HDAC1 Regula miR-124-5p e NPY para Modular Aprendizado e Memória em Modelos de Ratos Depressivos

Resumo

Pesquisas centradas em histona desacetilases (HDACs) na depressão têm sido amplamente conduzidas, mas não muito sobre HDAC1. Neste sentido, o presente estudo é lançado para revelar o mecanismo do eixo HDAC1/microRNA (miR)-124-5p/neuropeptídeo Y (NPY) na depressão. Ratos Sprague Dawley foram estimulados por estresse leve crônico imprevisível para estabelecer modelos de depressão. Ratos deprimidos foram injetados com HDAC1 inibido ou miR-124-5p suprimido para explorar seus papéis no peso corporal, habilidades de aprendizado e memória, estresse oxidativo e inflamação no soro e expressão de neurotransmissores em tecidos hipocampais. A expressão de miR-124-5p, HDAC1 e NPY no hipocampo foi testada. As interações da expressão de miR-124-5p, HDAC1 e NPY também foram confirmadas. Níveis mais altos de miR-124-5p e HDAC1 e menores de NPY foram encontrados no hipocampo de ratos deprimidos. A inibição de miR-124-5p ou supressão de HDAC1 atenuou habilidades de aprendizado e memória e aumentou o peso corporal de ratos deprimidos. O silenciamento de miR-124-5p ou inibição de HDAC1 suprimiu estresse oxidativo e inflamação e promoveu expressão de neurotransmissores de ratos deprimidos. HDAC1 mediou miR-124-5p para regular NPY. O silenciamento de NPY aboliu os efeitos protetores de miR-124-5p inibido em ratos deprimidos. Nosso estudo ilustra que a supressão de miR-124-5p ou HDAC1 up-regula NPY para melhorar memória e habilidades de aprendizado em camundongos deprimidos, o que pode atualizar o conhecimento existente sobre depressão e fornecer nova referência para tratamento da depressão.

Introdução

A depressão refere-se a uma psicose severa e debilitante que causa graves ônus econômicos e consequências sociais globalmente. A depressão é caracterizada por mudanças fisiológicas, cognitivas e comportamentais que ameaçam a saúde geral dos pacientes. Os tratamentos acessíveis à depressão têm se desenvolvido com a aplicação de cetamina como antidepressivo de ação rápida e o refinamento de equipamentos capazes de atender seletivamente à atividade de populações de subtipos neuronais. Além disso, nanoarquiteturas versáteis como pontos de carbono são aplicáveis para distúrbios neurológicos. No entanto, tratamento inadequado para depressão pode resultar em baixo desempenho, disfunções comportamentais, doenças físicas, abuso de substâncias e até suicídio. Assim, há uma necessidade desesperada de descobrir agentes inovadores no tratamento da depressão.

É documentado anteriormente que o nível de microRNA (miR)-124 aumenta no plasma com depressão e antidepressivos. Durante depressão induzida por estresse leve crônico imprevisível (CUMS), a expressão de miR-124 no hipocampo mostra variações dinâmicas, indicando várias mudanças patológicas em diferentes estágios da depressão. Além disso, miR-124 é candidato a amenizar comportamentos depressivos no transtorno depressivo maior. Também, a supressão de miR-124 serve como antidepressivo no córtex pré-frontal, como refletido por comportamentos depressivos atenuados em camundongos. Histona desacetilase 1 (HDAC1) é mediadora de miR-124 que forma complexo multi-proteico para regulação transcripcional e modificação epigenética. Ao nosso melhor conhecimento, uma diminuição da atividade de HDAC1 promove resiliência no transtorno depressivo maior. Além disso, a supressão de HDAC1 no cérebro pode melhorar transtornos de humor e outras doenças cerebrais neuroplásticas alteradas. Inibidores de HDAC podem atenuar comportamentos ansiosos e de consumo de álcool, e podem elevar a expressão de neuropeptídeo Y (NPY). Também, a diminuição da atividade de HDAC pode levar a aumento na expressão de NPY no núcleo central da amígdala e núcleo medial da amígdala. NPY é um neuropeptídeo orexigênico hipotalâmico suficiente para prevenir ansiedade, transtornos sociais e sintomas depressivos. Além disso, NPY e seus receptores têm evidenciado efeitos anti-inflamatórios e antidepressivos em modelos de ratos com depressão induzida por lipopolissacarídeos. Juntos, a interação combinada do eixo HDAC1/miR-124-5p/NPY na depressão está em ambiguidade. Assim, este estudo pretende desenterrar o mecanismo deste eixo para investigar um candidato curativo para terapia da depressão.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Os experimentos com animais envolvidos neste estudo aderiram aos requisitos de ética experimental animal do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Harbin. Os experimentos foram otimizados para melhorar condições de alimentação de animais experimentais, reduzir o número de animais usados e aliviar sofrimento animal.

Animais Experimentais

Ratos Sprague-Dawley (SD) machos de grau livre de patógenos específicos (SPF), pesando 200-220 g, foram fornecidos pelo Centro de Pesquisa Animal, Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Harbin (Harbin, China). Os ratos foram mantidos em ambiente de grau SPF (22-24 °C, 60-64% umidade, ciclos de 12 h luz e escuro). Exceto pelo período durante modelagem e outros pontos de tempo específicos, os ratos tiveram livre acesso a água e comida.

Agrupamento de Ratos e Estabelecimento do Modelo

Os ratos modelados foram randomicamente divididos em 8 grupos (n = 10): grupo normal (ratos sem qualquer tratamento), grupo CUMS (ratos com depressão induzida por CUMS), grupo sh-controle negativo (NC) (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com lentivírus NC sh-HDAC1), grupo sh-HDAC1 (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com lentivírus sh-HDAC1), grupo anti-miR-NC (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com lentivírus NC anti-miR-124-5p), grupo anti-miR-124-5p (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com lentivírus anti-miR-124-5p), grupo anti-miR-124-5p + sh-NC (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com lentivírus anti-miR-124-5p e lentivírus NC sh-NPY), e grupo anti-miR-124-5p + sh-NPY (ratos com depressão induzida por CUMS injetados com lentivírus anti-miR-124-5p e lentivírus sh-NPY).

Modelos de ratos com depressão induzida por CUMS foram estabelecidos pelo método de Willner. Ratos no grupo normal foram alimentados com comida e água sem quaisquer estímulos enquanto ratos nos outros 7 grupos receberam 35 dias de CUMS em gaiolas independentes. Estes ratos foram estimulados por natação em água gelada a 4 °C por 5 min em recipiente (30 cm de profundidade de água), inversão dia/noite (ratos ficando no escuro por 12 h durante o dia e em espaço iluminado por lâmpadas incandescentes por 12 h durante a noite), fixação da cauda por clipe de cauda por 30 s, agitação de 1 min, jejum de 24 h e privação de água, estimulação ultrasônica de 30 min (50 Hz), forração úmida, e ar condicionado a 17 °C. Ratos foram estimulados randomicamente por um destes estímulos diariamente, e o mesmo estímulo foi aplicado no máximo 5 vezes no total.

Ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico 2% (50 mg/kg) e hipocampo bilateral (diâmetro anteroposterior = 4,8 mm, distância mediolateral = ± 2,5 mm, distância entre cavidade posterior e fontanela anterior = -3,5 mm) foram injetados com lentivírus a 1 µL/min por seringa micro Hamilton com agulha 26-G. A agulha foi mantida no local de injeção por 5 min para prevenir refluxo. Os crânios foram selados com cera óssea e as incisões suturadas, e os ratos recuperados por 7 dias. Lentivírus sh-HDAC1 e seu NC, lentivírus anti-miR-124-5p e seu NC, bem como sh-NPY e seu NC (título: 10⁸ TU/mL) foram comprados da GenePharma Co. Ltd. (Xangai, China).

Testes de Função Comportamental

Ratos foram pesados no dia antes da modelagem CUMS (dia 0), após modelagem CUMS (dia 36), e após interferência do lentivírus (dia 52).

Teste de campo aberto (OFT) podia detectar comportamentos autonômicos e exploratórios de ratos em novo ambiente, comumente usado para avaliar comportamentos depressivos. Este teste foi realizado em caixa de campo aberto de madeira preta (100 cm × 100 cm × 50 cm) com sistema de rastreamento por vídeo colocado acima da caixa para registrar atividades dos ratos. O fundo da caixa aberta foi dividido em 25 grades (20 cm × 20 cm) com linhas brancas. Os ratos foram colocados na grade central em ordem aleatória predefinida e a quantidade de cruzamento de grade (ratos entrando em grade com membros ou membros anteriores duplos com um membro posterior) e incidência de erguer-se (ratos levantando membros anteriores e ficando eretos com um membro posterior) foram registrados pelo sistema de rastreamento por vídeo. Este teste foi realizado em ambiente interno silencioso e pouco iluminado. Após cada teste, a caixa de campo aberto foi limpa com álcool 75% para remover odores.

Anedonia é um dos sintomas cruciais da depressão. O teste de preferência por sacarose (SPT) podia avaliar comportamentos depressivos de ratos. Antes do SPT, cada rato foi fornecido com 2 garrafas de água com açúcar (1% sacarose, p/p) por 24 h, e com 1 garrafa de água estéril e 1 garrafa de água com açúcar por mais 24 h. Após isso, a porcentagem de preferência por sacarose (SPP) dos ratos foi detectada como seguinte: após jejum de 23 h e privação de água, ratos foram permitidos a 1 garrafa de água estéril e 1 garrafa de água com açúcar (1% sacarose) por 30 min. Após 1 h, a localização das duas garrafas foi invertida e ratos livres para estas duas garrafas por mais 30 min. Durante esta 1 h, o consumo (mL) destas duas garrafas de água estéril e água com açúcar (1% sacarose) foi medido e SPP calculado. SPP = consumo de água com açúcar / (consumo de água com açúcar + consumo de água estéril) × 100%.

Teste do labirinto aquático de Morris (MWM) foi amplamente aplicado para avaliar habilidades de aprendizado espacial e memória de ratos. Teste MWM foi realizado em tanque de água circular (150 cm de diâmetro e 60 cm de altura) com profundidade de água de 40 cm. A temperatura da água foi mantida a 22 ± 1 °C e a água foi tingida de preto com corante não tóxico e fácil de limpar. O tanque e superfície da água foram divididos em 4 quadrantes (SE, SW, NW e NE) com cada quadrante decorado com seu ícone correspondente com cor brilhante e forma especial na parede interna. A plataforma alvo era uma plataforma circular transparente (11 cm de diâmetro), localizada no centro do quadrante NE e imersa 1,5 cm abaixo da superfície da água. Um sistema de rastreamento por vídeo foi instalado acima do centro do tanque para registrar velocidade de natação, caminho, e tempo gasto para ratos entrarem na plataforma alvo e nadarem nos quadrantes. Ratos foram colocados na água de 4 quadrantes em ordem aleatória e permitidos explorar e embarcar na plataforma alvo dentro de 60 s. O tempo gasto pelos ratos para embarcar na plataforma foi registrado como latência de fuga. Se ratos falhassem em embarcar na plataforma alvo dentro de 60 s, eram guiados e a latência de fuga registrada como 60 s. Após cada teste, ratos foram permitidos ficar na plataforma alvo por 15 s e ratos foram treinados 4 vezes ao dia por 5 dias. A latência de fuga final foi a média da latência de fuga nos dias 3-5. No 6º dia do teste MWM, teste de exploração espacial foi realizado. A plataforma alvo foi removida do tanque de água, e os ratos entraram na água do quadrante SW. O tempo de ratos nadando no quadrante NE dentro de 60 s foi registrado como tempo de exploração espacial.

Cronologia deste experimento é mostrada na Fig. 1.

Coleta de Amostras

Um dia após o último teste MWM, os ratos foram eutanasiados e injetados intraperitonealmente com pentobarbital sódico 2% (50 mg/kg). A cavidade torácica foi aberta para obter sangue do coração com seringa, que foi centrifugado 3 vezes a 3500 r/min por 15 min, e o sobrenadante armazenado a -20 °C. Após coleta de sangue, um cateter foi inserido do ventrículo esquerdo à aorta, e 500 mL de salina normal foi perfundido para lavar todo o sangue. Tecidos hipocampais foram separados e colocados em tubos de centrífuga de 1,5 mL, pesados e armazenados a -80 °C. Parte do hipocampo foi fixada com paraformaldeído 4% por 2 h, desidratada com sacarose gradiente e embutida em parafina.

Detecção de Índices Relacionados a Estresse Oxidativo e Inflamatórios

O soro foi reaquecido para detecção de superóxido dismutase (SOD), malondialdeído (MDA), glutationa (GSH), interleucina (IL)-β, fator de necrose tumoral-α (TNF-α), e concentração de óxido nítrico (NO). Kits para detecção de SOD, MDA e GSH foram fornecidos pelo Instituto de Biotecnologia Beyotime (Xangai, China), enquanto kits de imunoensaio enzimático (ELISA) para detecção de IL-β, TNF-α e NO pelo Instituto de Bioengenharia NanJing JianCheng (Nanjing, China).

Coloração Hematoxilina-Eosina (HE)

As seções de parafina foram desparafinadas, hidratadas com etanol, enxaguadas com água destilada e coradas com solução de hematoxilina por 20 min. Após isso, as seções foram enxaguadas com água da torneira até ficarem azuis. Então, as seções foram colocadas em solução de ácido clorídrico etanólico 1% por 10 s, enxaguadas com água da torneira e desidratadas com etanol, seguido por coloração em eosina por 2 min, desidratação com álcool de alta concentração e permeabilização em xileno. Finalmente, as seções foram seladas e observadas sob microscópio biológico.

Detecção de Expressão de Neurotransmissores

Os tecidos hipocampais foram pesados e homogeneizados por ultrassom em salina normal (100 µL/10 mg). O homogenizado foi mantido a 4 °C por 30 min, centrifugado a 12.000 rpm (4 °C) por 3 min para coletar o sobrenadante. A concentração de proteína do sobrenadante foi detectada por kit de detecção de proteína ácido bicinchônico (BCA) (CWBIO, Pequim, China) e os níveis de expressão de norepinefrina (NE), serotonina (5-HT), e dopamina (DA) por kits ELISA. Kits ELISA de NE, 5-HT e DA foram fornecidos pela Liweiping Biotechnology Co., Ltd. (Pequim, China).

Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa Quantitativa (RT-qPCR)

RNA foi extraído de tecidos hipocampais por kit de extração de RNA (Promega, Madison, WI, EUA), e a concentração e pureza do RNA foram detectadas por espectrofotômetro ultravioleta. Seguido pelas instruções do kit de transcrição reversa (DRR047S, Takara, Dalian, China), a transcrição reversa de RNA em DNA complementar (cDNA) foi realizada. mRNA foi transcrito reversamente em cDNA por Kit GoldScript RT-PCR de uma etapa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) enquanto miRNA por kit de detecção quantitativa de miRNA Hairpin-it™ (GenePharma). Kit de detecção RT-qPCR (Promega) foi aplicado para detectar expressão de HDAC1, miR-124-5p e NPY em tecidos. U6 foi indicado como controle interno para miR-124-5p enquanto β-actina para HDAC1 e NPY. Primers de PCR foram obtidos da Sangon Biotech Co., Ltd. (Xangai, China) (Tabela 1). A expressão relativa de genes alvo foi calculada pelo método 2^(-ΔΔCt).

Análise de Western Blot

Os tecidos hipocampais foram cortados em pedaços no gelo e lisados por lisado de ensaio de radioimunoprecipitação (Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd., Pequim, China) para extrair proteína. A concentração de proteína foi determinada pelo método BCA. Proteína total (50 µg) foi adicionada com tampão de carregamento de dodecil sulfato de sódio (SDS) 5× a 1:4 e aquecida em banho-maria fervente por 5 min. Então, a proteína foi submetida a eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio, eletrotransferida para membrana e bloqueada com leite 5% por 1 h. Após isso, a proteína foi sondada com anticorpos primários contra HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA), NPY (1:800, NeoMakers, Fremont, Califórnia, EUA) e β-actina (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, Reino Unido) durante a noite, e re-sondada com anticorpo secundário marcado com peroxidase de raiz-forte. A membrana foi desenvolvida por quimioluminescência aprimorada, e a densidade óptica calculada por software de análise de cinza Quantity One. A expressão de proteína do gene alvo foi expressa como razão do valor de cinza para valor de cinza de β-actina.

Ensaio de Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP)

Ensaio ChIP foi realizado em conformidade com instruções do kit EZ-ChIP (Millipore, Bedford, MA, EUA). Células HEK293T foram incubadas com formaldeído 1% por 10 min e terminadas por glicina. Então, as células foram centrifugadas a 2000 rpm por 5 min, e adicionadas com tampão de lise SDS para ultrassonicação. Centrifugadas a 10.000 g a 4 °C por 10 min, as células (100 µL) reagiram com 900 µL tampão de diluição ChIP, 20 µL de 50× PIC e 60 µL ProteinA Agarose/DNA de esperma de salmão a 4 °C por 1 h, e permitidas repousar por 10 min. Os precipitados foram centrifugados a 700 rpm por 1 min com 20 µL como input. Um tubo foi adicionado com anticorpo HDAC1 (1 µL) e anticorpo imunoglobulina G e o outro tubo sem anticorpo. As amostras nos dois tubos foram incubadas durante a noite, eluídas e desentrelaçadas. Após recuperação de DNA, a amostra foi testada por RT-qPCR.

Ensaio de Gene Repórter de Luciferase Dual

Site de bioinformática (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) analisou os sítios de ligação de miR-124-5p e NPY. Plasmídeos NPY-tipo selvagem (WT) e NPY-mutante (MUT) foram gerados pela Huayueyang Biotechnology Co., Ltd. (Pequim, China). Combinados com NC mimético ou mimético miR-124-5p, os plasmídeos foram transfetados em células HEK293T. Atividade de luciferase celular foi determinada por kit de detecção de luciferase (BioVision) e luminômetro Glomax20/20 (Promega).

Análise Estatística

Software estatístico SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EUA) foi utilizado para análise de dados. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Comparações entre dois grupos foram testadas por teste t. Comparações entre múltiplos grupos foram avaliadas por análise de variância unidirecional (ANOVA), após a qual comparações pareadas pelo teste post hoc de Tukey. P representou testes bicaudados e P < 0,05 foi considerado significância estatística.

Resultados

Inibição de HDAC1 ou miR-124-5p Aumenta Peso de Ratos Depressivos

Ratos foram pesados 1 dia antes da modelagem CUMS (dia 0), 1 dia após cessação da modelagem (dia 36), e 7 dias após interferência do lentivírus (dia 52). Nenhuma diferença foi detectada no peso corporal de ratos em cada grupo antes da modelagem (todos P > 0,05). Após modelagem, o peso dos ratos diminuiu no grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC e grupo anti-miR-124-5p versus grupo normal (todos P < 0,05). Nenhuma discrepância notada quanto ao peso dos ratos no grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC e grupo anti-miR-124-5p (todos P > 0,05). Após interferência, o peso dos ratos diminuiu no grupo CUMS versus grupo normal (todos P < 0,05). Nenhuma discrepância notada quanto ao peso dos ratos no grupo CUMS, grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC (todos P > 0,05). O peso dos ratos aumentou no grupo sh-HDAC1 e grupo anti-miR-124-5p relativo aos seus grupos NC (ambos P < 0,05), indicando que inibição de HDAC1 ou miR-124-5p aumentou peso de ratos deprimidos.

Inibição de HDAC1 ou miR-124-5p Melhora Habilidades de Aprendizado e Memória em Ratos Depressivos

SPT, OFT e teste MWM foram aplicados para detectar SPP, frequência de cruzamento de grade e incidência de erguer-se, bem como latência de fuga e tempo de exploração espacial. Foi delineado que antes da interferência, em comparação com grupo normal, SPP, frequência de cruzamento de grade, incidência de erguer-se e tempo de exploração espacial reduziram, enquanto latência de fuga prolongou no grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC e grupo anti-miR-124-5p (todos P < 0,05), sugerindo desenvolvimento de comportamentos depressivos em ratos. Não houve discrepância em SPP, frequência de cruzamento de grade, incidência de erguer-se, tempo de exploração espacial e latência de fuga entre grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC e grupo anti-miR-124-5p (todos P > 0,05). Após interferência, versus grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC, SPP, frequência de cruzamento de grade, incidência de erguer-se e tempo de exploração espacial aumentaram enquanto latência de fuga encurtou no grupo sh-HDAC1 e grupo anti-miR-124-5p (todos P < 0,05). Nenhuma diferença observada em SPP, frequência de cruzamento de grade, incidência de erguer-se, tempo de exploração espacial e latência de fuga entre grupo CUMS, grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC (todos P > 0,05), sugerindo que silenciamento de HDAC1 ou supressão de miR-124-5p pode atenuar comportamentos depressivos e melhorar habilidades de aprendizado e memória em ratos.

Inibição de HDAC1 ou miR-124-5p Atenua Dano Neuronal Patológico em Ratos Depressivos

Observação de lesões hipocampais por coloração HE revelou que neurônios arranjados ordenadamente no hipocampo de ratos no grupo normal mostraram morfologia clara, estrutura normal, camadas densas, núcleos celulares claros e nucléolos óbvios. Neurônios de ratos no grupo CUMS eram encolhidos, diminuídos em número e arranjados frouxamente com cromatina desigualmente distribuída e camada afinada. Ratos nos grupos sh-NC e anti-miR-NC mostraram mesma situação do grupo CUMS. Ratos nos grupos sh-HDAC1 e anti-miR-124-5p exibiram neurônios aumentados em ordem e dano atenuado por comparação com seus grupos NC. Indicou que silenciamento de HDAC1 ou inibição de miR-124-5p aliviou lesões hipocampais em ratos deprimidos.

Inibição de HDAC1 ou miR-124-5p Up-regula Expressão de Neurotransmissores em Ratos Depressivos

Depressão estava relacionada a distúrbios de neurotransmissores cerebrais. Portanto, níveis de neurotransmissores DA, NE e 5-HT em hipocampo de ratos foram medidos por ELISA. Os resultados indicaram que com grupo normal por contraste, níveis reduzidos de DA, NE e 5-HT foram encontrados em ratos do grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC e grupo anti-miR-124-5p (todos P < 0,05). Nenhuma diferença testemunhada na expressão de neurotransmissores no grupo CUMS, grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC (todos P > 0,05). Relativo aos grupos sh-NC e anti-miR-NC, níveis de DA, NE e 5-HT aumentaram em ratos dos grupos sh-HDAC1 e anti-miR-124-5p (todos P < 0,05), implicando que down-regulação de HDAC1 ou redução de miR-124-5p pode up-regular níveis de DA, NE e 5-HT no hipocampo de ratos deprimidos.

Inibição de HDAC1 ou miR-124-5p Suprime Estresse Oxidativo e Inflamação em Ratos Depressivos

Expressão de fatores inflamatórios e relacionados a estresse oxidativo no soro foram medidos. Com respeito ao grupo normal, atividades de SOD e GSH foram prejudicadas, enquanto níveis de MDA, IL-1β, TNF-α e NO aumentaram nos outros grupos modelo de depressão (todos P < 0,05). Atividades de SOD e GSH, e níveis de MDA, IL-1β, TNF-α e NO entre grupo CUMS, grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC não mostraram diferença (todos P > 0,05). Em relação ao grupo sh-NC e grupo anti-miR-NC, aumento foi notado nas atividades de SOD e GSH e diminuição observada nos níveis de MDA, IL-1β, TNF-α e NO no grupo sh-HDAC1 e grupo anti-miR-124-5p (todos P < 0,05), indicando que depleção de HDAC1 ou down-regulação de miR-124-5p pode aliviar estresse oxidativo e inflamação em ratos deprimidos.

HDAC1 Media miR-124-5p para Regular NPY

RT-qPCR e análise de Western blot foram adotadas para detecção de HDAC1, miR-124-5p e NPY no hipocampo. Delineou-se que versus grupo normal, HDAC1 e miR-124-5p aumentaram e NPY diminuiu no grupo CUMS (todos P < 0,05). Expressão de HDAC1, miR-124-5p e NPY não mostraram variações no grupo CUMS e grupo sh-NC (todos P > 0,05). Relativo ao grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1 refletiu diminuição de HDAC1 e miR-124-5p e elevação de níveis de expressão de NPY (todos P < 0,05). Os achados acima sugeriram interferência bem-sucedida do lentivírus e relação positiva entre expressão de miR-124-5p e HDAC1.

Também, expressão de miR-124-5p e NPY após supressão de miR-124-5p foram detectadas com resultados demonstrando que em relação ao grupo normal, miR-124-5p elevado e NPY reduzido foram apresentados no grupo CUMS (ambos P < 0,05). Ao contrário, grupo anti-miR-124-5p tendeu a diminuir miR-124-5p e elevar NPY em relação ao grupo anti-miR-NC (ambos P < 0,05). Nenhuma discrepância reconhecida na expressão de miR-124-5p e NPY no grupo CUMS e grupo anti-miR-NC (ambos P > 0,05). Resultados indicaram interferência bem-sucedida do lentivírus e conexão negativa entre NPY e miR-124-5p.

Ensaio ChIP testou se HDAC1 podia ligar ao promotor de miR-124-5p, e resultados mostraram que HDAC1 estava apenas relacionado à região promotora de miR-124-5p (P < 0,001), indicando que HDAC1 pode regular diretamente miR-124-5p.

Relação de alvo entre miR-124-5p e NPY foi predita e verificada através de ferramenta RNA22 e ensaio de gene repórter de luciferase dual. Com relação a células co-transfetadas com NPY-3'UTR-WT e NC mimético, células com co-transfecção de NPY-3'UTR-WT e mimético miR-124-5p mostraram atividade de luciferase prejudicada (P < 0,05). Nenhuma diferença reconhecida na atividade de luciferase em células co-transfetadas com NPY-3'UTR-MUT e NC mimético, e células co-transfetadas com NPY-3'UTR-MUT e mimético miR-124-5p (P > 0,05).

Silenciamento de NPY Abole Efeitos Protetores de miR-124-5p Inibido em Ratos Depressivos

Depleção espontânea de NPY e miR-124-5p foi programada para explorar sua interação em ratos deprimidos. Exibiu-se que nível de expressão de NPY mais baixo foi notado no grupo anti-miR-124-5p + sh-NPY versus grupo anti-miR-124-5p + sh-NC (P < 0,05). Peso corporal e testes de função comportamental ilustraram que por comparação com grupo anti-miR-124-5p + sh-NC, ratos no grupo anti-miR-124-5p + sh-NPY apresentaram peso reduzido, SPP, frequência de cruzamento de grade, incidência de erguer-se e tempo de exploração espacial com latência de fuga aumentada (todos P < 0,05). Coloração HE de lesões hipocampais mostrou que em comparação com grupo anti-miR-124-5p + sh-NC, número de neurônios hipocampais foi reduzido, e neurônios hipocampais foram corados escuramente, esparsamente e desordenadamente arranjados em forma irregular com camadas celulares reduzidas no grupo anti-miR-124-5p + sh-NPY. Além disso, versus grupo anti-miR-124-5p + sh-NC, ratos no grupo anti-miR-124-5p + sh-NPY acompanharam redução de DA, NE e 5-HT (todos P < 0,05). Além disso, atividades de SOD e GSH prejudicadas, e níveis aumentados de MDA, IL-1β, TNF-α e NO existiram nos ratos do grupo anti-miR-124-5p + sh-NPY versus grupo anti-miR-124-5p + sh-NC (todos P < 0,05). Coletivamente, silenciamento de NPY aboliu efeitos protetores de miR-124-5p reprimido em rato deprimido.

Discussão

Depressão é um tipo de transtorno psiquiátrico compreendendo variedade de condições com sintomas diversos. Embora estudos emergentes tenham implicado papel de miRNAs na depressão, a ação precisa de miR-124-5p tem sido raramente investigada. Portanto, presente estudo é projetado para melhor compreensão do mecanismo do eixo miR-124-5p/HDAC1/NPY na depressão com resultado principal elaborando que silenciamento de HDAC1 ou miR-124-5p up-regula NPY para melhorar memória e habilidades de aprendizado de ratos deprimidos.

Para começar, este estudo descobriu expressão de HDAC1 em tecidos hipocampais com achados sugerindo elevação na expressão de HDAC1. Subsequentemente, com propósito de decifrar papéis funcionais de HDAC1 em ratos deprimidos, ensaios de perda de função foram realizados e divulgou-se que silenciamento de HDAC1 aumentou peso corporal, melhorou habilidades de aprendizado e memória, atenuou dano patológico, up-regulou expressão de neurotransmissores, e suprimiu estresse oxidativo e inflamação em ratos deprimidos. Atualmente, estudo implicou incremento na expressão de HDAC1 em fenótipos depressivos e ansiosos resultados por estresse de prole. Além disso, expressão de HDAC1 é documentada up-regular em penumbra em acidente vascular cerebral fototrombótico. Além disso, expressão incremental de mRNA HDAC1 é encontrada em células granulares e piramidais em epilepsia do lobo temporal. Quanto ao papel funcional de HDAC1, relatou-se que sobreexpressão viral de HDAC1 neuronal no hipocampo de camundongos impõe influências na perda de memória contextual de medo em particular. Mecanicamente, inibidores de HDAC revertem déficits cognitivos encontrados em doenças neurodegenerativas e perda de memória relacionada à idade. Na verdade, aceita-se que supressão de HDAC1 por tianeptina avançou neuroplasticidade e reforçou memória. Conforme mencionado em estudo prévio, conclui-se que repressão de HDAC1 inibe processos patogênicos que levam à degeneração de neurônios motores em doenças mitocondriais. Experimentalmente, silenciamento de HDAC1 por 5-tienil-substituído 2-aminobenzamida-tipo está parcialmente envolvido na prevenção de morte de células neuronais em modelos de doença de Parkinson. Apoiado por essas pesquisas, efeitos protetores de HDAC1 silenciado foram testemunhados em doenças cerebrais, incluindo mas não limitado a depressão.

Então, nosso estudo descobriu relação de alvo entre HDAC1 e miR-124-5p, suportada por estudo prévio sugerindo que transcrição de miR-124 está a cargo de EVI1, agindo por conexão com desacetilase HDAC1. miR-124-5p foi gene sobreexpresso em ratos deprimidos e silenciamento de miR-124-5p teve funções similares de HDAC1 silenciado em ratos deprimidos. De fato, há estudo indicando que expressão de miR-124 no hipocampo é up-regulada de 5 a 6 semanas em fenótipos de comportamento depressivo. Outro estudo identificou aumento na expressão de miR-124 em mulheres com transtorno de uso de cocaína. Também, previamente descrito que miR-124-3p é altamente expresso em roedores estressados em transtorno depressivo maior. Quanto aos efeitos, silenciamento de miR-124 no córtex pré-frontal é relatado atenuar comportamento depressivo de camundongos. Além disso, silenciamento de miR-124 é acreditado servir como agente antidepressivo de gipenosídeos induzidos por corticosterona crônica em camundongos. Extraído de estudo prévio, silenciamento de miR-124 pode resultar em susceptibilidade comportamental melhorada a paradigma de estresse mais brando. Relata-se que supressão de miR-124 por transfecção de lentivírus no hipocampo pode proteger neurodegeneração induzida por cetamina in vivo e in vitro. De qualquer forma, supressão de miR-124-5p é ator ativo para atenuar depressão.

Além disso, expressão de NPY foi verificada ser regulada por HDAC1 e miR-124-5p. Déficits deteriorados associados com HDAC2 na acetilação de histona podem estar relacionados à expressão diminuída de NPY e podem ser usados para controlar comportamentos ansiosos e de beber. NPY foi down-regulada em ratos deprimidos e up-regulação de NPY promoveu recuperação de habilidades de aprendizado e memória em ratos deprimidos. No desenvolvimento de comportamentos depressivos, modelos de ratos são manifestados com expressão reduzida de NPY. Academicamente, expressão de NPY é evidenciada declinar em camundongos com depressão. Consistentemente, achados do estudo acima mencionado são mesmos que literatura prévia em certa extensão.

Achados novos do estudo sugeriram que miR-124-5p inibido ou HDAC1 suprimido atenuaram habilidades de aprendizado e memória e aumentaram peso corporal de ratos deprimidos. Além disso, silenciamento de miR-124-5p ou inibição de HDAC1 suprimiu estresse oxidativo e inflamação e promoveu expressão de neurotransmissores de ratos deprimidos. Além disso, HDAC1 mediou miR-124-5p para regular NPY. Nos experimentos de resgate, silenciamento de NPY aboliu efeitos protetores de miR-124-5p inibido em ratos deprimidos.

Conclusão

Em resumo, este estudo destacou o efeito do eixo HDAC1/miR-124-5p/NPY na depressão com achados principais sugerindo miR-124-5p inibido ou HDAC1 suprimido atenuaram habilidades de aprendizado e memória, aumentaram peso corporal, suprimiram estresse oxidativo e inflamação, bem como promoveram expressão de neurotransmissores em ratos deprimidos. Eixo HDAC1/miR-124-5p/NPY pode fornecer referência para tratar transtorno neurológico, que também pode atualizar conhecimento existente sobre depressão. No entanto, estudos adicionais ainda são necessários para compreensão completa do mecanismo complexo do eixo HDAC1/miR-124-5p/NPY na depressão.