR-124-5p lentivírus e sh-NPY lentivírus NC) e grupo anti-miR-124-5p + sh-NPY (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com lentivírus anti-miR-124-5p e lentivírus sh-NPY).

Modelos de ratos com depressão induzida por CUMS foram estabelecidos pelo método de Willner [18]. Os ratos do grupo normal foram alimentados com comida e água sem qualquer estímulo, enquanto os ratos dos outros 7 grupos receberam CUMS por 35 dias em gaiolas independentes. Esses ratos foram estimulados por natação gelada a 4 ° C por 5 min em um recipiente (30 cm de profundidade da água), inversão diurna e noturna (ratos permaneceram no escuro por 12 h durante o dia e em um espaço claro iluminado por lâmpadas incandescentes por 12 h durante a noite), fixação da cauda por um grampo de cauda de andorinha por 30 s, agitação de 1 min, jejum de 24 h e privação de água, estimulação ultrassônica de 30 min (50 Hz), enchimento úmido e ar condicionado a 17 ℃. Os ratos foram estimulados aleatoriamente por um desses estímulos diariamente, e o mesmo estímulo foi aplicado não mais do que 5 vezes no total.

Os ratos foram anestesiados com 2% de pentobarbital sódico (50 mg / kg) e o hipocampo bilateral (diâmetro ântero-posterior =4,8 mm, distância médio-lateral =± 2,5 mm, distância entre a cavidade posterior e fontanela anterior =- 3,5 mm) foram injetados com lentivírus a 1 μL / min por uma micro-seringa Hamilton com uma agulha 26-G. A agulha foi mantida no local da injeção por 5 min para evitar refluxo. Os crânios foram selados com cera de osso e as incisões suturadas, e os ratos foram recuperados por 7 dias [19]. lentivírus sh-HDAC1 e seu NC, lentivírus anti-miR-124-5p e seu NC, bem como sh-NPY e seu NC (título:10 ⁸ TU / mL) foram adquiridos da GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Testes de função comportamental

Os ratos foram pesados ​​no dia anterior à modelagem CUMS (no dia 0), após a modelagem CUMS (no 36º dia) e após a interferência do lentivírus (no 52º dia).

O teste de campo aberto (OFT) pode detectar o comportamento autonômico e exploratório de ratos em um novo ambiente, comumente usado para avaliar comportamentos depressivos. Este teste foi realizado em uma caixa de campo aberto de madeira preta (100 cm × 100 cm × 50 cm) com um sistema de rastreamento de vídeo colocado acima da caixa de campo aberto para registrar as atividades dos ratos. O fundo da caixa aberta foi dividido em 25 grades (20 cm × 20 cm) com linhas brancas. Os ratos foram colocados na grade central em uma ordem aleatória predefinida e a quantidade de cruzamento da grade (ratos entrando em uma grade com membros ou membros anteriores duplos com um membro posterior) e a incidência de empinamento (ratos levantando membros anteriores e em pé com um membro posterior) foram registrados pelo sistema de rastreamento de vídeo. Este teste foi realizado em um ambiente interno silencioso e escuro. Após cada teste, a caixa de campo aberta foi limpa com álcool 75% para remoção de odores.

A anedonia era um dos sintomas cruciais da depressão. O teste de preferência de sacarose (SPT) pode avaliar o comportamento do tipo depressivo em ratos. Antes do SPT, cada rato recebeu 2 garrafas de água com açúcar (1% de sacarose, p / p) por 24 horas, e 1 garrafa de água esterilizada e 1 garrafa de água com açúcar por mais 24 horas. Depois disso, a porcentagem de preferência de sacarose (PPS) dos ratos foi detectada da seguinte forma:após jejum de 23 horas e privação de água, os ratos foram autorizados a receber 1 garrafa de água estéril e 1 garrafa de água com açúcar (1% de sacarose) por 30 min. Após 1 h, a localização das duas garrafas foi invertida e os ratos ficaram livres para essas duas garrafas por mais 30 min. Durante essa 1 h, o consumo (mL) dessas duas garrafas de água estéril e água com açúcar (1% de sacarose) foi medido e o SPP foi calculado. SPP =consumo de água com açúcar / (consumo de água com açúcar + consumo de água estéril) × 100%.

O teste do labirinto aquático de Morris (MWM) foi amplamente aplicado para avaliar o aprendizado espacial e as habilidades de memória de ratos. O teste MWM foi realizado em uma caixa d'água circular (150 cm de diâmetro e 60 cm de altura) com lâmina d'água de 40 cm. A temperatura da água foi mantida a 22 ± 1 ° C e a água foi tingida em preto com corante não tóxico e fácil de limpar. O tanque e a superfície da água foram divididos em 4 quadrantes (quadrantes SE, SW, NW e NE) com cada quadrante decorado com seu ícone correspondente com cor brilhante e forma especial na parede interna. A plataforma alvo era uma plataforma circular transparente (11 cm de diâmetro), localizada no centro do quadrante NE e imersa 1,5 cm abaixo da superfície da água. Um sistema de rastreamento de vídeo foi instalado acima do centro do tanque para registrar a velocidade de natação, o caminho e o tempo gasto com os ratos entrando na plataforma-alvo e nadando nos quadrantes. Os ratos foram colocados na água de 4 quadrantes em uma ordem aleatória e eles foram autorizados a explorar e embarcar na plataforma alvo dentro de 60 s. O tempo gasto pelos ratos para embarcar na plataforma foi registrado como a latência de escape. Se os ratos não conseguissem embarcar na plataforma alvo em 60 s, eles eram guiados e a latência de escape registrada como 60 s. Após cada teste, os ratos foram autorizados a permanecer na plataforma alvo por 15 segundos e os ratos foram treinados 4 vezes ao dia durante 5 dias. A latência de escape final foi a média da latência de escape nos dias 3 e 5. No 6º dia do teste MWM, foi realizado o teste de exploração espacial. A plataforma alvo foi removida do tanque de água e os ratos entraram na água pelo quadrante SW. O tempo dos ratos nadando no quadrante NE dentro de 60 s foi registrado como o tempo de exploração do espaço.

A linha do tempo deste experimento é mostrada na Fig. 1.

Cronologia do presente estudo

Coleta de espécimes

Um dia após o último teste de MWM, os ratos foram sacrificados e injetados intraperitonealmente com pentobarbital sódico a 2% (50 mg / kg). A cavidade torácica foi aberta para obtenção do sangue do coração com uma seringa, a qual foi centrifugada 3 vezes a 3500 r / min por 15 min, e o sobrenadante armazenado a -20 ° C. Após a coleta de sangue, um cateter foi inserido do ventrículo esquerdo até a aorta e 500 mL de solução salina normal foram perfundidos para lavagem de todo o sangue. Os tecidos do hipocampo foram separados e colocados em tubos de centrífuga de 1,5 mL, pesados ​​e armazenados a -80 ° C. Uma parte do hipocampo foi fixada com paraformaldeído 4% por 2 h, desidratada com gradiente de sacarose e incluída em parafina.

Detecção de índice inflamatório e relacionado ao estresse oxidativo

O soro foi reaquecido para detecção de superóxido dismutase (SOD), malondialchehyche (MDA), glutationa (GSH), interleucina (IL) -β, fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e concentração de óxido nítrico (NO). Kits para detecção de SOD, MDA e GSH foram fornecidos pelo Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China), enquanto kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de IL-β, TNF-α e NO pelo NanJing JianCheng Bioengineering Institute ( Nanjing, China).

Coloração por Hematoxilina-Eosina (HE)

Os cortes de parafina foram desparafinados, hidratados com etanol, enxaguados com água destilada e corados com solução de coloração com hematoxilina por 20 min. Depois disso, as seções foram enxaguadas com água da torneira até que ficassem azuis. Em seguida, os cortes foram colocados em solução de ácido clorídrico etanólico a 1% por 10 s, enxaguados com água da torneira e desidratados com etanol, seguida de coloração em eosina por 2 min, desidratação com álcool de alta concentração e permeabilização em xileno. Por fim, as seções foram lacradas e observadas ao microscópio biológico.

Detecção de expressão de neurotransmissor

Os tecidos do hipocampo foram pesados ​​e homogeneizados por ultrassom em solução salina normal (100 μL / 10 mg). O homogenato foi mantido a 4 ° C por 30 min, centrifugado a 12.000 rpm (4 ° C) por 3 min para coletar o sobrenadante. A concentração de proteína do sobrenadante foi detectada pelo kit de detecção de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (CWBIO, Pequim, China) e os níveis de expressão de norepinefrina (NE), serotonina (5-HT) e dopamina (DA) por kits de ELISA. Os kits NE, 5-HT e DA ELISA foram fornecidos pela Liweiping Biotechnology Co., Ltd. (Pequim, China).

Reação em cadeia da polimerase quantitativa da transcrição reversa (RT-qPCR)

O RNA foi extraído dos tecidos do hipocampo pelo kit de extração de RNA (Promega, Madison, WI, EUA), e a concentração e pureza do RNA foram detectadas por espectrofotômetro ultravioleta. Seguido pelas instruções do kit de transcrição reversa (DRR047S, Takara, Dalian, China), a transcrição reversa de RNA em DNA complementar (cDNA) foi realizada. O mRNA foi transcrito reversamente em cDNA pelo kit GoldScript de uma etapa RT-PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA), enquanto o miRNA pelo kit de detecção quantitativa de miRNA Hairpin-it ™ (GenePharma). O kit de detecção RT-qPCR (Promega) foi aplicado para detectar a expressão de HDAC1, miR-124-5p e NPY em tecidos. U6 foi indicado como um controle interno para miR-124-5p enquanto β-actina para HDAC1 e NPY. Os iniciadores de PCR foram obtidos de Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) (Tabela 1). A expressão relativa dos genes alvo foi calculada por 2 ^{- △△} Método Ct.

Análise de Western Blot

Os tecidos do hipocampo foram cortados em pedaços em gelo e lisados ​​por lisado de ensaio de radioimunoprecipitação (Beijing Solarbio Science &Technology Co. Ltd., Pequim, China) para extrair proteínas. A concentração de proteína foi determinada pelo método BCA. Proteína total (50 μg) foi adicionada com 5 × tampão de carregamento de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 1:4 e aquecida em banho-maria por 5 min. Em seguida, a proteína foi submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio, eletrotransferida em uma membrana e bloqueada com 5% de leite por 1 h. Depois disso, a proteína foi testada com os anticorpos primários contra HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA), NPY (1:800, NeoMakers, Fremont, Califórnia, EUA) e β-actina (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, UK) durante a noite, e novamente examinado com anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano. A membrana foi desenvolvida por quimiluminescência aprimorada e a densidade óptica foi calculada pelo software de análise de cinza Quantity One. A expressão da proteína do gene alvo foi expressa como a razão entre o valor de cinza e o valor de cinza da β-actina.

Ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

O ensaio ChIP foi realizado em conformidade com as instruções do kit EZ-ChIP (Millipore, Bedford, MA, EUA). As células HEK293T foram incubadas com formaldeído a 1% durante 10 min e terminadas com glicina. Em seguida, as células foram centrifugadas a 2.000 rpm por 5 min e adicionadas com SDS Lysis Buffer para ultrassonicação. Centrifugadas a 10.000 g a 4 ℃ por 10 min, as células (100 μL) reagiram com 900 μL de tampão de diluição ChIP, 20 μL de 50 × PIC e 60 μL de proteína A agarose / DNA de esperma de salmão a 4 ℃ por 1 h, e foram permitido repousar por 10 min. Os precipitados foram centrifugados a 700 rpm por 1 min com 20 μL como entrada. Um tubo foi adicionado com anticorpo HDAC1 (1 μL) e anticorpo imunoglobulina G e o outro tubo foi adicionado sem anticorpo. As amostras nos dois tubos foram incubadas durante a noite, eluídas e reticuladas. Após a recuperação do DNA, a amostra foi testada por RT-qPCR.

Ensaio do gene Dual Luciferase Reporter

O site de bioinformática (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) analisou os sítios de ligação de miR-124-5p e NPY. Os plasmídeos NPY de tipo selvagem (WT) e NPY-mutante (MUT) foram gerados por Huayueyang Biotechnology Co., Ltd. (Pequim, China). Combinado com NC mímico ou mímico miR-124-5p, os plasmídeos foram transfectados em células HEK293T. A atividade da luciferase celular foi determinada pelo kit de detecção de luciferase (BioVision) e luminômetro Glomax20 / 20 (Promega).

Análise estatística

O software estatístico SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EUA) foi utilizado para a análise dos dados. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. As comparações entre dois grupos foram testadas por t teste. As comparações entre vários grupos foram avaliadas por análise de variância unilateral (ANOVA), após o qual comparações de pares pelo teste post hoc de Tukey. P representou testes bilaterais e P <0,05 foi considerado de significância estatística.

Resultados

A inibição de HDAC1 ou miR-124-5p aumenta o peso de ratos deprimidos

Os ratos foram pesados ​​1 dia antes da modelagem CUMS (dia 0), 1 dia após a interrupção da modelagem (dia 36) e 7 dias após a interferência do lentivírus (dia 52). Nenhuma diferença foi detectada no peso corporal dos ratos em cada grupo antes da modelagem (todos P > 0,05). Após a modelagem, o peso do rato diminuiu no grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC e grupo anti-miR-124-5p versus o grupo normal (todos P <0,05). Nenhuma discrepância foi observada quanto ao peso do rato no grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC e grupo anti-miR-124-5p (todos P > 0,05). Após a interferência, o peso do rato diminuiu no grupo CUMS versus o grupo normal (todos P <0,05). Nenhuma discrepância foi observada quanto ao peso do rato no grupo CUMS, grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC (todos P > 0,05). O peso do rato aumentou no grupo sh-HDAC1 e no grupo anti-miR-124-5p em relação aos seus grupos NC (ambos P <0,05), indicando que a inibição de HDAC1 ou miR-124-5p aumentou o peso de ratos deprimidos (Fig. 2a).

A inibição de HDAC1 ou miR-124-5p aumenta o peso e melhora as habilidades de aprendizado e memória de ratos deprimidos. a Efeitos da inibição com HDAC1 ou miR-124-5p no peso corporal de ratos deprimidos; b SPP antes e depois da inibição com HDAC1 ou miR-124-5p; c Freqüência de cruzamento da cintura em OFT antes e depois da inibição com HDAC1 ou miR-124-5p; d Incidência de criação em OFT antes e depois da inibição com HDAC1 ou miR-124-5p; e Latência de escape no teste MWM antes e depois da inibição com HDAC1 ou miR-124-5p; f Tempo de exploração espacial no teste MWM antes e depois da inibição com HDAC1 ou miR-124-5p; n =10; a P <0,05 em comparação com o grupo normal; b P <0,05 em comparação com o grupo sh-NC; c P <0,05 em comparação com o grupo anti-miR-NC. As comparações entre vários grupos foram avaliadas por ANOVA de uma via e as comparações de pares pelo teste post hoc de Tukey

A inibição de HDAC1 ou miR-124-5p melhora as habilidades de aprendizagem e memória em ratos deprimidos

Os testes SPT, OFT e MWM foram aplicados para detectar SPP, frequência de cruzamento da grade e incidência de criação, bem como latência de escape e tempo de exploração espacial. Foi delineado que (Fig. 2b-f) antes da interferência, em comparação com o grupo normal, SPP, frequência de cruzamento da grade, incidência de criação e tempo de exploração do espaço reduzido, enquanto a latência de escape prolongada no grupo CUMS, sh-NC grupo, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC e grupo anti-miR-124-5p (todos P <0,05), sugerindo o desenvolvimento de comportamentos semelhantes à depressão em ratos. Não houve discrepância no SPP, frequência de cruzamento da grade, incidência de criação, tempo de exploração espacial e latência de escape entre o grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC e anti-miR-124 Grupo -5p (todos P > 0,05). Após a interferência, versus o grupo sh-NC e o grupo anti-miR-NC, SPP, a frequência de cruzamento da grade, a incidência de criação e o tempo de exploração espacial aumentaram, enquanto a latência de escape diminuiu no grupo sh-HDAC1 e anti-miR-124- Grupo 5p (todos P <0,05). Nenhuma diferença foi observada no SPP, frequência de cruzamento da grade, incidência de criação, tempo de exploração do espaço e latência de escape entre o grupo CUMS, grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC (todos P > 0,05), sugerindo que o silenciamento de HDAC1 ou supressão de miR-124-5p poderia atenuar comportamentos semelhantes à depressão e melhorar as habilidades de aprendizagem e memória em ratos.

A inibição de HDAC1 ou miR-124-5p atenua os danos neuronais patológicos em ratos deprimidos

A observação de lesões hipocampais por coloração HE (Fig. 3a) revelou que os neurônios bem organizados no hipocampo de ratos no grupo normal apresentavam morfologia clara, estrutura normal, camadas densas, núcleos celulares claros e nucléolos óbvios. Os neurônios de ratos no grupo CUMS foram encolhidos, diminuídos em número e mal arranjados com cromatina distribuída de forma desigual e camada fina. Os ratos nos grupos sh-NC e anti-miR-NC apresentaram a mesma situação que o grupo CUMS. Os ratos nos grupos sh-HDAC1 e anti-miR-124-5p exibiram neurônios aumentados em ordem e danos atenuados em comparação com seus grupos NC. Foi indicado que o knockdown de HDAC1 ou a inibição de miR-124-5p aliviou as lesões do hipocampo em ratos deprimidos.

A inibição de HDAC1 ou miR-124-5p atenua os danos patológicos do hipocampo e regula para cima a expressão de neurotransmissores em ratos deprimidos. a Coloração HE de lesões hipocampais de ratos deprimidos; b ELISA de expressão de NE em tecidos do hipocampo; c ELISA de expressão de 5-HT em tecidos do hipocampo; d ELISA de expressão de DA em tecidos do hipocampo; n =6; a P <0,05 em comparação com o grupo normal; b P <0,05 em comparação com o grupo sh-NC; c P <0,05 em comparação com o grupo anti-miR-NC. As comparações entre vários grupos foram avaliadas por ANOVA de uma via e as comparações de pares pelo teste post hoc de Tukey

Inibição de HDAC1 ou miR-124-5p regula para cima a expressão do neurotransmissor em ratos deprimidos

A depressão foi relacionada a distúrbios de neurotransmissores cerebrais. Portanto, os níveis de neurotransmissores DA, NE e 5-HT no hipocampo de rato foram medidos por ELISA. Os resultados indicaram que (Fig. 3b-d) com o grupo normal por contraste, níveis reduzidos de DA, NE e 5-HT foram encontrados em ratos do grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, anti-miR Grupo -NC e grupo anti-miR-124-5p (todos P <0,05). Nenhuma diferença foi testemunhada na expressão do neurotransmissor no grupo CUMS, grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC (todos P > 0,05). Em relação aos grupos sh-NC e anti-miR-NC, os níveis de DA, NE e 5-HT aumentaram em ratos dos grupos sh-HDAC1 e anti-miR-124-5p (todos P <0,05), implicando que a regulação para baixo de HDAC1 ou redução de miR-124-5p poderia regular para cima os níveis de DA, NE e 5-HT no hipocampo de ratos deprimidos.

A inibição de HDAC1 ou miR-124-5p suprime o estresse oxidativo e a inflamação em ratos deprimidos

A expressão do fator inflamatório e relacionado ao estresse oxidativo no soro foi medida. Com relação ao grupo normal, as atividades de SOD e GSH foram prejudicadas, enquanto os níveis de MDA, IL-1β, TNF-α e NO aumentaram nos outros grupos de modelo de depressão (todos P <0,05). As atividades de SOD e GSH e os níveis de MDA, IL-1β, TNF-α e NO entre o grupo CUMS, grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC não mostraram diferença (todos P > 0,05). Em relação ao grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC, observou-se aumento nas atividades de SOD e GSH e diminuição nos níveis de MDA, IL-1β, TNF-α e NO no sh- Grupo HDAC1 e grupo anti-miR-124-5p (todos P <0,05) (Fig. 4a-f), indicando que a depleção de HDAC1 ou a regulação negativa de miR-124-5p poderia aliviar o estresse oxidativo e a inflamação em ratos deprimidos.

A inibição de HDAC1 ou miR-124-5p suprime o estresse oxidativo e a inflamação em ratos deprimidos. a - c Efeito da inibição de HDAC1 ou miR-124-5p na concentração de SOD, MDA e GSH no soro de ratos deprimidos; d - f Efeito da inibição de HDAC1 ou miR-124-5p na concentração de IL-1β, TNF-α e NO no soro de ratos deprimidos; n =10; a P <0,05 em comparação com o grupo normal; b P <0,05 em comparação com o grupo sh-NC; c P <0,05 em comparação com o grupo anti-miR-NC. As comparações entre vários grupos foram avaliadas por ANOVA de uma via e as comparações de pares pelo teste post hoc de Tukey

HDAC1 medeia miR-124-5p para regular NPY

RT-qPCR e análise de western blot foram adotados para detecção de HDAC1, miR-124-5p e NPY no hipocampo. Foi delineado que (Fig. 5a, b) versus o grupo normal, HDAC1 e miR-124-5p aumentaram e NPY diminuíram no grupo CUMS (todos P <0,05). As expressões HDAC1, miR-124-5p e NPY não mostraram variações no grupo CUMS e no grupo sh-NC (todos P > 0,05). Em relação ao grupo sh-NC, o grupo sh-HDAC1 foi refletido pela diminuição de HDAC1 e miR-124-5p e níveis elevados de expressão de NPY (todos P <0,05). As descobertas acima sugeriram a interferência do lentivírus bem-sucedida e a relação positiva entre a expressão de miR-124-5p e HDAC1.

HDAC1 medeia miR-124-5p para regular NPY. a Expressão de HDAC1, miR-124-5p e NPY mRNA em tecidos do hipocampo após inibição de HDAC1 por RT-qPCR ( n =6); b Expressão da proteína HDAC1 e NPY em tecidos do hipocampo após a inibição de HDAC1 por análise de western blot ( n =6); c MiR-124-5p e expressão de mRNA de NPY em tecidos do hipocampo após a inibição de miR-124-5p por RT-qPCR ( n =6); d Expressão da proteína NPY em tecidos do hipocampo após a inibição de miR-124-5p por análise de western blot ( n =6); a P <0,05 em comparação com o grupo normal; c P <0,05 em comparação com o grupo sh-NC. As comparações entre vários grupos foram avaliadas por ANOVA de uma via e as comparações de pares pelo teste post hoc de Tukey

Além disso, a expressão de miR-124-5p e NPY após a supressão de miR-124-5p foram detectados com os resultados (Fig. 5c, d) demonstrando que em relação ao grupo normal, miR-124-5p elevado e NPY reduzido foram apresentados em o grupo CUMS (ambos P <0,05). Pelo contrário, o grupo anti-miR-124-5p tendeu a diminuir miR-124-5p e NPY elevado em relação ao grupo anti-miR-NC (ambos P <0,05). Nenhuma discrepância foi reconhecida na expressão de miR-124-5p e NPY no grupo CUMS e no grupo anti-miR-NC (ambos P > 0,05). Os resultados foram indicativos do sucesso da interferência do lentivírus e da conexão negativa entre NPY e miR-124-5p.

O ensaio ChIP foi para testar se HDAC1 poderia se ligar ao promotor miR-124-5p, e os resultados descritos que (Fig. 6a, b) HDAD1 estava apenas relacionado ao promotor miR-124-5p ( P <0,001), indicando que HDAC1 poderia regular diretamente miR-124-5p.

HDAC1 se liga ao promotor de miR-124-5p. a Abundância de ligação da região do promotor HDAC1 e miR-124-5p em células HEK293T por ensaio ChIP ( n =3); b Abundância de ligação de HDAC1 e regiões intergênicas não relacionadas em células HEK293T por ensaio ChIP ( n =3); c MiR-124-5p e site de ligação de NPY por site de software de informação biológica; d Relação de direcionamento entre miR-124-5p e NPY por ensaio de gene repórter de luciferase dupla ( n =3); As comparações entre dois grupos foram testadas por t teste

A relação de direcionamento entre miR-124-5p e NPY foi prevista e verificada através da ferramenta RNA22 e ensaio de gene repórter de luciferase dupla (Fig. 6c, d). No que diz respeito à co-transfecção de células com NPY-3′UTR-WT e imitação de NC, as células com cotransfecção de NPY-3′UTR-WT e miR-124-5p mimetizador mostraram atividade de luciferase prejudicada ( P <0,05). No difference was recognized in the luciferase activity in the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and mimic NC, and the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and miR-124-5p mimic (P> 0,05).

Knockdown of NPY Abolishes the Protective Effects of Inhibited miR-124-5p on Depressed Rats

Spontaneous depletion of NPY and miR-124-5p was programmed to explore their interplay in depressed rats. It was exhibited that (Fig. 7a, b) lower NPY expression level was noticed in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (P <0,05). Body weight and behavioral function tests illustrated that (Fig. 7c–f) by comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group presented reduced weight, SPP, frequency of crossing the grid, incidence of rearing and space exploration time with increased escape latency (all P <0,05). HE staining of the hippocampal lesions pictured that (Fig. 8a) in comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the number of hippocampal neurons was reduced, and hippocampal neurons were darkly stained, sparsely and disorderly arranged in an irregular shape with reduced cell layers in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group. Moreover, versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group was accompanied by reduced DA, NE and 5-HT (all P  < 0.05) (Fig. 8b). Besides, impaired SOD and GSH activities, and increased MDA, IL-1β, TNF-α and NO levels existed in the rats of the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (all P  < 0.05) (Fig. 8c, d). Collectively, knockdown of NPY abolished the protective effects of repressed miR-124-5p on depressed rat.

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on body weight and behavioral function of depressed rats. a MiR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by RT-qPCR (n = 6); b NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by western blot analysis (n = 6); c Body weight of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); d SPP of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); e Frequency of crossing the grid and incidence of rearing after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); f Escape latency and space exploration time after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); Comparisons between two groups were tested by t teste

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on hippocampal damages of depressed rats. a HE staining of hippocampal lesions of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); b ELISA of NE, 5-HT and DA expression in hippocampal tissues of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 6); C. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on SOD, MDA and GSH concentration in serum (n  = 10); D. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on IL-1β, TNF-α and NO concentration in serum (n  = 10). Comparisons between two groups were tested by t teste

Discussion

Depression is a type of psychiatric disorder comprising a variety of conditions with diverse symptoms [20]. Though emerging studies have implied the role of miRNAs in depression, the precise action of miR-124-5p has been rarely investigated. Hence, the present study is projected for better comprehension of the mechanism of miR-124-5p/HDAC1/NPY axis in depression with the major outcome elaborating that silencing of either HDAC1 or miR-124-5p up-regulated NPY to improve memory and learning abilities of depressed rats.

To begin with, this study discovered HDAC1 expression in hippocampal tissues with the findings suggesting the elevation in the HDAC1 expression. Subsequently, with the purpose to decipher the functional roles of HDAC1 in depressed rats, loss-of-function assays were performed and it was disclosed that knockdown of HDAC1 increased the body weight, improved learning and memory abilities, attenuated pathological damage, up-regulated neurotransmitter expression, and suppressed oxidative stress and inflammation in depressed rats. Currently, a study has implied an increment in the expression of HDAC1 in depressive-like and anxiety-like phenotypes resulted by stress-offspring [21]. Moreover, the expression of HDAC1 is documented to up-regulate in penumbra in photothrombotic stroke [22]. Besides that, the incremental HDAC1 mRNA expression is found in granule and pyramidal cells in temporal lobe epilepsy [23]. As to the functional role of HDAC1, it has been reported that virus-mediated overexpression of neuronal HDAC1 in the hippocampus of mice imposes influences on loss of contextual fear memory in particular [24]. Mechanically, HDAC inhibitors reverse cognitive deficits found in neurodegenerative diseases and age-related memory loss [25]. Actually, it is accepted that the HDAC1 suppression by tianeptinaline has advanced neuroplasticity and reinforced memory [26]. As mentioned in a prior study, it is concluded that repression of HDAC1 inhibits the pathogenic processes that lead to motor neuron degeneration in mitochondrial diseases [27]. Experimentally, the silencing of HDAC1 by 5-thienyl-substituted 2-aminobenzamide-type is partially involved in the prevention of neuronal cell death in Parkinson's disease models [28]. Further supported by those researches, the protective effects of silenced HDAC1 have been witnessed in brain diseases, including but not limited to depression.

Then, our study discovered a targeting relationship between HDAC1 and miR-124-5p, which was supported by a prior study which suggests miR-124 transcription is in the charge of EVI1, acting by connection with the deacetylase HDAC1 [29]. miR-124-5p was the overexpressed gene in depressed rats and knockdown of miR-124-5p had the similar functions of silenced HDAC1 in depressed rats. In fact, there is a study indicating that the expression of miR-124 in the hippocampus is up-regulated from 5 to 6 weeks in depression-like behavior phenotypes [7]. Another study has identified the increase in the miR-124 expression in female with cocaine use disorder [30]. Also, it is previously described that miR-124-3p is highly expressed in stressed rodents in major depressive disorder [31]. Regarding to the effects, knockdown of miR-124 in the prefrontal cortex is reported to attenuate depression-like behavior of mice [9]. Besides that, miR-124 knockdown is believed to serve as an antidepressant agent of chronic corticosterone-induced gypenosides in mice [32]. Drawn from a prior study, knockdown of miR-124 can result in improved behavioral susceptibility to a milder stress paradigm [33]. It is reported that suppression of miR-124 by lentivirus transfection in the hippocampus can protect ketamine-induced neurodegeneration in vivo and in vitro [34]. Anyway, miR-124-5p suppression is an active actor to attenuate depression.

Furthermore, NPY expression was verified to be regulated by HDAC1 and miR-124-5p. The deteriorated deficits associated with HDAC2 in histone acetylation may be related to the decreased expression of NPY and can used to control anxiety-like and drinking behaviors [14]. NPY was down-regulated in depressed rats and up-regulation of NPY promoted learning and memory ability recovery in depressed rats. In the development of depressive-like behaviors, the rat models are manifested with reduced NPY expression [17]. Academically, the expression of NPY is evidenced to decline in mice with depression [35]. Consistently, the above-mentioned study findings are as same as the previous literature to some extent.

The novel findings of study suggested that inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities and increased body weight of depressed rats. In addition, knockdown of miR-124-5p or inhibition of HDAC1 suppressed oxidative stress and inflammation and promoted neurotransmitter expression of depressed rats. Moreover, HDAC1 mediated miR-124-5p to regulate NPY. In the rescue experiments, knockdown of NPY abolished the protective effects of inhibited miR-124-5p on depressed rats.

Conclusion

In summary, this study highlighted the effect of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression with the major findings suggesting inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities, increased body weight, suppressed oxidative stress and inflammation, as well as promoted neurotransmitter expression in depressed rats. HDAC1/miR-124-5p/NPY axis may provide a reference to treat neurological disorder, which may also update the existed knowledge of depression. However, further studies are still required for thorough comprehension of the complex mechanism of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression.

Disponibilidade de dados e materiais

Não aplicável.

Abreviações

miR-124-5p:

MicroRNA-124-5p

HDAC1:

Histone deacetylase 1

NPY:

Neuropeptide Y

CUMS:

Chronic unpredictable mild stress

SD:

Sprague–Dawley

SPF:

Specific pathogen-free

NC:

Negative control

OFT:

Open field test

SPT:

Sucrose preference test

SPP:

Sucrose preference percentage

MWM:

Morris water maze test

SOD:

Superoxide dismutase

MDA:

Malondialchehyche

GSH:

Glutationa

IL-β:

Interleukin-β

TNF-α:

Tumor necrosis factor-α

NO:

Nitric oxide

ELISA:

Ensaio de imunoabsorção enzimática

HE:

Hematoxylin–eosin

BCA:

Bicinchoninic acid

NE:

Norepinephrine

5-HT:

Serotonin

DA:

Dopamine

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

cDNA:

Complementary DNA

SDS:

Sodium dodecyl sulfate

ChIP:

Chromatin immunoprecipitation

UTR:

Untranslated region

MUT:

Mutant type

WT:

Wild type

ANOVA:

Análise de variância unilateral

Nanopartículas de óxido de ferro:Materiais compostos de nanotubos de carbono de múltiplas paredes para separação de biomoléculas cromatográficas ou em lote MicroRNA-18b-3p exossômico derivado de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano inibe a ocorrência de pré-eclâmpsia por direcionamento de LEP