Nanopartículas de Donepezila Emulsionadas com Polissorbato-80 Direcionadas ao Cérebro: Nova Estratégia Neuroprotetora

Resumo

Tratamentos para doença de Alzheimer (DA) frequentemente falham em atingir concentrações terapêuticas no cérebro devido à barreira hematoencefálica (BHE). Projetamos uma nanopartícula de pululana modificada com colesterol (CHP) carregada com o inibidor da acetilcolinesterase donepezila (DZP) e revestimos sua superfície com polissorbato 80 (PS) para alcançar transcitose ativa da BHE. Usando espalhamento dinâmico de luz e calorimetria de titulação isotérmica, identificamos uma proporção 1:5 (p/p) DZP:CHP como ideal, resultando em alta encapsulação do fármaco (86,5%) e carga (13,4%). Estudos de liberação in vitro demonstraram liberação sustentada de DZP por 72 h. Imageamento de fluorescência in vivo em camundongos confirmou que nanopartículas revestidas com PS se acumulam preferencialmente no tecido cerebral, com deposição off-target insignificante em órgãos. Ensaios funcionais em células PC12 e SH-SY5Y pré-tratadas com Aβ25–35 revelaram que nanopartículas DZP-CHP restauraram viabilidade celular, reduziram vazamento de lactato desidrogenase (LDH), preservaram potencial de membrana mitocondrial (MMP) e inibiram apoptose mais efetivamente que DZP livre. Micro-termoferese mostrou forte ligação à ApoE (K_D = 3,6 µM), indicando transporte mediado por receptor através da BHE. Estes resultados apoiam o potencial clínico de nanopartículas DZP-CHP revestidas com PS para neuroproteção direcionada na DA.

Introdução

DA é caracterizada por declínio cognitivo progressivo e depósito de amiloide-β (Aβ). Donepezila oral convencional sofre de baixa solubilidade aquosa, baixa biodisponibilidade oral e penetração limitada na BHE, necessitando dosagem diária e comprometendo adesão do paciente. Sistemas de entrega de fármacos baseados em nanopartículas (nano-DDS) oferecem plataforma promissora para superar esses obstáculos facilitando difusão passiva e transporte mediado por receptores através da BHE. Polissorbato 80, um surfactante não-iônico, demonstrou adsorver apolipoproteínas séricas (ApoE, ApoB), mimetizando partículas de lipoproteína de baixa densidade que podem sequestrar receptores LDL em células endoteliais e atravessar a BHE. Pululana modificada com colesterol (CHP) auto-monta em nanopartículas anfifílicas com núcleo hidrofóbico adequado para encapsular fármacos lipofílicos e casca hidrofílica que reduz opsonização.

Neste estudo, combinamos CHP e PS para criar uma nanopartícula de dupla função que encapsula DZP, promove travessia da BHE e entrega níveis terapêuticos sustentados ao cérebro enquanto mitiga toxicidade de Aβ in vitro.

Materiais e Métodos

Materiais

CHP (preparado internamente), donepezila (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.), polissorbato 80 (Tianjin Fuchen Reagent Institute), corante verde indocianina (ICG) (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.), camundongos C57BL/6 pretos, Aβ25–35 (US Sigma), reagente MTT (US Sigma), kit lactato desidrogenase (LDH) (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.), kit coloração AO/EB (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.), linhagens celulares PC12 (feocromocitoma adrenal de rato) e SH-S5Y (neuroblastoma humano) (ATCC).

Preparação de Nanopartículas

Três proporções DZP:CHP (10:20, 4:20, 2:20 p/p) foram dissolvidas em meio aquoso e dialisadas (PMCO 1 kDa) para formar nanopartículas. PS (0,7 mM) foi adicionado a 10 mL de cada suspensão de nanopartículas, agitado 1 h e sonicado (100 W, pulsos de 2 s) até homogeneização. As nanopartículas PS-DZP-CHP revestidas com PS foram filtradas para remover impurezas.

Caracterização

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e microscopia eletrônica de varredura (SEM) confirmaram morfologia esférica. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) mediu tamanho e potencial zeta. Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) avaliou afinidade e cobertura de ligação do PS. Liberação in vitro foi avaliada via diálise contra PBS pH 7,4 a 37 °C, amostrando até 72 h e quantificando DZP por UV-vis (312 nm) contra curva padrão.

Direcionamento Cerebral In Vivo

Nanopartículas DZP-CHP marcadas com ICG foram preparadas por diálise de 400 mg CHP-DZP com 20 mg ICG, seguido por sonicação. Nanopartículas PS-ICG-DZP-CHP foram então formuladas como acima. Dez camundongos pretos receberam injeções intravenosas de 200 µL (200 µg/mL) de PS-ICG-DZP-CHP ou ICG-DZP-CHP. Imageamento de fluorescência (excitação 765–815 nm, emissão 815–845 nm) capturou distribuição corporal total e de órgãos 30 min pós-injeção.

Distribuição Tecidual

Quarenta e cinco camundongos C57BL/6 foram alocados nos grupos DZP livre, DZP-CHP e PS-DZP-CHP (0,25 mg/kg, IV). Sangue e órgãos (cérebro, coração, fígado, rim) foram coletados em 1, 3, 6 h. Homogeneizados foram extraídos com metanol, centrifugados e analisados por LC-MS/MS (fase móvel: água com 0,1% ácido fórmico / metanol 70:30, fluxo 0,3 mL/min). Quantificação usou monitoramento de reação múltipla (MRM) com ionização por electrospray positivo.

Modelos Celulares e Ensaios de Neuroproteção

Células PC12 e SH-S5Y foram cultivadas em DMEM + 10% FBS, semeadas a 1×10⁴ células/mL (placas de 96 poços) ou 2–3×10⁵ células/mL (outros ensaios). Aβ25–35 (20 µM) induziu neurotoxicidade. Viabilidade celular medida por MTT (490 nm). Liberação de LDH (450 nm) avaliou integridade de membrana. MMP avaliado com fluorescência de Rodamina 123. Morfologia de apoptose visualizada via coloração AO/EB.

Resultados

Caracterização de Nanopartículas

CHP sozinho formou esferas ~257 nm (zeta -2,8 mV). Carregamento de DZP aumentou tamanho ligeiramente para 260–274 nm e deslocou zeta para -5 a -9 mV, dependendo da proporção do fármaco. A formulação 1:5 DZP:CHP (DCN2) alcançou a maior encapsulação do fármaco (86,5%) e carga (13,4%). Revestimento com PS aumentou tamanho para 335 nm e zeta para -2,2 mV, confirmando modificação de superfície bem-sucedida.

Afinidade de Ligação do PS

ITC revelou afinidades de ligação do PS de 1,47×10⁵, 2,98×10⁵ e 3,67×10⁵ M⁻¹ para DCN1, DCN2, DCN3, respectivamente, com razões de cobertura de 2,65, 2,70 e 1,49 mol PS por mol de nanopartícula. Interações endotérmicas, impulsionadas por entropia, sugerem associação hidrofóbica.

Liberação In Vitro

DZP livre dissolveu rapidamente. PS-DZP-CHP liberou 35% em 6 h, 70% até 24 h e 90% a 72 h, indicando liberação sustentada. DZP-CHP não revestido liberou mais rápido, provavelmente devido a blindagem mais fraca do PS.

Direcionamento Cerebral

Imageamento de fluorescência mostrou sinal insignificante em controles de ICG livre. PS-ICG-DZP-CHP produziu fluorescência cerebral brilhante 30 min pós-injeção, com sinal mínimo em órgãos periféricos. Quantificação tecidual confirmou concentração cerebral de DZP 3-4 vezes maior para PS-DZP-CHP versus DZP livre, e pico atrasado (6 h vs 1 h) indicativo de liberação sustentada.

Ligação à ApoE

MST rendeu K_D de 3,63 µM para interação PS-ICG-CHP-ApoE, suportando transcitose mediada por receptor LDL através da BHE.

Neuroproteção em Modelos Celulares

Aβ25–35 a 20 µM reduziu viabilidade de PC12 a 49,5% e SH-S5Y a 49,7%. Pré-tratamento com DZP-CHP (5 µM, 10 µM) restaurou viabilidade a 68-75% (vs 48% com DZP livre). Liberação de LDH diminuiu 30% com DZP-CHP, e MMP permaneceu >80% do controle, enquanto DZP livre alcançou apenas ~70%. Coloração AO/EB revelou morfologia apoptótica reduzida nos grupos DZP-CHP.

Discussão

Nossas nanopartículas DZP-CHP revestidas com PS alcançaram entrega cerebral direcionada, liberação sustentada de fármaco e eficácia neuroprotetora superior in vitro. A alta afinidade do PS e adsorção de ApoE facilitam transcitose mediada por LDLR através da BHE, enquanto o núcleo CHP fornece reservatório lipofílico que reduz agregação de Aβ. Comparado à DZP livre convencional, a plataforma de nanopartículas estende intervalos de dosagem, potencialmente melhorando adesão do paciente e reduzindo efeitos colaterais. Futuros estudos in vivo focarão em farmacocinética, toxicidade e eficácia terapêutica em modelos animais de DA.

Conclusão

Nanopartículas de pululana modificada com colesterol carregadas com donepezila e revestidas na superfície com polissorbato 80 demonstram carregamento ideal do fármaco (1:5 DZP:CHP), liberação sustentada, travessia eficiente da BHE e neuroproteção aprimorada contra toxicidade induzida por Aβ. Estes achados endossam PS-DZP-CHP como nanomedicina promissora para tratamento da doença de Alzheimer.