miR-18b-3p Exossomal de MSCs de Cordão Umbilical Humano Reduz Risco de Pré-eclâmpsia Alvejando Leptina

Resumo

Exossomos derivados de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano (hucMSCs) expressando microRNAs têm sido destacados em doenças humanas. No entanto, o mecanismo molecular detalhado do miR-18b-3p exossomal derivado de hucMSCs na pré-eclâmpsia (PE) permanece para investigação adicional. Visamos investigar o efeito de exossomos e miR-18b-3p/leptina (LEP) na ocorrência de PE. A morfologia de hucMSCs e exossomos de hucMSCs (Exos) foi identificada. Os exossomos foram infectados com diferentes lentivírus expressando miR-18b-3p para explorar o papel de miR-18b-3p na PE. Modelo de rato PE foi estabelecido por injeção intraperitoneal de éster metílico de N-nitro-L-arginina. A expressão de LEP e miR-18b-3p foi testada em tecidos placentários de ratos PE. Também, o efeito de exossomos na expressão de LEP e miR-18b-3p foi detectado. Pressão arterial sistólica (PAS), proteinúria, fatores inflamatórios, peso de feto e placenta de rato e apoptose celular em ratos PE foram detectados. Finalmente, a relação entre miR-18b-3p e LEP foi verificada usando ensaio de gene repórter de luciferase dual e ensaio de pull-down de RNA. Exossomos, restaurando miR-18b-3p ou inibindo LEP reduziram PAS e proteinúria de ratos PE, bem como aumentaram peso de feto e placenta, diminuíram níveis séricos de fatores inflamatórios e suprimiram células apoptóticas de ratos PE, exercendo efeito supressor na progressão de PE. miR-18b-3p foi diminuído e LEP aumentado em tecidos placentários de ratos PE. LEP foi gene alvo direto de miR-18b-3p. Upregulação de miR-18b-3p ou tratamento dos exossomos suprimiu expressão de LEP e reduziu ocorrência de PE, enquanto downregulação de miR-18b-3p teve efeitos contrários. LEP downregulado reverteu efeito de redução de miR-18b-3p em ratos PE. miR-18b-3p exossomal derivado de hucMSCs alvo LEP para participar na ocorrência e desenvolvimento de PE. Este estudo pode fornecer nova base teórica para mecanismo e investigação de PE.

Introdução

Pré-eclâmpsia (PE), caracterizada por proteinúria e hipertensão, é uma das principais causas de mortalidade e morbidade fetal e materna na gravidez humana. A etiologia e patogênese de PE não são claras, o que tem sido relatado associado a invasão trofoblástica anormal resultando em disfunção endotelial materna, malperfusão placentária crônica e hipertensão com desfechos adversos. Com exceção do parto fetal e placentário, não há terapia específica para PE. Portanto, é urgente explorar alvos terapêuticos para melhorar prognóstico desta doença.

Cordão umbilical humano (huc) é fonte adequada de células-tronco mesenquimais (MSCs) que secretam variedade de fatores tróficos e citocinas, bem como mostram fortes capacidades anti-inflamatórias e imunomoduladoras. Estudo verificou que PE acelera expressão de marcadores neurogliais em MSCs derivados de geléia de Wharton de cordão umbilical. Efeito protetor de exossomos de hucMSCs (Exos) em morfologia placentária e angiogênese em ratos PE também foi relatado. Exossomos são vesículas secretoras pequenas (50-100 nm) que medeiam comunicação entre células no microambiente tumoral via encapsulamento e transmissão de fatores carcinogênicos a sítios distantes ou células circundantes pela circulação. Estudo revelou dano de funções vasculares e complicações induzidas por transferência efetiva de sFlt-1 e sEng em células endoteliais em pacientes com PE por exossomos. MicroRNAs (miRNAs) são RNAs endógenos, não codificantes, com comprimento de 18-25 nucleotídeos, e regulam expressão gênica no nível pós-transcricional. Dados em estudo relataram que expressão de miR-18b afeta invasão celular, viabilidade e migração de células trofoblásticas em PE. Além disso, Wu et al. propuseram que miR-18b atenua proliferação em células endoteliais retinianas humanas induzidas por alta glicose, o que pode oferecer nova insight para compreender mecanismo de patogênese de retinopatia diabética. No entanto, papel de miR-18b-3p exossomal derivado de hucMSCs em PE permanece desconhecido. Leptina (LEP) tem efeitos pleiotrópicos em diferenciação/proliferação celular e imunidade de estados fisiológicos e emerge principalmente de adipócitos, além de outros tecidos, incluindo placenta. Estudo verificou que metilação anormal do promotor LEP está envolvida na progressão de PE. Outro estudo sugeriu que placenta é principal sítio de expressão de LEP na gravidez. No entanto, relação de ligação entre miR-18b-3p e LEP ainda é elusiva. Portanto, visamos explorar papel de miR-18b-3p exossomal derivado de hucMSCs em PE com envolvimento de LEP, e inferimos que miR-18b-3p exossomal derivado de hucMSCs pode inibir progressão de PE via alvo LEP.

Materiais e Métodos

Aprovação Ética

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional do Hospital do Povo da Universidade de Wuhan. Todos os participantes assinaram documento de consentimento informado. Todos os experimentos com animais estiveram em conformidade com Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório por Comitês Internacionais do Hospital do Povo da Universidade de Wuhan.

Isolamento, Cultura e Identificação de HucMSCs

Cordão umbilical fetal entregue por puérpera saudável foi coletado, cortado em pedaços e filtrado com peneira, então misturado com solução de salino fosfatado tamponado (PBS). Tecidos de cordão umbilical foram centrifugados a 1500 r/min por 5 min com raio centrífugo de 10 cm. Tecidos foram suspensos com meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 contendo 10% soro fetal bovino (FBS) e transferidos para frasco de cultura. Líquidos foram trocados após 4 dias e depois trocados a cada 3 dias. Células foram sub-cultivadas quando confluência atingiu cerca de 90%. Crescimento aderente e morfologia de hucMSCs foram observados sob microscópio de luz. Células foram coradas com solução de coloração óleo vermelho O (Beyotime Institute of Biotechnology, Xangai, China) para detectar diferenciação osteogênica de hucMSCs e coradas com solução de coloração fosfatase alcalina (ALP) (Beyotime) para detectar diferenciação adipogênica de hucMSCs. Citômetro de fluxo (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, EUA) foi adotado para testar CD73, CD166 (ambos 1:10, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) e CD105 (1:20, AbD Serotec, Oxford, Reino Unido).

Extração e Identificação de HucMSC-Exos

HucMSCs bem crescidos foram cultivados. O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 28.500 r/min por 1 h com raio centrífugo de 10 cm. O sobrenadante foi descartado, e as células fixadas com glutaraldeído 2% e ácido osmico 1%, desidratadas com etanol, imersas em óxido de propileno, secas por 2 h, embutidas em Epon812 e fatiadas. As fatias foram coradas com urânio e chumbo, respectivamente. Finalmente, os exossomos foram observados sob microscópio eletrônico. Detector Nanosight (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) foi utilizado para detectar imagem de movimento browniano de nanopartículas de exossomos e seu tamanho. Marcadores de superfície de hucMSC-Exos foram identificados por ensaio de Western blot, e resultados mostraram que hucMSC-Exos expressaram CD9, CD81 e CD63.

Método de Infecção por Lentivírus

HucMSC foi infectado com lentivírus contendo vetor de baixa expressão de miR-18b-3p e vetor controle negativo (NC) de baixa expressão de miR-18b-3p (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Xangai, China). Finalmente, hucMSC-antagomir NC e hucMSC-miR-18b-3p antagomir expressos estavelmente foram obtidos. Células foram cultivadas por 48 h, e o sobrenadante coletado e centrifugado com ultracentrifugação para obter Exos-antagomir NC e Exos-miR-18b-3p antagomir correspondentes.

Animais Experimentais

Ratos Wistar (pesando 200-250 g, idade 8 semanas, independente de gênero) em nível de saúde limpo e maturidade sexual foram selecionados (Centro de Animais Experimentais da Universidade de Wuhan, Wuhan, China). Ratos foram alimentados em sistema de barreira com temperatura de 18-28 °C, umidade relativa de 40-70% e dieta e água adequadas.

Estabelecimento de Modelos de Ratos PE

Modelo de rato PE foi estabelecido por injeção intraperitoneal de 50 mg/kg inibidor da sintase de óxido nítrico, N(G)-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, Beyotime) com referência a artigo. O estabelecimento bem-sucedido do modelo PE baseou-se em pressão arterial aumentada com 20 mmHg e superior a 115 mmHg, bem como proteinúria aumentada.

Agrupamento Animal

Rata fêmea e rato macho foram randomicamente coabitados 1:1, e os dois ratos mantidos em gaiola especial individual às 17-18h do dia anterior. O esperma nas secreções vaginais das ratas fêmeas foi observado por plug vaginal e microscópio no dia seguinte. Se resultado positivo ao mesmo tempo, o dia foi registrado como dia 0 da gestação. A partir do 13º dia de gestação, ratos foram divididos em 6 grupos (10 ratos cada): grupo normal (mesma quantidade de salina normal injetada intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação), grupo PE (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de salina normal injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação), grupo PE + miR-NC (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de 4 nmol miR-NC injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação), grupo PE + miR-18b-3p agomir (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de 4 nmol miR-18b-3p agomir injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação), grupo PE + miR-18b-3p antagomir (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de 4 nmol miR-18b-3p antagomir injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação), grupo PE + miR-18b-3p antagomir + pequeno RNA interferente (si)-LEP (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de 4 nmol miR-18b-3p antagomir e si-LEP injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação) e grupo PE + si-LEP (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de 4 nmol si-LEP injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação). Ratos foram tratados com exossomos e exossomos carregando lentivírus. Ratos foram designados em 5 grupos (10 ratos cada): grupo normal (mesma quantidade de salina normal injetada intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação), grupo PE (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de salina normal injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação), grupo PE + Exos (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de Exos (80 µg exossomos suspensos em 20 µL salina normal) injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação), grupo PE + Exos-antagomir NC (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de Exos-antagomir NC [80 µg exossomos suspensos em 20 µL salina normal] injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação) e grupo PE + Exos-miR-18b-3p antagomir (L-NAME [50 mg/kg por dia] injetado intraperitonealmente do dia 13 ao dia 20 de gestação, e 20 µL de Exos-miR-18b-3p antagomir [80 µg exossomos suspensos em 20 µL salina normal] injetado na placenta do dia 16 ao dia 19 de gestação).

Detecção de Pressão Arterial Sistólica (PAS) e Determinação de Proteinúria de 24 h

A pressão dos ratos foi medida por medição de pressão arterial da cauda do rato. A PAS de cauda de todas as ratas prenhes foi medida nos dias 10, 13, 16 e 19 de gestação usando detector de pressão arterial da artéria da cauda do rato (Tensys (R) Medical Inc., San Diego, CA, EUA). A pressão foi medida 3 vezes em curto tempo; então, o valor médio foi tomado como pressão arterial.

No caso de dieta e água livres, a urina de 24 h de ratas prenhes foi coletada nos dias 10, 13, 16 e 19 de gestação, e o conteúdo de proteína detectado no departamento de nefrologia do Hospital do Povo da Universidade de Wuhan.

Coleta de Amostras

Ratas prenhes foram anestesiadas com pentobarbital sódico 3% no dia 21 de gestação. Sangue periférico dos ratos foi preservado, centrifugado para tomar soro e armazenado na geladeira a -20 °C para standby. Então feto de rato e placenta foram tomados por cesariana, membrana fetal e cordão umbilical conectado removidos, e cordão umbilical conectado ao feto cortado. Placenta e feto foram colocados em gaze asséptica para secar sangue e líquido amniótico, respectivamente, e então colocados em balança analítica para pesar peso. Parte de tecidos placentários foi fixada com paraformaldeído 4%, desidratada com etanol, clarificada com xileno, embutida em parafina e continuamente fatiada transversalmente (5 µm) para coloração hematoxilina-eosina (HE) e coloração terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end-labeling (TUNEL). O resto armazenado a -80 °C para detecção de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR), análise de Western blot e imunoensaio enzimático (ELISA).

ELISA

Fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina (IL)-1β e IL-6 em soro foram testados por ELISA. Concentrações de TNF-α, IL-1β e IL-6 foram determinadas seguindo instruções do kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Valores de densidade óptica (OD) (490 nm) testados por leitor de microplaca (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). Curva padrão correspondente obtida usando valor OD como abscissa e concentração da amostra padrão correspondente como ordenada. Concentrações de TNF-α, IL-1β e IL-6 calculadas da curva padrão.

Coloração HE

Amostras de parafina de tecidos placentários foram clarificadas em xileno, desidratadas por álcool gradiente convencional, coradas com hematoxilina, diferenciadas por álcool clorídrico 1% e retornadas ao azul por água de amônia 1%. Então tecidos foram contra-corados com solução de eosina 1%, desidratados (etanol 75%, 90%, 95%, respectivamente, álcool etílico absoluto) e clarificados por xileno, secos, bloqueados e observados sob microscópio eletrônico.

Coloração TUNEL

Seções embutidas em parafina foram rotineiramente desparafinadas e desidratadas conforme instruções, e então apoptose detectada por Kit TUNEL (Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd., Jiangsu, China). 4,6-Diamidino-2-fenilindol (Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd., Xangai, China) usado para observar células TUNEL-positivas usando microscópio de fluorescência (Nikon, Tóquio, Japão).

RT-qPCR

Tecidos placentários foram pesados. Por 50-100 mg tecidos placentários adicionados com 1 mL TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) e completamente dissolvidos. Tecidos apendidos com 200 µL clorofórmio e centrifugados a 4 °C, 12.000 rpm para extrair RNA total. Concentração e pureza de RNA determinadas por espectrofotômetro de ácido nucleico proteico DU-800 (Beckman). U6 e β-actina utilizados como controles de carga. Primers de PCR projetados e compostos pela Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Xangai, China). Sequências de primers listadas na Tabela 1. RNA revertido a cDNA baseando-se em instruções de kit de transcrição reversa de RNA (Sangon). PCR amplificado e produtos verificados por eletroforese em gel de agarose. Dados computados pelo método 2^(-ΔΔCt).

Ensaio de Western Blot

Proteína total de tecidos placentários extraída por tampão de lise celular de ensaio de radioimunoprecipitação (Beyotime). HucMSC-Exo utilizado para abstrair tampão, centrifugado a 14.000 rpm. Sobrenadante preservado para testar expressão de proteína de marcador exossomal (CD81, CD63 e CD9) em soro. Concentração de proteína determinada por kit de ácido bicinchônico (Beyotime, P0010). Amostra carregada conforme resultados quantitativos de proteína, tratada com eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio 10% e transferida para membrana. Membrana bloqueada com leite desnatado 5%, sondada com anticorpos primários LEP, CD63, CD81, CD9 e β-actina (4 mL, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, EUA), re-sondada com anticorpo secundário cabra anti-coelho IgG/peroxidase de raiz-forte 4 mL, exposta e desenvolvida. β-Actina utilizada como referência interna. Valor de cinza analisado por software de análise gráfica de gel Image Lab.

Ensaio de Gene Repórter de Luciferase Dual

Software de predição online https://cm.jefferson.edu/ adotado para predizer relação alvo entre miR-18b-3p e LEP, bem como sítio de ligação de miR-18b-3p e LEP 3'região não traduzida (UTR). Sequência da região promotora 3'UTR de LEP contendo sítio de ligação de miR-18b-3p composta. Plasmídeos 3'UTR tipo selvagem (WT) de LEP e 3'UTR tipo mutante (MUT) de LEP construídos. Plasmídeos recombinantes nomeados como LEP 3'UTR-WT e LEP 3'UTR-MUT, respectivamente. Células 293T cultivadas co-transfetadas com mimético miR-18b-3p e LEP 3'UTR-WT, mimético miR-18b-3p e LEP 3'UTR-MUT, NC mimético e LEP 3'UTR-WT, NC mimético e LEP 3'UTR-MUT por 30 h. Então células 293T coletadas. Atividade de luciferase firefly e renilla em células medidas por medições de luminescência de acordo com kit de detecção de gene repórter de luciferase dual (Promega, Madison, WI, EUA).

Ensaio de Pull-down de RNA

Sondas de RNA biotiniladas (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p e Bio-miR-18b-3p-Mut) incubadas com lisado de células 293T e extraídas usando esferas magnéticas conjugadas com estreptomicina antibiótica. Experimento realizado baseando-se em instruções de kits de pull-down de RNA magnético Pierce (Pierce, IL, EUA). RNA eluído e purificado usando TRIzol (Pierce). Enriquecimento de LEP em complexo de RNA quantificado usando RT-qPCR como descrito anteriormente.

Análise Estatística

Todos os dados explicados por software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EUA). Dados de medição indicados como média ± desvio padrão. Dados conduzidos por teste t de amostra independente para comparações de dois grupos, enquanto comparações entre múltiplos grupos avaliadas por análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida por teste post hoc de Tukey. Critério para significância estatística definido em p < 0,05.

Resultados

Morfologia e Identificação de HucMSC e HucMSC-Exos

Massas de tecido de cordão umbilical observadas sob microscópio invertido. Podia-se ver que células rastejaram para fora da massa de tecido no dia 3; células mostraram forma fusiforme e filamentosas, bem como cresceram como colônia por cerca de 5 dias. Quando cultivadas até passagem 3, morfologia das células foi uniforme longo fusiforme e similar a morfologia de fibroblasto, e arranjo regular. Após 2 semanas de diferenciação adipogênica de hucMSC, gotículas lipídicas formadas no citoplasma, e gotículas lipídicas mostraram estrutura Kranz sob microscópio invertido, sugerindo que hucMSC isolado e cultivado teve capacidade de diferenciação adipogênica. Após 2 semanas de diferenciação osteogênica, grande número de nódulos de cálcio marrons podia ser visto sob microscópio invertido, indicando que hucMSC isolado e cultivado teve capacidade de diferenciação osteogênica. Citômetro de fluxo adotado para testar imunofenótipo de células, e resultados incluíram que células sobreexpressaram marcadores de superfície CD73, CD105 e CD166 de MSCs.

Morfologia de hucMSC-Exos observada por MET, e resultados apresentaram que exossomos eram redondos ou ovais com densidade central baixa e coloração espessa em ambos os lados. Análise Nanosight utilizada para analisar tamanho de partícula de exossomos, e resultados mostraram que tamanho de partícula distribuído principalmente entre 40 e 100 nm, mais concentrado ao redor de 80 nm. Ensaio de Western blot revelou que todos os marcadores de superfície CD81, CD63 e CD9 foram expressos em hucMSC-Exos.

Restauração de miR-18b-3p Alivia Características Patológicas de Ratos PE

Resultados de PAS e proteinúria de 24 h apresentaram que: não houve diferença significativa em PAS e proteinúria de 24 h em 6 grupos antes da administração (dia 10 de gestação). PAS e proteinúria de 24 h no dia 19 de gestação não mostraram diferença óbvia em ratos normais. Em ratos PE ou ratos PE tratados com miR-NC, miR-18b-3p agomir, miR-18b-3p antagomir, miR-18b-3p antagomir + si-LEP, si-NC ou si-LEP, PAS e proteinúria de 24 h começaram a aumentar no dia 13 de gestação. Não houve diferença distinta de PAS e proteinúria de 24 h no dia 16 e dia 19 de gestação em ratos PE tratados com miR-18b-3p agomir e si-LEP. Ratos PE tiveram PAS e proteinúria de 24 h aumentadas no dia 19 de gestação; este aumento foi reduzido por elevação de miR-18b-3p mas further enhanced por inibição de miR-18b-3p; redução de LEP abrogou papel de downregulação de miR-18b-3p na PAS e proteinúria de 24 h no dia 19 de gestação em ratos PE.

Peso de feto e placenta reduziu em ratos PE; miR-18b-3p upregulado ou LEP downregulado aumentou, enquanto miR-18b-3p downregulado diminuiu peso de feto e placenta em ratos PE; silenciamento de LEP reverteu efeito de inibição de miR-18b-3p no peso de feto e placenta em ratos PE.

Fatores inflamatórios em soro de ratos PE detectados. Encontrou-se que conteúdos de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaram em ratos PE; elevação de miR-18b-3p ou inibição de LEP suprimiu, enquanto redução de miR-18b-3p promoveu conteúdos de TNF-α, IL-1β e IL-6; efeito de miR-18b-3p inibido em conteúdos de TNF-α, IL-1β e IL-6 foi abrogado por depleção de LEP.

miR-18b-3p Sobreexpressado Ameliora Mudança Histopatológica de Tecidos Placentários de Ratos PE

Em ratos normais, vilo placentário rico em vasos sanguíneos e estrutura clara, sinciciotrofoblastos principais trofoblastos em vilos placentários, e menos citotrofoblastos. Em ratos PE ou ratos PE tratados com miR-NC, miR-18b-3p antagomir, si-NC ou miR-18b-3p antagomir + si-LEP, número de vilos placentários diminuiu, estrutura borrada e atrofiada, alguns vilos realizaram necrose fibrinoide, e número de nódulos de sinciciotrofoblastos em vilos placentários aumentou, e maioria dos vilos imaturos. Número de trofócitos reduzido, e mudanças patológicas aliviadas em ratos PE tratados com miR-18b-3p agomir e si-LEP.

Coloração TUNEL sugeriu que pequeno número de células apoptóticas podia ser visto. Ratos PE tiveram células apoptóticas aumentadas, que foram reduzidas por elevação de miR-18b-3p e silenciamento de LEP, e further enhanced por inibição de miR-18b-3p; silenciamento de LEP também reverteu efeito de inibição de miR-18b-3p no número de células apoptóticas em ratos PE.

Juntos, ratos com miR-18b-3p upregulado ou LEP inibido tiveram grau diminuído de progressão de PE em histologia, e LEP silenciado pôde abolir efeito terapêutico de miR-18b-3p inibido.

miR-18b-3p Downregulado, Enquanto LEP Upregulado em Tecidos Placentários de Ratos PE e miR-18b-3p Alvo LEP

Baseado nos resultados acima, downregulação de LEP reverteu efeito terapêutico de downregulação de miR-18b-3p em ratos PE em patologia e histologia; assim, hipotetizamos que miR-18b-3p pode estar relacionado a LEP.

Ensaio de Western blot e RT-qPCR revelaram que ratos PE tiveram miR-18b-3p diminuído e níveis de expressão de LEP aumentados; tratamento de miR-18b-3p agomir upregulou miR-18b-3p e downregulou LEP em ratos PE, enquanto tratamento de miR-18b-3p antagomir aumentou expressão de LEP; silenciamento de LEP reverteu efeito promotor de redução de miR-18b-3p na expressão de LEP em ratos PE.

Ensaio de Western blot e RT-qPCR usados para explorar papel de exossomos em ratos PE. Resultados exibiram que exossomos upregularam miR-18b-3p e downregularam LEP em ratos PE, indicando efeito supressor de exossomos no desenvolvimento de PE. Além disso, exossomos transmitindo miR-18b-3p antagomir induziram downregulação de miR-18b-3p e upregulação de LEP em ratos PE.

Relação alvo entre miR-18b-3p e LEP predita por software de predição bioinformática online https://cm.jefferson.edu/. Ensaio de gene repórter de luciferase dual sugeriu que mimético miR-18b-3p diminuiu atividade de luciferase de LEP 3'UTR-WT, enquanto não impôs impactos em LEP 3'UTR-MUT. Além disso, ensaio de pull-down de RNA revelou que enriquecimento de LEP aumentado por miR-18b-3p biotinilado WT. Estes achados indicaram que LEP é gene alvo de miR-18b-3p.

HucMSC-Exos Atenua Características Patológicas de Ratos PE

Resultados de PAS e 24 h apresentaram que não houve diferença significativa em PAS e proteinúria de 24 h em 5 grupos antes da administração (dia 10 de gestação). PAS e proteinúria de 24 h no dia 19 de gestação não mostraram diferença distinta em ratos normais. Em ratos PE, PAS e proteinúria de 24 h começaram a aumentar no dia 13 de gestação. Não houve diferença distinta de PAS e proteinúria de 24 h no dia 16 e dia 19 de gestação em ratos PE tratados com hucMSC-Exos e hucMSC-Exos transmitindo antagomir NC. PAS e proteinúria de 24 h aumentaram no dia 19 de gestação em ratos PE, enquanto aumento foi reduzido por injeção de hucMSC-Exos. Inibição de miR-18b-3p reverteu efeito de hucMSC-Exos em PAS e proteinúria de 24 h no dia 19 de gestação em ratos PE.

Peso de feto e placenta medido, e encontramos que ratos PE tiveram peso de feto e placenta diminuído; downregulação de miR-18b-3p aboliu papel de hucMSC-Exos no peso de feto e placenta em ratos PE.

Fatores inflamatórios em soro detectados usando ELISA. TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaram notavelmente em ratos PE. Tratamento de exossomos diminuiu TNF-α, IL-1β e IL-6 em soro de ratos PE, que foram aumentados por injeção de exossomos inibindo miR-18b-3p.

Exossomos Alivia Mudança Patológica e Inibe Apoptose de Tecidos Placentários de Ratos PE

Em ratos normais, vilo placentário abundante em vasos sanguíneos com estrutura clara, sinciciotrofoblastos principais trofoblastos em vilos placentários, e menos citotrofoblastos. Em ratos PE e ratos PE tratados com hucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir, número de vilos placentários reduziu, estrutura borrada e atrofiada, alguns vilos apresentaram necrose fibrinoide, e número de nódulos de sinciciotrofoblastos em vilos placentários aumentou, e maioria dos vilos imaturos. Mudança patológica melhorada em ratos PE tratados com hucMSC-Exos ou hucMSC-Exos-antagomir NC versus ratos PE e ratos PE tratados com hucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir.

Coloração TUNEL indicou que em ratos normais, pequeno número de células apoptóticas podia ser visto. Ratos PE tiveram células apoptóticas aumentadas, e miR-18b-3p reduzido reverteu impactos de hucMSC-Exos no número de células apoptóticas em tecidos placentários de ratos PE.

Discussão

PE é um transtorno de gravidez multissistêmico caracterizado por proteinúria e ou pressão arterial alta ou outras condições adversas e ligado a ampla gama de disfunção endotelial materna. Relatou-se que hucMSC-Exo melhorou morfologia de tecido placentário em ratos PE através de supressão de apoptose celular e facilitação de angiogênese em tecido placentário de maneira dependente de dose. Estudo relatou que expressão de miR-18b afetou migração celular, viabilidade e invasão em PE. Além disso, verificou-se concentração materna de LEP aumentada e hipometilação de LEP em placenta em PE de início precoce. Estudo atual projetado para explorar efeito de exossomos e miR-18b-3p alvejando LEP na ocorrência de PE. Achados neste estudo revelaram que miR-18b-3p exossomal derivado de hucMSCs inibiu progressão de PE reduzindo LEP.

Baseado em nossos achados, miR-18b-3p reduziu e LEP elevou em tecidos placentários de ratos PE. Similar ao nosso estudo, expressão de mRNA de miR-18b foi marcadamente suprimida em tecidos placentários PE relativo àquela em tecidos placentários normais. Além disso, estudo revelou que conteúdo de miR-18b foi dramaticamente reduzido em tecidos de melanoma maligno em comparação com tecidos adjacentes não tumorais pareados. Outro estudo verificou que expressão placentária de LEP foi elevada em PE pré-termo comparado com controles. Além disso, estudo mostrou que expressão de LEP foi obviamente aumentada em placentas pré-eclâmpticas. Esta literatura forneceu base teórica para explorar expressão anormal de miR-18b-3p e LEP em PE. Além disso, predito usando software bioinformático que LEP foi alvo de miR-18b-3p, e esta relação de alvo foi further confirmada com ensaio de gene repórter de luciferase dual em nossa pesquisa. Estudo relatou que LEP é alvo para todos três miRNAs (miR-1301, miR-223 e miR-224) em PE de início precoce. Outro estudo exibiu que LEP diminuiu expressão de miR-93 em osteoartrite e artrite reumatoide. No entanto, ligação entre miR-18b-3p e LEP em doenças humanas, especialmente em PE, permanece escassamente estudada, que é novidade deste estudo. Além disso, resultado emergente de nosso estudo relatou que exossomos aumentaram miR-18b-3p e diminuíram LEP em tecidos placentários de PE. Foi anteriormente documentado que expressão de miR-18b-5p foi notavelmente elevada em exossomos de plasma de câncer colorretal, enquanto relação entre hucMSC-Exos e miR-18b-3p/LEP em PE precisa estudo adicional.

Adicionalmente, achado de nossa investigação mostrou que miR-18b-3p restaurado reduziu PAS e proteinúria de 24 h de ratos PE, aumentou peso de placenta, declinou conteúdos de TNF-α, IL-1β e IL-6 em soro e tecidos placentários, bem como suprimiu apoptose celular. Estes dados indicaram que elevação de miR-18b-3p contribui para aliviar sintomas e mudanças patológicas em PE. Demonstraram que upregulação estável de miR-18b produziu atividade inibidora de tumor efetiva, como inibir viabilidade de células de melanoma, induzir apoptose e reduzir crescimento tumoral in vivo. Outro resultado em nosso estudo foi que hucMSC-Exos reduziram PAS e proteinúria de 24 h de ratos PE, aumentaram peso de placenta, declinaram TNF-α, IL-1β e IL-6 em soro e tecidos placentários, bem como suprimiram apoptose celular. Achados do estudo atual revelaram que modelos de ratos PE tratados com exossomos apresentaram aumento de número e qualidade de fetos, qualidade de placenta, mas apoptose celular significativamente reduzida. Interessantemente, pesquisa prévia demonstrou que adição de exossomos fetais bovinos declinou conteúdos de TNF-α e IL-6 de macrófagos. Estudo revelou que exossomos purificados suprimiram produção de IL-1β em macrófagos estimulados por lipopolissacarídeo/nigericina. Além disso, Nong et al. sugeriram que marcadores inflamatórios, como TNF-α e IL-6, foram dramaticamente diminuídos após administração de exossomos produzidos através de MSCs derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas humanas. Artigo encontrou que PAS foi marcadamente elevada em grupo de mulheres que posteriormente desenvolveram PE. Exibiu que pacientes PE foram positivamente associados com PAS e pressões diastólicas e proteinúria. Também, estudo recente forneceu prova que proteinúria aumentou com avanço de gestação em mulheres PE. Achado importante foi que ratos do grupo PE tiveram TNF-α aumentado relativo a grupo normal prenhe. Outro estudo verificou que IL-6 e IL-1β séricos foram obviamente elevados em mulheres com PE em relação a controles. Acima achados sugeriram que pacientes PE geralmente mostraram alta PAS, proteinúria e níveis de fatores inflamatórios. Assim, podia ser inferido de nossos resultados que miR-18b-3p exossomal derivado de hucMSCs teve efeito terapêutico em PE.

Conclusão

Em conclusão, nosso estudo fornece evidência que exossomos derivados de hucMSCs upregulam miR-18b-3p, que alvo LEP para suprimir conteúdos de fatores inflamatórios e reduzir taxa de apoptose celular em tecidos placentários de ratos PE, inibindo assim ocorrência de PE. Assim, miR-18b-3p exossomal pode ser candidato potencial para tratamento de PE via alvo LEP. Esta pesquisa identificou papel de miR-18b-3p exossomal derivado de hucMSCs alvejando LEP durante desenvolvimento de PE pela primeira vez, que forneceu nova insight para tratamento de PE. No entanto, devido à limitação de pesquisas conhecidas, estudo precisa ser monitorado rigorosamente e reportado apropriadamente em futuros ensaios clínicos.