Nanopartículas multi-modo biodegradáveis sensíveis ao microambiente tumoral para imagens direcionadas ao câncer de mama

Resumo

Os agentes de contraste de ultrassom (US) preenchidos com gás colapsam facilmente no corpo e o gás pode transbordar facilmente, o que limita a eficácia da imagem por US. Para resolver este problema, foi desenvolvido um sistema multimodo gerador de gás injetável que transporta o agente de contraste negativo MR Fe ₃ O ₄ , o corante fluorescente Cy5.5 e o CO ₂ liberando doador (Na ₂ CO ₃ ) As nanopartículas podem gerar dióxido de carbono continuamente (CO ₂ ) gás em tecido tumoral ácido no corpo, dando ao tumor um forte sinal de eco na imagem ultrassônica. Além disso, as nanopartículas conferem excelentes efeitos para RM e imagens de fluorescência do tecido tumoral. Os resultados indicam que este sistema NP responsivo ao pH oferece bons efeitos na imagem MR / US / fluorescente. Este estudo fornece uma referência útil para imagens de tumor multimodo.

Introdução

Na prática clínica, as microbolhas são aplicadas principalmente como agentes de contraste de ultrassom para a imagem em tempo real de vários órgãos e vasos sanguíneos [1,2,3]. Os agentes de contraste de ultrassom tradicionais normalmente consistem em materiais como lipídios ou proteínas que encerram o ar ou gases perfluorcarbonetos. As espécies de gases encapsuladas nas microesferas apresentam baixa estabilidade no sangue e meia-vida curta devido à rápida difusão dos defeitos das microbolhas [4,5,6]. Além disso, como o tamanho de partícula das microbolhas cheias de gás é geralmente grande (aproximadamente 1 a 8 μm), é difícil para as microbolhas penetrarem no ambiente do tumor hospedeiro por extravasamento de tecido. Portanto, a aplicação atual de bolhas de tamanho mícron na imagem intravascular é limitada [7]. Os agentes de contraste de ultrassom ideais geralmente devem exibir um tamanho ideal para transporte através do espaço vascular do tecido, uma duração adequada do efeito acústico, bom direcionamento e biocompatibilidade e fácil excreção do corpo [8, 9]. O conceito de “nanopartículas geradoras de gás” foi proposto em pesquisas anteriores, e tais nanopartículas têm potencial para uso em imagens de contraste de ultrassom [10,11,12]. Essas nanopartículas geradoras de gás são superiores às atuais microbolhas cheias de gás em desempenho, e o gás gerado continuamente permite imagens de ultrassom intensas. Nanopartículas geradoras de gás podem aumentar a permeação e retenção, e podem circular de forma estável no sangue e se acumular efetivamente no tecido tumoral [13, 14].

Permanece um desafio detectar tumores minúsculos e ocultos por métodos de imagem tradicionais, como ressonância magnética (MRI), tomografia computadorizada (TC) e ultrassom, que são limitados por longos tempos de aquisição, alta dose de radiação e baixa sensibilidade [15 , 16]. É necessário integrar diferentes métodos de imagem e desenvolver tecnologia de imagem multimodal para alcançar sinergia integrada para a detecção precoce do câncer [17,18,19]. Óxido de ferro superparamagnético (Fe ₃ O ₄ ) nanopartículas podem ser usadas como agentes de contraste negativos para ressonância magnética em imagens ponderadas em T2 [20, 21]. Fe ₃ O ₄ tem propriedades gerais atraentes, incluindo tamanho de partícula pequeno, forte penetrabilidade, alta magnetização, bom metabolismo e toxicidade relativamente baixa [22, 23]. Fe ₃ O ₄ agentes de contraste para o diagnóstico de ressonância magnética de câncer em estágio inicial têm sido extensivamente estudados devido ao seu alto relaxamento e contraste [24,25,26]. Além disso, a imagem de fluorescência em tempo real tem excelente resolução e pode ser um método valioso para definir o estadiamento do tumor, orientar a ressecção do tumor e monitorar os efeitos do tratamento [27, 28].

Aqui, essas nanopartículas são encapsuladas principalmente por ácido poli (lático-co-glicólico) (PLGA), que foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para uso como um material biosseguro [29, 30]. As partículas de PLGA são modificadas com o peptídeo RGD para permitir a ligação à integrina αvβ3 na superfície das células de câncer de mama e com Cy5.5 como um corante fluorescente para imagem in vivo, e são encapsuladas com Fe ₃ O ₄ para atuar como um agente de contraste T2 negativo na ressonância magnética (Esquema 1a). Devido à glicólise regulada positivamente no tecido tumoral, que poderia produzir mais ácido láctico e prótons no ambiente extracelular, o pH dos tecidos tumorais (6,8-7,2) é inferior ao dos tecidos normais (pH 7,4) [31,32,33] . Assim, projetamos carbonato de sódio (Na ₂ CO ₃ ) no PLGA para produzir CO ₂ bolhas no pH mais baixo de tecidos tumorais para imagens de ultrassom. Para verificar sua aplicação promissora em imagens de tumor, as propriedades abrangentes dessas nanopartículas multimodo para imagens in vitro foram sistematicamente caracterizadas, incluindo sua citotoxicidade, especificidade de direcionamento e biodistribuição no tecido tumoral, por três modos de imagem.

a Diagramas esquemáticos da função em Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs via acumulação direcionada no tumor e geração de CO ₂ bolhas em tecidos tumorais ácidos, seguido por imagem MR / US / FI triplo-modal de câncer de mama. b Ilustração esquemática da preparação do Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs

Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs foram projetados como agentes de contraste multimodo direcionados a RGD encapsulando um polímero biocompatível de PLGA com Fe ₃ O ₄ e Na ₂ CO ₃ e um agente direcionado à integrina por meio de uma ligação química biodegradável (Esquema 1b).

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão mostraram que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs eram esferas claras com partículas de óxido de ferro uniformemente dispersas visíveis na casca (Fig. 1a). O tamanho hidrodinâmico médio dos NPs foi medido como 117,6 nm por espalhamento de luz dinâmico, e o índice de polidispersidade médio foi de 0,234 (Fig. 1b). A carga superficial das NPs foi confirmada por medições de potencial zeta como sendo - 21,7 mV (Fig. 1c). A medição do espectro de fluorescência revelou que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD teve o comprimento de onda de emissão máximo em 685 nm, indicando que Cy5.5 foi encapsulado com sucesso no núcleo PLGA (Fig. 1d). Os valores de magnetização de saturação para Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD e Fe grátis ₃ O ₄ NPs foram iguais a 32,6 e 42,5 emu / g, respectivamente (Fig. 1e). Essas descobertas indicaram a característica superparamagnética das nanopartículas em temperatura ambiente. O espectro FITR de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD mostrou que a vibração de alongamento N-H e o pico de absorção de –OH apareceu em torno de 3432 cm ⁻¹ . Além disso, encontramos uma melhoria (1628 cm ⁻¹ ) da vibração de alongamento C =O. Em comparação com os NPs não direcionados, o pico característico (o carboxil) em 1735 cm ⁻¹ dos NPs alvo foi significativamente reduzido. Os resultados mostraram a ligação entre o grupo carboxila na superfície da microesfera e o grupo amino no peptídeo RGD. Ligação in vitro de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs é mostrado na Fig. 1f.

Imagens TEM ( a ) Distribuições de tamanho ( b ) Potencial Zeta ( c ) de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. d Espectro de emissão de fluorescência de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD e Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ NPs PLGA / cRGD. e Curvas de histerese magnética de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs e Fe ₃ O ₄ NPs. f O FTIR de espectros de Fe ₃ alvo O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD e NPs PLGA não direcionados

Ligação in vitro de Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD NPs

A integrina αvβ3 é geralmente altamente expressa em células endoteliais de tumor de câncer de mama e pode promover metástase tumoral [33,34,35,36]. A imunofluorescência celular para a expressão da integrina αv em células MDA-MB-231 foi muito maior do que em células MCF-7; As células A549 serviram como controles positivos (Fig. 2a). A captação celular de NPs foi estudada por CLSM (Fig. 2b). O Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs mostraram uma taxa de ligação muito mais alta para células MD-MB-231 do que NPs não direcionados. As imagens de fluorescência também revelaram que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs ligados ao citoplasma da célula, e imagens mescladas mostraram os mesmos locais que a expressão da integrina αv [37, 38].

a Imagens de fluorescência confocal com a expressão da integrina αv em células MB231, A549 e Mcf-7. Azul e verde representam DAPI e fluorescência αv, respectivamente. b Imagens de fluorescência confocal de células MB231 incubadas com Fe ₃ direcionado O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs e NPs não direcionados. Azul, vermelho e verde representam DAPI, Cy5.5 e fluorescência αv, respectivamente. c Viabilidade relativa de células MB231 incubadas com diferentes concentrações de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs

Ensaio de citotoxicidade

A citotoxicidade in vitro do Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs foi estimado em células MDA-MB-231 usando um ensaio CCK8, enquanto células A549 e MCF-7 tratadas com NPs foram usadas como controles (Fig. 2c). Na faixa de concentrações de Fe de 5–80 μg / mL, a viabilidade celular das células A549 e MB231 não foi significativamente reduzida, e ambas estavam acima de 70%. Em contraste, as células MCF-7 mostraram uma diminuição significativa na viabilidade celular para aproximadamente 50% em concentrações de Fe superiores a 40 μg / mL. Os resultados do CCK8 demonstraram que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs mostraram citotoxicidade significativamente mais baixa em células MDA-MB-231 em um determinado intervalo de concentração.

Imagem de contraste in vitro

Usamos um simulador de gel de ágar para estudar o desempenho do Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs in vitro em diferentes valores de pH (Fig. 3a). As imagens de contraste do ultrassom de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs foram significativamente aumentados em pH fracamente ácido (pH 6,8) em comparação com pH 7,2, provavelmente porque pH 7,2 não produz CO suficiente ₂ bolhas para imagens de ultrassom. Em contraste, quando os NPs estavam em um ambiente fracamente ácido, bolhas suficientes podiam ser geradas para imagens de ultrassom. Esta característica é relevante para tumores, que exibem alta heterogeneidade do tecido e diversos níveis de pH (pH 6,8-7,2) in vivo [32, 39, 40]. A intensidade do sinal da imagem do ultrassom foi então analisada (fig. 3b). As razões de intensidade de sinal dos grupos NP não direcionados (pH =7), NP não direcionados (PH =5), NP direcionados (PH =7) e NP direcionados (PH =5) em relação à intensidade do sinal do o grupo em branco foi de 112%, 145%, 167% e 178 ± 4%, respectivamente, o que indica claramente que o grupo alvo NP (PH =5) tinha o sinal de US mais forte.

a Imagens ultrassônicas dos NPs direcionados e não direcionados registrados em diferentes valores de pH (7,2 e 6,8), PBS como controle. b A taxa de intensidade do sinal é calculada por amostra / branco, a amostra representa a intensidade do eco dos NPs direcionados e não direcionados e o branco representa a intensidade do eco do PBS. c Imagens de RM ponderadas em T2 de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs com diferentes concentrações de Fe (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 e 1 mM). d As relatividades transversais (r2) eram 19,597 mM ⁻¹ s ⁻¹ para Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs

Para o estudo de ressonância magnética in vitro, como a concentração de Fe no Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs aumentaram, a intensidade do sinal ponderado em T2 mostrou uma diminuição significativa, indicando a possibilidade desses NPs para uso como agentes de contraste T2 MR (Fig. 3c). A taxa de relaxamento transversal (r2) de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs foi calculado em 19,597 mM ⁻¹ s ⁻¹ . Embora a taxa de relaxamento transversal (r2) de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs é inferior ao de muitos outros agentes superparamagnéticos de IRM, a composição de Fe ₃ O ₄ pode aumentar o r2, que foi 2,94 vezes maior do que o r2 das partículas de SPIO usadas clinicamente.

Imagem de contraste de ultra-som de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs

Para demonstrar o potencial do Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs para imagens de ultrassom em tumores, administramos uma injeção de Na ₂ na veia da cauda CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs para xenoenxerto de camundongos nus de câncer de mama e monitorou as imagens de ultrassom em função do tempo (Fig. 4a). Antes da injeção, as imagens do tumor, fígado e área subcutânea foram registradas. Imediatamente após a injeção, a área dos tecidos tumorais não apresentava realce pelo contraste. O aumento da área do tumor foi observado a partir de 30 minutos após a injeção e durou 90 minutos. Os resultados do ultrassom in vivo mostraram que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs geraram bolhas suficientes em tecidos tumorais ácidos para produzir refletividade ecogênica para imagens de ultrassom. Como controle, também obtivemos imagens do fígado e do tecido subcutâneo em momentos diferentes após a injeção dos NPs direcionados. Ao longo do período de observação, nenhum aumento significativo foi encontrado na área de injeção subcutânea, e o aumento no fígado, que diminuiu ao longo do tempo, foi significativamente menor do que nos tumores (Fig. 4b). Este resultado indica que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs que circulam no corpo em pH fisiológico não produzem uma quantidade substancial de CO ₂ bolhas para aumento de contraste de ultra-som.

a Imagem de ultrassom in vivo de tumores, fígados e áreas subcutâneas em diferentes momentos após a injeção de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. b A taxa de intensidade do eco em função do tempo é calculada por tecido / branco, o tecido representa a intensidade do eco do tumor, fígado ou área subcutânea, o branco representa a intensidade do eco antes da injeção

RNM de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs

Para ressonância magnética in vivo, para demonstrar que NPs podem ser usados para imagens específicas de tumor, Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs foram injetados diretamente em tumores e músculos. Os resultados mostraram que a área do tumor exibiu uma diminuição significativa no contraste T2-MR após a injeção dos NPs direcionados, e a intensidade do sinal diminuiu significativamente de 8875 em 0 min para 5972 em 120 min após a injeção (Fig. 5a, b). No entanto, com a mesma quantidade de nanopartículas injetadas, a área do músculo subcutâneo apresentou uma diminuição do sinal T2 muito menor. Esta descoberta demonstra a eficácia do Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs com agentes de contraste T2-MR direcionados à integrina hipersensível para uso em imagens direcionadas a tumor. No grupo de injeção na veia da cauda, a imagem T2-MR também mostrou uma diminuição óbvia no contraste no tumor 24 horas após a injeção, demonstrando o alto acúmulo de Na ₂ no tumor CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs (Fig. 5c, d). Além disso, os sinais de T2 diminuídos foram observados no fígado e rins, indicando que os íons de ferro nos NPs podem ser rapidamente eliminados do corpo. Portanto, a ressonância magnética revelou que o Fe ₃ envolvido por PLGA O ₄ nanopartículas exibiram direcionamento tumoral passivo eficiente através do efeito de permeabilidade e retenção (EPR) aprimorada, especialmente direcionamento mediado por RGD, mas poderiam ser decompostos e rapidamente excretados in vivo.

a Imagens in vivo de T2-MR de tecidos subcutâneos normais e tumorais antes e após a injeção de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. b Intensidade de sinal média no músculo e tumor para injeção de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. c Imagens T2-MR em axial e coronal de camundongos com tumor MDA-MB-231 antes e após a injeção intravenosa de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. d A relação da intensidade do sinal é calculada por tecido / músculo, tecido representa a intensidade do sinal do tumor, fígado e rim antes e depois da injeção dos NPs direcionados, músculo representa a intensidade do sinal do músculo ao mesmo tempo

Imagem de fluorescência e histologia

Duzentos microlitros de NPs foram injetados por via intravenosa em camundongos para imagens de fluorescência in vivo. No grupo injetado com NPs direcionados a RGD, o sinal de fluorescência de Cy5.5 aumentou gradualmente na área do tumor e atingiu um pico 4 h após a injeção, indicando que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs podem efetivamente se acumular no tumor. No grupo não direcionado, os NPs foram distribuídos por todo o corpo após a injeção e rapidamente eliminados, e não se acumularam no tumor por um longo período de tempo (Fig. 6a). Os camundongos foram então dissecados e os principais órgãos e tumores foram coletados para imagem de fluorescência in vitro, que revelou alta captação tumoral dos NPs direcionados (Fig. 6b, c). A intensidade de fluorescência de Cy5.5 nos tumores de camundongos injetados com NPs direcionados foi de 1,5 vezes que em camundongos injetados com NPs não direcionados.

a Imagem de fluorescência de fluorescência in vivo de animais em 0, 0,5, 1, 2 e 3 h após a injeção após a injeção de NPs direcionados e não direcionados. b Imagens de fluorescência ex vivo de tumores e órgãos principais (fígado, baço, pulmão, coração e rim) coletadas de animais. c Intensidade de fluorescência média de vários órgãos e tumores

Além disso, o direcionamento específico do tumor de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs foi verificado por imagem de fluorescência de tecido de seções de tumor congeladas (Fig. 7a). A coloração por imunofluorescência de secções de tumor com anticorpos contra integrinas αv e β3 revelou expressão significativa de integrina αvβ3 em tecidos tumorais. A fluorescência da integrina αv e β3 foi fundida com a fluorescência Cy5.5 do Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs para obter uma imagem de imunocoloração revelando a co-localização. Os resultados de imunofluorescência nos tecidos tumorais indicaram que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs ligam-se especificamente à integrina αvβ3 no câncer de mama maligno MB231. Além disso, a coloração H&E de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs em comparação com o grupo não direcionado mostraram que todas as seções de tecido de órgãos tinham morfologia patológica normal e nenhuma resposta de dano histopatológico (Fig. 7b). Todos os resultados da citotoxicidade acima e da análise histológica indicaram que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs não induziram toxicidade significativa aos principais tecidos dos órgãos in vivo, e sua boa biocompatibilidade pode ser razoavelmente atribuída a PLGA.

a Imagem fluorescente de seções congeladas de tumor MDA-MB-231 de camundongos injetados com NPs direcionados e não direcionados. Verde, vermelho, roxo e azul representam αv, β3, Cy5.5 e fluorescência DAPI, respectivamente. b Fatias de tumor coradas com H&E coletadas de camundongos após a injeção de NPs direcionados e não direcionados

Conclusões

Em conclusão, os resultados acima demonstram uma abordagem criativa e bem-sucedida para a ressonância magnética do câncer de mama por meio de um direcionamento magnético e um sistema gerador de gás que é ativado no microambiente tumoral. Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs exibem excelente desempenho de imagem e boa biocompatibilidade nos modos de imagem MR / ultrassom / fluorescente. Nosso trabalho mostra o forte potencial para o diagnóstico de tumor com imagens multimodais aprimoradas.

Materiais e métodos

Materiais

Poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) (lactídeo:glicolídeo =75:25, Mw =20.000), corante cianina5,5 e álcool polivinílico (PVA) foram adquiridos na Sigma-Aldrich Company (Shanghai, China). O peptídeo RGD foi sintetizado de forma personalizada pela GenicBio BioTech Co. Ltd. (Xangai, China). Fe ₃ O ₄ nanopartículas e carbonato de sódio (Na ₂ CO ₃ ) foram adquiridos de Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, China). Diclorometano (CH ₂ Cl ₂ ) e dimetilsulfóxido (DMSO) foram obtidos da Solarbio Company (Beijing, China). Todos os produtos químicos eram de grau analítico.

Síntese de Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD nanopartículas

Primeiro, 12,5 mg de PLGA e 0,25 mL de clorofórmio foram misturados. Em seguida, 5 μL de Cy5.5, 15 μL de nanopartículas magnéticas modificadas com ácido oleico dispersas em clorofórmio (OA @ Fe ₃ O ₄ , 10 mg / mL), 5 μL de carbonato de sódio (Na ₂ CO ₃ ) e 1,5 mL de solução de PVA a 1% foram adicionados em sequência e emulsionados com um processador ultrassônico por 2 min. Em seguida, 12,5 mL de solução de PVA a 0,3% foram adicionados e agitados por 3-4 h em temperatura ambiente, e 12,5 mL de solução de PVA a 0,4% foram adicionados para agitação (500 rpm / min) durante a noite para remover solvente orgânico residual. A solução acima foi submetida a várias lavagens de ultrafiltração com DDH ₂ O e então diluída com tampão PB (pH =7,4) para um volume final de 1,25 mL. A seguir, 0,25 mg de EDC e 1,25 mg de NHS foram adicionados à solução mista acima. A mistura foi agitada durante 30 min a 25 ° C e, em seguida, lavada três vezes com ultrafiltração e ressuspensa em solução tampão PB (pH =7,4). Em seguida, 1,25 mg de cRGD foi adicionado à solução e agitado a 4 ° C durante a noite. Para remover EDC, NHS e qualquer cRGD residual, a solução transparente foi filtrada por um tubo de ultrafiltração. Finalmente, Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs foram ressuspensos em 1,25 mL de água desionizada e armazenados a 4 ° C.

Caracterização de nanopartículas

Os diâmetros dinâmicos e o potencial zeta das nanopartículas foram medidos por um Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK). A morfologia das nanopartículas foi obtida em microscópio eletrônico de transmissão FEI Tecnai F20. O carregamento de Cy5.5 foi registrado por um espectrômetro de fluorescência Hitachi F-7000. O FTIR foi realizado usando um espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier (Alpha II, Bruker, Suíça). Um magnetômetro de amostra vibrante (VSM, Lake Shore 7410) foi aplicado para determinar a curva de histerese das nanopartículas e Fe livre ₃ O ₄ .

Células e animais

Células de câncer de mama humano MDA-MB-231 foram gentilmente cedidas pelo Stem Cell Bank, da Academia Chinesa de Ciências. As células foram mantidas a 37 ° C em 95% de ar e 5% de CO ₂ . Ratinhos BALB / c fêmeas (4 semanas) foram adquiridos de Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. e mantidos de acordo com protocolos aprovados pelo Guangxi Medical University Laboratory Animal Center. Os experimentos com animais foram seguidos com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, lançado pelo Comitê de Ética em Animais do Centro de Animais de Laboratório da Universidade Médica de Guangxi. Células de câncer de mama MDA-MB-231 foram transplantadas para o flanco direito de camundongos BALB / c (2 × 106 em células de 200 μl por camundongo) e permitidas a crescer por 10-14 dias (diâmetro médio de 5 mm) antes da imagem.

Expressão celular da integrina αv

A imunofluorescência celular foi realizada para confirmar a elevada expressão da integrina αv em células MDA-MB-231. As células A549 e MCF-7 foram utilizadas como controles. As células foram semeadas em placas de cultura com fundo de vidro de 35 mm (MatTek, EUA) a 2 × 10 ⁴ células mL ⁻¹ por 24 h. Após a incubação, as células foram fixadas durante 20 min à temperatura ambiente com paraformaldeído a 4%. Em seguida, foram incubados com anticorpo monoclonal de coelho anti-integrina αv (ab179475, Abcam) a 4 ° C durante a noite e anticorpo IgG anti-coelho por 1 h em temperatura ambiente. Finalmente, as células foram coradas com DAPI. As imagens foram adquiridas por microscopia confocal de varredura a laser (TCS SP8, Leica, Alemanha).

Para avaliar a eficácia do direcionamento das nanopartículas, um estudo de captação celular foi realizado usando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). As células foram semeadas em placas de cultura com fundo de vidro de 35 mm (MatTek, EUA) a 2 × 10 ⁴ células mL ⁻¹ por 24 h. Em seguida, as células foram incubadas com NPs direcionados a RGD (30 μg mL ⁻¹ , 0,5 mL) em pH 7,4 por 2 h, e NPs não direcionados foram usados como controles. Após a incubação, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% por 20 min e então incubadas com anticorpo αv. Por meio da co-localização, verificamos a ligação direcionada das nanopartículas à integrina nas células.

Ensaio CCK8

A biocompatibilidade do Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD nanopartículas foram avaliadas por um estudo de citotoxicidade. Células MDA-MB-231, A549 e MCF-7 foram semeadas em placas de 96 poços a 5 × 10 ³ células mL ⁻¹ por 24 h. Então, 0,1 mL de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP Suspensão em concentrações de Fe de 5, 10, 20, 40 e 80 μg / mL foi adicionada a cada poço e incubada por 24 h. Finalmente, 10 μL de solução de CCK8 foram adicionados e a suspensão foi incubada por mais 1 h. Os resultados foram determinados por um leitor de microplacas (Thermo Scientific, EUA) a 450 nm.

Imagem de ultrassom com contraste

A imagem de ultrassom de nanopartículas foi realizada usando um sistema de ultrassom Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Canadá). Os NPs direcionados e não direcionados RGD foram adicionados ao modelo de agarose, e PBS foi usado como um controle. As imagens foram gravadas no modo B e modo CEUS com diferentes buffers de pH de 7,2 e 6,8. A área de interesse foi desenhada e o valor médio de cinza foi medido em imagens de modo B.

Para a imagem de ultrassom in vivo, os camundongos foram anestesiados com 2% de isoflurano (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China) e a temperatura corporal foi mantida a 37 ° C com uma almofada aquecida. Um total de 200 μL de NPs direcionados a RGD foi injetado através da veia da cauda. Os animais de controle receberam uma injeção subcutânea com a mesma quantidade de NPs. As imagens ultrassônicas foram registradas usando um transdutor de 7 MHz para adquirir continuamente imagens de ultrassom de tumores, fígados e áreas subcutâneas. A zona de foco acústico foi posicionada no centro do tumor com o maior corte transversal, e um campo de visão contendo o tumor e seu tecido adjacente foi obtido.

Imagem por ressonância magnética

Exames de ressonância magnética de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs foram realizados usando um 3.0 T MR (GE Healthcare, EUA) e uma bobina animal (RF TECH LIMITED, China). NPs com diferentes concentrações de Fe de 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 e 1 mM foram escaneados em tubos Eppendorf de 1 mL e PBS foi usado como controle. A RM de T2 foi realizada para cada tubo usando uma sequência FSE ponderada em T2 (espessura de corte de 3 mm, TR / TE 2000 / 74,4 ms, FOV de 8 × 8 cm e matriz 320 × 256). As relaxividades (r2) foram calculadas por um ajuste linear do tempo de relaxamento inverso em função da concentração de Fe.

Para a ressonância magnética in vivo, os camundongos foram divididos aleatoriamente em dois grupos ( n =3) para varredura de RM que recebeu (1) injeção local de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs dentro do músculo subcutâneo e tecidos tumorais ou (2) injeção na veia da cauda de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs. Imagens de linha de base dos camundongos foram tiradas antes da injeção das nanopartículas. Para o grupo um, a mesma quantidade de NPs foi injetada no tecido subcutâneo e tumoral, e a varredura de ressonância magnética foi realizada a cada 30 minutos para registrar a transição do sinal dos tecidos. Para o grupo dois, a imagem do tumor foi realizada nas posições axial e coronal, e os parâmetros de RM foram os mesmos usados para a imagem in vitro. A intensidade do sinal (SI) na região de interesse (ROI) foi medida e comparada aos sinais do tecido em momentos diferentes antes e após a injeção.

Imagem de fluorescência do tumor

Para imagens de fluorescência in vivo, um sistema de imagens de fluorescência in vivo (FX PRO, Bruker, Suíça) foi usado para a varredura, e os camundongos foram divididos aleatoriamente em dois grupos ( n =3):(1) NPs direcionados a RGD e (2) NPs não direcionados. As imagens foram capturadas a cada 30 min por um período de 4 h após a injeção. Posteriormente, órgãos e tumores importantes foram coletados e fotografados, e a distribuição da fluorescência nos órgãos do corpo foi observada. A análise quantitativa da intensidade de fluorescência foi realizada usando software de imagem molecular (Bruker, Suíça). These important organs then underwent H&E staining to evaluate the tissue toxicity. Frozen tumour sections were also subjected to fluorescence immunostaining with antibodies against αv integrin and β3 integrin.