Nanopartículas carregadas de drogas de Donepezila emulsificadas com Donepezila direcionada para o cérebro

Resumo

A maioria dos medicamentos para a doença de Alzheimer não funciona de maneira eficiente por causa da barreira hematoencefálica. Portanto, projetamos uma nova nanopreparação (PS-DZP-CHP):nanopartícula de pululano modificado com colesterol (CHP) com cobertura de superfície de polissorbato 80 (PS), como transportador de donepezila (DZP) para realizar a entrega de tecido cerebral. Por análise de tamanho e calorimetria de titulação isotérmica, escolhemos a proporção de dosagem ideal da droga com nanomateriais (1:5) e projetamos uma série de experimentos para verificar a eficácia das nanopartículas. Os resultados dos experimentos de liberação in vitro mostraram que as nanopartículas podem atingir a liberação contínua do fármaco em 72 h. Os resultados da observação de fluorescência em camundongos mostraram um bom direcionamento cerebral de nanopartículas de PS-DZP-CHP. Além disso, a nanopartícula pode aumentar a concentração da droga no tecido cerebral em camundongos. Nanopartículas de DZP-CHP foram usadas para pré-tratar células nervosas com danos à proteína Aβ. A concentração de lactato desidrogenase foi determinada por MTT, rodamina 123 e coloração AO-EB, o que provou que as nanopartículas de DZP-CHP tiveram um efeito protetor na neurotoxicidade induzida por Aβ _25-35 e eram superiores ao donepezil gratuito. O teste microtérmico do medidor de movimento perpétuo mostrou que as nanopartículas de PS-DZP-CHP têm uma afinidade com a apolipoproteína E, o que pode ser vital para que esta nanopartícula tenha como alvo o tecido cerebral.

Introdução

A DA é uma doença do sistema nervoso central com mecanismos patológicos complicados que causa disfunção cognitiva progressiva, mas é muito difícil de tratar devido à dificuldade de administração do medicamento e à baixa concentração do medicamento que pode atingir o tecido cerebral [1, 2]. A passagem do BBB tornou-se uma grande dificuldade na pesquisa do sistema de entrega de drogas (DDS) [3, 4]. A maioria dos medicamentos abre o BBB por meios biológicos, químicos ou físicos; entre eles, os métodos físicos são agora mais comumente usados clinicamente [5]. Devido aos defeitos insuperáveis na administração intracraniana de fármacos com base em tecnologia invasiva, a produção de pró-fármacos lipofílicos ou substratos de transporte ativo por meio da modificação química da superfície do fármaco tem mais vantagens [6]. Entre eles, as nanopartículas são uma das melhores escolhas para alcançar a liberação intracraniana de drogas, visando ativamente a BBB [7,8,9].

Nano-DDSs se tornaram o foco da pesquisa de segmentação cerebral e incluem nanopartículas de polímero, nanopartículas orgânicas, lipossomas, nanofibras e micelas que foram projetadas para fornecer tratamentos e diagnósticos [6, 10,11,12]. Tanto nanopartículas carregadas de drogas quanto drogas lipofílicas de pequenas moléculas podem passar pela BBB. A diferença é que as nanopartículas carregadas de drogas têm maior probabilidade de passar por difusão passiva por adsorção na parede capilar do cérebro. Além disso, os medicamentos gratuitos enfrentam uma segunda barreira, a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (B-CSF) [13]. Ao contrário de outras contrapartes de barreira, a maioria dos medicamentos são relativamente permeáveis através do LCR e se difundem no parênquima cerebral. No entanto, devido ao processo de difusão muito lento, a concentração de drogas livres no LCR é muito maior do que no parênquima cerebral, e a alta concentração no LCR causará alguma toxicidade [14, 15]. Nesse processo, as nanopartículas apresentam vantagens únicas e significativas. Se a superfície do nanocarreador for revestida com um surfactante hidrofílico, ApoE irá adsorver à superfície e o CSF pode promover o movimento das nanopartículas em direção ao parênquima cerebral através do espaço ao redor dos vasos sanguíneos [16]. Nanopartículas revestidas com o tensoativo não iônico polissorbato 80 preparado por Kreuter et al. [17] foram os primeiros medicamentos administrados com sucesso ao sistema cerebral e transportados via adsorção da proteína sérica ApoE no plasma. Portanto, a modificação do polissorbato 80 na superfície das nanopartículas para formar um composto específico do fármaco permite o direcionamento do fármaco e do reconhecimento do receptor BBB endógeno, aumentando muito a biodisponibilidade dos fármacos [18,19,20].

Atualmente, o inibidor da acetilcolinesterase (AChE) donepezil (DZP) é comumente usado para o tratamento de DA moderada, mas devido à sua solubilidade em gordura, baixa dissolução in vivo e baixa biodisponibilidade oral, os comprimidos convencionais de donepezila devem ser tomados diariamente para manter o efeito terapêutico [21, 22]. Como a capacidade cognitiva dos pacientes com DA está gravemente prejudicada, o que causa grande inconveniente na manutenção de um esquema de medicação, o desenvolvimento de uma preparação de DZP de liberação sustentada de ação prolongada é urgente. A hipótese da cascata amilóide sugere que a causa da DA é a deposição de placas amilóides ao redor do parênquima cerebral e nas paredes cerebrovasculares. Um grande número de manchas difusas também são observadas em áreas do cérebro, que são compostas por depósitos de Aβ extracelulares amorfos, altamente fibróticos e insolúveis [23, 24]. Boridy et al. descobriram que nanopartículas de polissacarídeo de pululano que são atóxicas e facilmente degradáveis podem formar um complexo com a proteína Aβ e prevenir efetivamente a agregação de proteínas e podem ser rapidamente eliminadas das células para inibir a toxicidade celular [25]. Pullulan hidrofobicamente modificado com colesterol (CHP) é uma substância anfifílica que pode se auto-montar em uma nanoestrutura com um núcleo hidrofóbico e uma camada hidrofílica de cadeia de açúcar em uma solução aquosa [26, 27]. Ao mesmo tempo, as nanopartículas de CHP podem adsorver a proteína Aβ para evitar sua deposição e agregação, desempenhando um papel sinérgico. Como um nanocarreador, o CHP tem superioridade significativa.

Com base no conhecimento acima, a equipe de pesquisa projetou uma nanopreparação DZP-CHP no estágio inicial e determinou a proporção de dosagem ideal do medicamento para o nanocarreador. Em seguida, o polissorbato foi adsorvido na superfície das nanopartículas para direcionar ativamente a passagem através do BBB para alcançar o enriquecimento do cérebro. Neste estudo, uma série de nanossoluções DZP-CHP foram caracterizadas, e o processo de liberação do fármaco in vitro foi explorado e estudado. Depois que as nanopartículas foram preparadas com sucesso, Aβ25-35 foi usado para induzir danos às células nervosas para estabelecer um modelo de célula AD [28, 29]. Em seguida, o efeito protetor da nanossolução DZP-CHP foi investigado em modelos de células PC12 e SH-SY5Y.

Materiais e métodos

Materiais

Os seguintes foram usados:pululano hidrofobicamente modificado com colesterol (caseiro) [30]; donepezil (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.); polissorbato 80 (Tianjin Fuchen Reagent Institute); corante verde de indocianina (ICG) (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.); polissorbato 80 (Tween 80, PS) (Tianjin Fuchen Reagent Office); ratos pretos (Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.); Aβ25-35 (US Sigma); sal de tetrametilazozole (MTT) (US Sigma); soro bovino recém-nascido (U.S. Gibco); kit de lactato desidrogenase (LDH) (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.); Kit de fluorescência de dupla coloração AO / EB (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); e células PC12 (células de feocromocitoma adrenal de rato) obtidas do Departamento de Neurologia, Segundo Hospital Xiangya, Central South University. As células SH-SY5Y (células de neuroblastoma da medula óssea humana) foram adquiridas no ATCC Cell Bank (Manassas, VA, EUA).

Preparação de Nanopartículas

Três tipos de nanopartículas com diferentes proporções DZP e CHP (w / w) (10:20, 4:20 e 2:20) foram preparadas com sucesso primeiro por meio de diálise com água de acordo com métodos relatados na literatura [31]. Uma certa concentração de nanopartículas de DZP-CHP foi adicionada a um copo com um volume constante de 10 mL e, em seguida, aspirada para outro copo contendo o emulsionante polissorbato 80 (PS) (concentração 0,7 mmol) para sedimentar por 1 h. A mistura foi então colocada em um tubo EP e sonicada por 3 min (potência de saída 100 W, modo de trabalho de pulso intermitente:largura de pulso 2,0 s, tempo intermitente 2,0 s). A operação foi repetida três vezes até que uma dispersão uniforme fosse obtida [32]. Nanopartículas carregadas com o fármaco de donepezil emulsionado polissorbato 80 (PS-DZP-CHP) foram finalmente obtidas após as impurezas serem removidas por meio de filtração.

Caracterização de Nanopartículas

Morfologia da nanopartícula

A forma, morfologia da superfície e tamanho das nanopartículas de DZP-CHP (DCPs) com razões DZP para CHP de 1:2, 1:5 e 1:10 foram analisados com um microscópio eletrônico de transmissão Tecnai F20. Uma gota de nanopartículas de CHP, DZP-CHP e PS-DZP-CHP foi colocada em uma malha de cobre revestida com carbono para formar um filme líquido fino. Então, solução de ácido fosfotúngstico 2% (p / v) foi usada para obter coloração negativa da amostra após secagem natural do filme. A solução de nanopartículas aquosas preparadas de fresco foi adicionada gota a gota a uma pastilha de silício limpa, seca à temperatura ambiente e, em seguida, colocada sob um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo JSM-6700F para observar a estrutura da superfície.

Tamanho da nanopartícula e potencial Zeta

O tamanho, coeficiente de polidispersidade (PDI) e potencial zeta de nanopartículas de DZP-CHP e PS-DZP-CHP foram analisados usando espalhamento dinâmico de luz (DLS). O tamanho médio de partícula e a distribuição de tamanho da suspensão homogênea obtida foram medidos três vezes cada.

Liberação de droga in vitro

A liberação de donepezil foi medida usando diálise dinâmica de água. Um miligrama de nanopartículas de DZP-CHP e PS-DZP-CHP foi dissolvido em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4, concentração 0,01 M) e depois transferido para um saco de diálise, que foi mantido na mesma solução a um temperatura constante de 37 ° C com agitação magnética. Quatro mililitros de PBS a 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 e 72 h foram diluídos com o mesmo volume de PBS com o mesmo pH. Espectrofotometria ultravioleta-visível foi usada para detectar a absorbância do dialisado em 312 nm em momentos diferentes; o conteúdo da solução foi determinado com uma curva padrão e o teste de liberação foi repetido três vezes in vitro. A porcentagem de liberação de donepezil foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:
$$ Q \% ={{(C {\ text {n}} \ vezes V + V {\ text {n}} \ sum \ nolimits _ {{{\ text {t}} ={0}}} ^ { {\ text {n}}} {{\ text {Ci}}})} \ mathord {\ left / {\ vphantom {{(C {\ text {n}} \ vezes V + V {\ text {n} } \ sum \ nolimits _ {{{\ text {t}} ={0}}} ^ {{\ text {n}}} {{\ text {Ci}}})} {(WNP \ vezes LC \%} }} \ right. \ kern- \ nulldelimiterspace} {(WNP \ times LC \%}}) $$
Cn é a concentração da amostra no ponto de tempo Tn, μg / mL; V é o volume total da solução de liberação de PBS, mL; Vn é o volume de líquido de liberação de PBS no ponto de tempo Ti, mL; e Ci é a concentração de donepezila no ponto de tempo Ti, μg / mL.

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC)

Uma certa concentração de solução de PS foi gotejada em soluções de nanopartículas de CHP, e as mudanças no calor foram medidas com ITC (vip-itc, Microcal, Northampton, MA, EUA). A solução de nanopartículas de CHP incluiu três tipos de nanopartículas com diferentes razões DZP-para-CHP (1:2, 1:5 e 1:10). Todas as soluções foram desgaseificadas antes da titulação. A temperatura de todo o sistema foi mantida constante a 25 ° C.

Experimentos com animais para observar a segmentação do cérebro

Preparação de nanopartículas CHP de Donepezil marcadas com ICG

Quatrocentos miligramas de CHP-DZP e 20 mg de ICG foram pesados usando uma balança analítica e uma quantidade apropriada de DMSO foi adicionada para misturar e dissolver completamente. Em seguida, a solução obtida acima foi adicionada gota a gota à bolsa de diálise com uma pipeta, e a água destilada foi reposta a cada hora. Três horas depois, a água destilada foi substituída a cada 2 h, e 400–800 mL de água destilada foram adicionados a cada 48 h até que o DMSO fosse dialisado completamente. A seguir, a solução acima foi transferida com uma pipeta para um frasco volumétrico para obtenção de um volume constante e tratada com ultrassom por 2 min. A filtração através de uma membrana de filtro de 0,45 μm resultou em nanopartículas DZP-CHP marcadas com ICG (ICG-DZP-CHP), que foram embaladas separadamente e armazenadas em um refrigerador a 4 ° C para uso futuro.

Preparação de Nanopartículas CHP de Donepezila Fluorescente Emulsificada

Uma quantidade apropriada de ICG-DZP-CHP foi colocada em um béquer de 10 mL, e 1 ‰ (v / v) polissorbato 80 (PS) emulsionante foi adicionado. O copo foi mantido por 1 h e, em seguida, transferido para um tubo de EP para ultrassom por 2 min a 100 W. A operação acima foi repetida três vezes até que uma nanossolução uniforme fosse obtida. Finalmente, nanopartículas carregadas com o fármaco de donepezil emulsionado e filtrado e rotulado com ICG foram obtidas (PS-ICG-DZP-CHP).

Experimentos de MST para verificar a ligação do APOE às nanopartículas

Todos os experimentos de MST foram realizados em um sistema Monolith NT.115 (201810-BR-N024). Todas as soluções foram preparadas com água desionizada e reagentes de grau analítico. Os tampões foram preparados e armazenados à temperatura ambiente. As amostras de proteínas foram mantidas em gelo até o uso [33]. Nanopartículas de PS-ICG-CHP (55,6 μM) foram diluídas para 40 nM com água desionizada e ICG foi carregado para fluorescência. A solução de APOE (30 μl, 55,6 μM) foi preparada e 16 tubos capilares foram rotulados de 1 a 16; primeiro, 20 μl de APOE foram adicionados ao tubo 1 e 10 μl foram adicionados aos tubos 2 a 16. Em seguida, 10 μl de solução foram transferidos do tubo 1 para o tubo 2 e bem misturados. Em seguida, 10 μl de solução foram removidos do tubo 2 e transferidos para o tubo 3. Essa operação foi repetida até que 10 μL de solução fossem finalmente removidos do tubo 16 para garantir que a solução em cada tubo tivesse o mesmo volume. Dez microlitros de nanopartículas diluídas foram adicionados a cada tubo e misturados completamente para iniciar a medição. Os dados do teste MST foram analisados com o software de análise NT, e o ajuste KD foi realizado de acordo com a lei de ação de massa seguindo as instruções do software.

Tecnologia de Imagem de Fluorescência In Vivo para Observação Cerebral

Um lote de camundongos pretos saudáveis pesando aproximadamente 18–22 g cada foi escolhido e dividido aleatoriamente em 2 grupos:o grupo PS-ICG-DZP-CHP e o grupo ICG-DZP-CHP. Cada camundongo foi injetado com 200 μl de 200 μg / ml dos medicamentos do grupo acima pela veia da cauda e, 0,5 h depois, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico a 1% (50 mg / kg). Depois disso, todos os camundongos foram colocados na área de fotografia do imageador ao vivo com os parâmetros de imagem definidos para um comprimento de onda de excitação de 765 nm-815 nm e um comprimento de onda de absorção de 815 nm-845 nm para obter uma imagem de fluorescência de todo o animal . Após as imagens, todos os camundongos foram dissecados e o rim, coração, baço, pulmão, fígado e cérebro foram removidos para obter imagens de fluorescência. Os parâmetros de imagem foram consistentes com os descritos acima.

Estudo sobre distribuição de nanopartículas em tecidos

Agrupamento e amostragem de camundongos

Quarenta e cinco camundongos C57BL / 6 foram divididos aleatoriamente em 15 grupos:5 grupos foram injetados com donepezil livre (grupo livre), 5 com nanopartículas de donepezil (grupo nano) e outros 5 com nanopartículas de donepezil modificado com PS (grupo PS) em 0,25 mg / kg pela cauda da veia. Em seguida, o sangue foi coletado 1 hora, 3 horas e 6 horas após a injeção. Depois disso, todos os animais foram sacrificados, e os tecidos do coração, cérebro, fígado e rim foram coletados e triturados. Em seguida, 0,2 g do tecido acima foi pesado com precisão e adicionado a aproximadamente 1 ml de solução de NaCl a 0,9% e homogeneizado com um homogeneizador (65 Hz, 150 s). Cem microlitros de homogenato de tecido foram retirados com precisão em um tubo EP de 1,5 mL com 0,7 mL de metanol, agitado em vórtice para misturar por 30 s para precipitação de proteína e, em seguida, centrifugado a 12.000 r · min ⁻¹ por 10 min. Finalmente, 100 μL de sobrenadante foram transferidos para um frasco de injeção para análise.

Método de determinação

HPLC foi usado pela primeira vez para exame, mas a sensibilidade não era suficientemente alta. Portanto, experimentos de LC-MS de acompanhamento foram realizados, os quais mostraram forte especificidade e nenhuma substância endógena interferindo na determinação do fármaco. O protocolo LC – MS está em conformidade com as diretrizes para a determinação de amostras biológicas. As condições cromatográficas foram as seguintes:fase móvel A, água (contendo 0,1% de ácido fórmico); fase móvel B, metanol (contendo 0,1% de ácido fórmico); eluição isocrática:A30% -B70%; taxa de fluxo, 0,3 mL · min ⁻¹ ; temperatura da coluna, 35 ° C; volume de injeção, 10 μL. As condições de colisão foram as seguintes:temperatura da fonte de ionização por eletrospray (ESI), 150 ° C; taxa de fluxo do gás de desolação, 550 L · h ⁻¹ ; temperatura do gás de desolação, 500 ° C. As condições para detecção de íons positivos foram as seguintes:voltagem capilar, 3 kV; voltagem do cone, 30 V; modo de varredura, monitoramento de reação múltipla (MRM).

Experiências com células

Cultura de células e passagem

As células PC12 e SH-SY5Y foram cultivadas em DMEM de alto teor de açúcar suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) e 1% (v / v) de penicilina e estreptomicina e, em seguida, mantidas em uma incubadora contendo 5 % CO ₂ a 37 ° C. As células foram usadas em vários experimentos ou passadas assim que atingiram 80% de confluência. Antes dos experimentos, as células PC12 e SH-SY5Y foram semeadas em placas pré-revestidas com colágeno tipo I na densidade celular necessária de acordo com a escala experimental.

Criopreservação celular

Quando observado para crescer até a fase log sob um microscópio, as células PC12 e SH-SY5Y foram congeladas e lavadas duas vezes com PBS, tripsinizadas para formar uma suspensão de células e colocadas em um tubo de centrífuga estéril para coleta por centrifugação (1000 r × min ^{- 1} , 3 min). Em seguida, foi adicionada solução de criopreservação celular, e as células foram mantidas em tubo com o nome da célula e a data marcados. As células foram colocadas em um refrigerador a 4 ° C por 1 h, -20 ° C por 2 h, -80 ° C (congeladas) durante a noite e finalmente transferidas para um tanque de nitrogênio líquido.

Método MTT para detectar a taxa de sobrevivência celular

A viabilidade celular foi medida usando um ensaio de redução de MTT. Resumidamente, as células PC12 e SH-SY5Y foram semeadas em placas de 96 poços (pré-revestidas com colágeno tipo I) a uma densidade de 1 × 10 ⁴ células / mL para permitir que as células adiram a cada poço. Após incubação por 24 h, as células foram pré-incubadas com diferentes concentrações de nanossolução CHP de donepezil ou solução de donepezil livre por 2 h. Posteriormente, Aβ25-35 (concentração final de 20 μM) foi adicionado a cada poço. A placa de 96 poços tratada foi incubada a 37 ° C durante 24 h. Depois disso, MTT (50 μL, 5 mg / mL) foi adicionado e incubado com as células tratadas a 37 ° C por 4 h. Por fim, o meio foi removido com cuidado e os cristais de formazan foram dissolvidos em 150 μL de DMSO. A absorbância foi obtida a 490 nm em leitor de microplacas. A viabilidade celular é expressa como a porcentagem de células vivas no grupo tratado e a porcentagem de células vivas no grupo de controle não tratado.

Determinação da atividade de LDH no sobrenadante celular

As células PC12 e SH-SY5Y foram semeadas em placas de cultura de 96 poços (pré-revestidas com colágeno tipo I) em densidades de 2 × 10 ⁵ e 3 × 10 ⁵ células / mL, respectivamente. Após incubação por 24 h, as células foram pré-incubadas com diferentes concentrações de nanossolução CHP de donepezil ou solução de donepezil livre por 2 h. Posteriormente, Aβ25-35 (concentração final de 20 μM) foi adicionado a cada poço. A atividade de LDH foi medida de acordo com as instruções fornecidas pelo kit. Resumidamente, as células cultivadas com meio foram coletadas e, em seguida, centrifugadas a 3500 rpm. O sobrenadante (50 μL) foi misturado com igual volume de reagente para iniciar a reação de LDH. A absorbância foi obtida a 450 nm usando um leitor de microplacas e a atividade da LDH foi calculada.

Método de coloração AO / EB para observar a morfologia de apoptose

O corante fluorescente AO / EB foi usado para avaliar as características das células apoptóticas. As células PC12 e SH-SY5Y foram semeadas em placas de cultura pretas de 12 poços (pré-revestidas com colágeno tipo I) em densidades de 3 × 10 ⁵ e 4 × 10 ⁵ células / poço, respectivamente. Após incubação por 24 h, as células foram pré-incubadas com diferentes concentrações de nanossolução CHP de donepezil ou solução de donepezil livre por 2 h. Posteriormente, Aβ25-35 (concentração final de 20 μM) foi adicionado a cada poço. Após o tratamento, as operações foram realizadas de acordo com o kit. A luz foi evitada durante todo o experimento. Finalmente, a morfologia celular foi observada.

Método de coloração com rodamina 123 para detecção do potencial da membrana mitocondrial

O MMP foi medido usando o corante fluorescente rodamina 123 (Rh123), um corante catiônico permeável às células que é preferencialmente distribuído nas mitocôndrias devido às suas propriedades altamente negativas. As células PC12 e SH-SY5Y foram semeadas em placas de cultura pretas de 24 poços (pré-revestidas com colágeno tipo I) em densidades de 2 × 10 ⁵ e 3 × 10 ⁵ células / poço, respectivamente. Após incubação por 24 h, as células foram pré-incubadas com diferentes concentrações de nanossolução CHP de donepezil ou solução de donepezil livre por 2 h. Posteriormente, Aβ25-35 (concentração final de 20 μM) foi adicionado a cada poço. Após o tratamento, as células foram lavadas com PBS e incubadas com 10 μg / mL de rodamina 123 por 30 min no escuro a 37 ° C. Após a incubação, as células foram lavadas 3 vezes com PBS, e a intensidade de fluorescência foi medida a 488 nm e 510 nm usando um leitor de placa de fluorescência.

Processamento Estatístico e Análise de Dados

Todas as experiências foram repetidas três vezes e os resultados são expressos como média ± desvio padrão. O software estatístico GraphPad Prism foi usado e ANOVA unilateral, Student's t teste e outros métodos foram usados para análise estatística. P <0,05 indica que a diferença é estatisticamente significativa.

Resultados

Características das nanopartículas

O CHP se autoagrega para formar nanopartículas com núcleos hidrofóbicos, que podem ser carregados com DZP. Nanopartículas de CHP carregadas com DZP (DCNs) com proporções de fármaco para nanomateriais de 1:2, 1:5 e 1:10 foram denominadas DCN1, DCN2 e DCN3. De acordo com os resultados da microscopia eletrônica de varredura, as nanopartículas de CHP mostraram uma estrutura esférica e, após o carregamento de DZP, as DCNs também eram esféricas, como mostrado na Fig. 1. O tamanho médio e o potencial zeta das nanopartículas de CHP foram 257 ± 3,05 nm e - 2,81 ± 0,27 mV, respectivamente. Após o carregamento de DZP, os tamanhos médios foram 273 ± 3,72, 260,7 ± 1,76 e 266,8 ± 4,56 nm, e os potenciais zeta foram -6,20 ± 0,40, - 5,75 ± 0,64 e -9,30 ± 0,39 mV para DCN1, DCN2 e DCN3, respectivamente , conforme mostrado na Tabela 1. As porcentagens de aprisionamento de droga foram 42,00 ± 5,65%, 86,54 ± 1,31% e 59,71 ± 4,43%, e as porcentagens de carga de droga foram 12,02 ± 1,90%, 13,42 ± 2,03% e 7,40 ± 1,72%, respectivamente.

Imagens de microscopia eletrônica de varredura ( a , a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3), distribuição de tamanho ( b a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) e potencial zeta ( c a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) de nanopartículas

Medição ITC

Para DCNs, durante todo o processo de reação, a reação mostrou principalmente um pico para cima (Fig. 2), e a reação era endotérmica porque o pico para cima indica uma reação de liberação de calor. Portanto, o PS pode ser adsorvido espontaneamente na superfície DCN. A afinidade de PS era (14,7 ± 2,76) × 10 ⁴ M ⁻¹ , (29,8 ± 1,66) × 10 ⁴ M ⁻¹ e (36,7 ± 3,84) × 10 ⁴ M ⁻¹ , e o grau de cobertura de PS foi 2,65 ± 0,193, 2,70 ± 0,372 e 1,49 ± 0,434 para DCN1, DCN2 e DCN3, respectivamente. Este resultado indica que o PS adsorveu à superfície DCN com uma alta afinidade e teve uma quantidade de cobertura maior no DCN2. ∆H > 0 e ∆S > 0 indica que as três partículas foram principalmente ligadas por meio de interações hidrofóbicas com PS.

Dados de calorimetria isotérmica para titulação PS (0,9 mM) em a DCN1, b DCN2 e c Soluções de DCN3 (0,02 mM) a 25 ° C. Grau de cobertura, afinidade (KA) e alterações de entalpia e entropia para ligação de PS com nanopartículas (NPs) após titulação em soluções de NP

Caracterização dos três tipos de nanopartículas

Os CHP NPs e DCNs preparados por diálise mostraram uma forma esférica uniforme (Fig. 3a). De acordo com o estudo acima, escolhemos as nanopartículas de DZP-CHP com uma proporção de droga para nanomateriais de 1:5 como os sujeitos do seguinte experimento. As nanopartículas de DZP-CHP tinham um tamanho de partícula relativamente uniforme de 260,7 ± 1,76 nm e o índice de dispersão foi de 0,196 ± 0,019. Embora o tamanho de partícula tenha permanecido relativamente estável após o carregamento da droga, aumentou acentuadamente para 335,2 ± 5,46 nm após a adsorção de PS. O potencial zeta das nanopartículas de DZP-CHP era - 0,66 ± 0,04 mV, e após o revestimento com polissorbato 80, o potencial zeta caiu para - 2,22 ± 0,86 mV (Fig. 3b).

Caracterização de diferentes nanopartículas. a uma fotografia de microscopia eletrônica de transmissão de NPs CHP, b fotografia de microscopia eletrônica de transmissão de NPs DZP-CHP, c fotografia de microscopia eletrônica de transmissão de PS-DZP-CHP NPs. B:Diagrama de tamanho de partícula e diagrama de potencial zeta de CHP-DZP NPs (proporção de alimentação 1:5) e DZP-CHP NPs modificados com polissorbato 80 (proporção de alimentação 1:5)

Liberação de droga in vitro de nanopartículas

Os resultados mostraram que, em comparação com o donepezil livre, os NPs DZP-CHP e PS-DZP-CHP NPs liberaram DZP por 72 h com efeitos de liberação controlada óbvios. A taxa de liberação rápida precoce de nanopartículas carregadas com fármaco pode ser devido à rápida dissolução e liberação de moléculas de fármaco e, então, a desaceleração pode ser causada pela diminuição na concentração do fármaco, que só pode ser afetada pela dissolução e difusão. A liberação de droga in vitro de NPs DZP-CHP revestidos e não revestidos com polissorbato 80 foi então estudada. A razão para a liberação mais lenta de PS-DZP-CHP NPs pode ser devido à forte adsorção de polissorbato 80 a pequenas drogas moleculares hidrofóbicas (Fig. 4).

Curvas de liberação de droga in vitro para DZP, DZP-CHP NPs (1:5) e PS-DZP-CHP NPs

Efeito de direcionamento do cérebro de nanopartículas

Observação de segmentação cerebral usando tecnologia de imagem de fluorescência ao vivo

Os cérebros de camundongos injetados com ICG livre não mostraram fluorescência, mas os cérebros injetados com nanopartículas emulsionadas com PS apresentaram fluorescência mais forte no cérebro do que aqueles injetados com nanopartículas não emulsificadas porque ambas as nanopartículas foram capazes de atingir o cérebro após a injeção através da veia da cauda (Fig. . 5a). Para verificar isso, dissecamos os camundongos 30 minutos após a injeção intravenosa das soluções ICG-DZP-CHP e PS-ICG-DZP-CHP, removemos todos os órgãos necessários para o estudo e, em seguida, realizamos imagens de fluorescência. As nanopartículas de PS-ICG-DZP-CHP apresentaram forte fluorescência no cérebro, mas nenhuma foi observada em outros órgãos (Fig. 5b). As imagens mostraram que as nanopartículas modificadas com PS apresentaram a fluorescência mais forte no tecido cerebral, enquanto as não modificadas apresentaram fluorescência fraca. Nenhuma fluorescência foi observada no tecido cerebral de camundongos injetados com ICG livre (Fig. 5c).

Imagens de fluorescência in vivo após diferentes soluções foram injetadas através da veia da cauda. a Imagens de fluorescência de animais inteiros injetados através da veia da cauda com 200 μg / ml de nanopartículas de DZP-CHP ou PS-DZP-CHP carregadas com ICG como uma coloração. uma solução ICG grátis (intensidade de fluorescência × 10 ⁹ ), b Nanopartículas ICG-DZP-CHP (intensidade de fluorescência × 10 ⁷ ), c Nanopartículas ICG-DZP-CHP modificadas por PS (intensidade de fluorescência × 109). b Imagens de fluorescência de vários órgãos após injeção de nanopartículas de DZP-CHP modificadas por PS através da veia da cauda. c Imagens de fluorescência do cérebro após a dissecção. d Cérebro de camundongos injetados com nanopartículas de ICG-PS-DZP-CHP, e brain of mice injected with ICG-DZP-CHP nanoparticles modified with PS, f brain of mice injected with free ICG

Tissue Distribution of Nanoparticles in Mice

Donepezil was distributed in various tissues and mainly in the brain after injection of PS-DZP-CHP nanoparticles. Because it is metabolized through the kidney, the concentration of donepezil is very high in the kidney at certain times (Fig. 6a). In the brain, the concentration of free donepezil reached a peak in a very short time and then decreased rapidly. However, the concentration of donepezil nanoparticles reached a peak much more slowly and then decreased, especially nanoparticles modified with PS, which indicates a sustained-release effect with a delayed peak and prolonged retention time. Obviously, the nanoparticles improved the bioavailability of the drug (Fig. 6b).

a The concentration of donepezil in the brain, heart, liver and kidney at different times. b The concentrations of free DZP, DZP-CHP nanosolution and DZP-CHP nanosolution modified with PS in brain tissue at different times

MST Results

MST results showed that the thermal surge changed regularly with increasing ligand concentration, and the K_D value was 3.63 μM, indicating that the ligand effectively binds to the target protein, which verifies that PS can bind to Apo E and is relatively stable. After surface modification with PS, CHP nanoparticles can promote adsorption of Apo E, theoretically confirming that the nanoparticles we designed can specifically target brain tissue because the nanoparticles adsorbed Apo E, which may mediate passage through the blood–brain barrier (Fig. 7).

a Raw MST data. The fluorescently labeled molecules were observed for 5 s. At this time, the infrared laser was turned on, and a small part of the capillary tube was heated to 2–5 °C. The molecules migrated along a thermal gradient, resulting in changes in fluorescence intensity. When the infrared laser is turned off, the molecules diffuse along the concentration gradient. b The binding curve is generated by the difference between the initial fluorescence intensity and the intensity in the presence of heat, and the curve conforms to the standard 1:1 binding model

Establishment of a Nerve Injury Model Induced by Aβ_25–35

MTT tests were used to detect the effect of different concentrations of Aβ25-35 on the activity of PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 8a (i), Fig. 8b (i)], and the results showed that with increasing Aβ_25–35 concentration, PC12 and SH-SY5Y cell proliferation activity gradually decreased compared with that in the normal control group. When PC12 and SH-SY5Y cells were treated with 20 μM Aβ_25–35 , PC12 cell activity decreased to 49.5 ± 3.3% that observed in the control group (P < 0.01), and SH-SY5Y cell activity decreased to 49.7 ± 0.8% (P < 0.01). An LDH kit was used to detect the effect of different concentrations of Aβ_25–35 on LDH activity in both cell supernatants. Colorimetric tests showed that activity in both supernatants increased gradually with increasing Aβ25–35 concentration. After treatment of the cells with 20 μM Aβ_25–35 , PC12 cell LDH release increased to 359.3 ± 18.3% that in the control group (P < 0.01), and SH-SY5Y cell LDH release increased to 360.0 ± 18.2% (P < 0.01). Rhodamine 123 staining was used to detect the effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on the mitochondrial membrane potential in both cell lines [Fig. 8a (ii), b (ii)]. The test showed that the mitochondrial membrane potential in both cell lines decreased gradually with increasing Aβ_{25– 35} concentration (5, 10, 20, 40 μmol/L). Treatment of the cells with 20 μM Aβ_25–35 decreased the PC12 cell mitochondrial membrane potential to 51.3 ± 1.6% that in the control group (P < 0.01); for SH-SY5Y cells, the MMP decreased to 47.9 ± 1.7% that in the control group (P < 0.01).

Effects of different concentrations of Aβ_25–35 on injury to PC12 and SH-SY5Y cells. a , b The effect of different concentrations of Aβ_25–35 on the cell survival rate, LDH activity and cell mitochondrial membrane potential in PC12 cells and SH-SY5Y cells (*P < 0.05, ** P < 0.01 vs control group). c The effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on damage to the morphology of PC12 cells:a control group, b Aβ_{25– 35} (5 μM) injury group, c Aβ_{25– 35} (10 μM) injury group, d Aβ_{25– 35} (20 μM) injury group, e Aβ_{25– 35} (40 μM) injury group. D:the effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on injury to the morphology of SH-SY5Y cells:f—control group, g Aβ_{25– 35} (5 μM) injury group, h—Aβ_{25– 35} (10 μM) injury group, i—Aβ_{25– 35} (20 μM) injury group, j—Aβ_{25– 35} (40 μM) injury group

Inverted fluorescence microscopy was used to observe morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells injured by different concentrations of Aβ_{25– 35} (Fig. 8c, d). The PC12 and SH-SY5Y cells in the control group had higher density, fusiform shapes, fuller cell bodies and longer protrusions. As the concentration of Aβ_{25– 35} increased (5, 10, 20, 40 μmol/L), the number of cells in both cell lines gradually decreased, the cell bodies shrank slightly, and the protrusions began to shrink sharply. When the concentration of Aβ_{25– 35} was increased to 40 μmol/L, the protrusions broke significantly, most of the cells contracted sharply, their shape became irregular, and some cells detached and became suspended in the solution.

Therefore, we treated PC12 and SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h to establish a nerve injury model.

Neuroprotective Effect of Drug-Loaded Nanoparticles (DZP-CHP)

MTT assays were used to detect the activity of different concentrations of DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) in PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 9a (i), b(i)]. Tests showed that treatment of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.4 ± 2.8% that in the control group (P < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) solutions, the viability of PC12 cells increased significantly. The viability of PC12 cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0,05). Similarly, treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ_{25– 35} alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.5 ± 4.0% that in the control group (P < 0.01), while after pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (2.5 μM, 5 μM, 10 μM, respectively), the viability of SH-SY5Y cells increased significantly. The viability of SH-SY5Y cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0,05).

Effect of DZP-CHP on Aβ25-35-injured PC12 and SH-SY5Y cells. a e b The effects of DZP-CHP on the cell survival rate, LDH activity, and mitochondrial membrane potential of PC12 and SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35 (#P < 0.05, ## P < 0.01 vs Aβ25-35 group; ▲ P < 0.05 vs DZP group). c The effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of PC12 cells injured by Aβ25-35; a—control group, b—Aβ25-35 injury group, c—DZP (5 µM), d—DZP -CHP (5 µM), e—DZP (10 µM), f—DZP-CHP (10 µM). D:the effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35; g—control group, h—Aβ25-35 injury group, i—DZP (5 µM), j—DZP-CHP (5 µM), k—DZP (10 µM), l—DZP-CHP (10 µM). E:red/green fluorescence ratio

LDH kits were used to detect the effects of different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) on the release of LDH from PC12 and SH-SY5Y cells into the culture medium [Fig. 9a (ii), b (ii)]. Colorimetric measurements showed that the release of LDH from PC12 cells that were exposed to 20 μM Aβ25-35 alone increased significantly by 355.1 ± 16.6% (P < 0.01). In the presence of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from PC12 cells dropped significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P < 0.01). Similarly, the release of LDH from SH-SY5Y cells exposed to 20 μM Aβ25-35 increased significantly to 357.8 ± 12.5% (P < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from SH-SY5Y cells decreased significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0,05).

According to previous reports, depolarization of the MMP leads to loss of Rh123 from mitochondria, which in turn leads to a decline in intracellular fluorescence. Therefore, to characterize changes in the mitochondrial membrane potential in PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35, DZP, and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), rhodamine 123 was used for detection [Fig. 9a (iii), b (iii)]. The results showed that the fluorescence intensity of rhodamine 123 decreased significantly to 44.3 ± 3.8% (P < 0.01) after incubation of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM) solutions resulted in a significant increase in fluorescence intensity in a dose-dependent manner, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0,05). Similarly, after treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h, the fluorescence intensity of rhodamine 123 significantly decreased to 42.5 ± 4.6% (P < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), the fluorescence intensity increased significantly, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group.

An AO-EB double staining kit was used to detect morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells treated with different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) (Fig. 9c, d). After AO-EB double staining, the nuclei of living cells presented green fluorescence under a fluorescence, and the fluorescence of apoptotic cells was orange-red; the higher the degree of apoptosis is, the brighter the fluorescence. Compared with the untreated control group, PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35 alone showed typical apoptotic characteristics, such as highly condensed and broken nuclei and obvious cell injury. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (5 μM and 10 μM) significantly inhibited cell damage and improved cell morphology.

Discussion

Although nanoparticles have been shown to be an effective delivery medium for nervous system diseases, the complexity of their structure and performance makes it challenging to detect and evaluate their physical–chemical properties and biological safety [34,35,36]. Therefore, after nanodrugs are designed, experiments to verify the safety and effectiveness of the nanomaterials at the cell and animal levels are extremely necessary. In the early laboratory stage, PS-DZP-CHP nanoparticles were successfully synthesized, and the optimal dosing ratio of the drug to CHP was set at 1:5. Due to the stable adsorption of PS to apolipoproteins ApoB and ApoE, brain targeting of nanoparticles can be achieved by permeation through the BBB [37]. The expected goal is that nanoparticles begin to decompose after reaching the brain; DZP is released and increases the concentration of cholinesterase; CHP reduces Aβ protein deposition and improves the brain environment; and administration frequency decreases because of the sustained release from nanoparticles [38,39,40,41].

Therefore, this study conducted an in vitro drug release test to assess the sustained release effect of nanoparticles. Compared with free DZP, nanoparticles achieved local sustained release in the brain, and PS can adsorb plasma proteins and reduce the loss of nanoparticles and prolong the release time to achieve a long cycle. After injection of ICG-labeled DZP-CHP and PS-DZP-CHP nanoparticles into rats, emulsified nanoparticles showed stronger fluorescence in the brain than those not emulsified with Tween 80. After organ biopsy, fluorescence imaging of various organs revealed that only the brain presented strong fluorescence, while other organs did not, indicating that nanoparticles did not release the drug until they reached the brain, which met the expected goal. In addition, nanoparticles modified with polysorbate 80 adsorbed ApoE to the surface and simulated low-density lipoprotein to bind to lipoprotein receptors on the surface of endothelial cells and enter the brain through LDLR induction [42, 43]. Moreover, the mechanisms by which nanoparticles regulate the tight junctions between endothelial cells and the inhibition of P-glycoprotein may produce a synergistic effect on their transcellular transport into the brain parenchyma [44]. However, since polysorbate 80 is prone to produce toxic substances, which cause untoward reactions, such as hypotension, dyspnea and shock, the dosage should be strictly controlled [45, 46]. Although a large number of nanodrugs have been developed for treatment of CNS diseases, most have shown poor effects [4]. In this study, we built a brain model of AD patients to evaluate the protective effect of nanoparticles on the brain. Because the toxicity of the Aβ protein to nerve cells varies with the concentration, it is better to screen an appropriate concentration to better simulate the brain environment of AD patients. The model was treated with DZP and DZP-CHP nanosolutions in advance to investigate the protective effect of DZP-CHP against PC12 and SH-SY5Y cell damage induced by Aβ25-35. The results showed that both solutions improved the cell proliferation activity caused by Aβ25-35, LDH release declined, and the mitochondrial potential rose. The inhibitory effect of the DZP-CHP nanosolution on cell damage induced by Aβ25-35 was significantly better than that of free DZP solution, and a concentration of 10 M DZP-CHP nanosolution proved to be the best, which may be due to the optimal drug concentration approach.

Basically, this study deduced the activity process of nanoparticles in vivo , verifying that PS-DZP-CHP nanoparticles have strong brain targeting, a good sustained release effect and a good AD therapeutic effect, thus demonstrating that they are clinically promising nanodrugs. The difficulty of treating the brain with medication has always been a major problem for researchers. The BBB leads to difficulty in curing CNS diseases, such as Parkinson's disease, brain tumors and brain stroke [47]. PS-DZP-CHP nanoparticles can effectively pass the BBB without destroying it, and DZP can be replaced as a model drug. Loading other drugs with high fat solubility and poor dissolution in vivo into the hydrophobic center of the NPs can not only increase brain targeting but also improve the water solubility of the drug. In addition, the design of CHP nanoparticle solutions is simple, and the drug dosage of the hydrophobic center can be flexibly controlled to ensure the best therapeutic effect while minimizing cytotoxicity [48, 49]. In future work, we will conduct in vivo research on DZP-CHP nanoparticles, such as evaluation of drug metabolism and side effects. These studies supplied a new strategy for brain drug delivery, and it is advantageous to clinical application of nanodrug with AD treatment.

Conclusion

DZP-CHP nanoparticles showed an optimal drug to nanomaterials dosing ratio of 1:5, which led to higher PS coverage and drug loading. DZP-CHP nanoparticles with PS adsorption exhibited slow release and significant brain targeting. Nanoparticle surface modification with PS can promote adsorption of Apo E and thus is vital for brain targeting. DZP-CHP nanoparticles had a protective effect on neurotoxicity and were superior to free donepezil.