Entrega Lipossomal pH-Sensível Direcionada de Morina via Conjugados Aptâmero-Nanopartícula de Ouro para Terapia do Câncer

Resumo

Este estudo propõe a síntese de um tipo de nanopartícula anticancerígena, lipossomo pH-sensível de Morina modificado com aptâmeros e nanopartícula de ouro (Apt-Au@MSL), que exibe propriedades de direcionamento tumoral. Os tumores são difíceis de curar porque seu microambiente difere do tecido normal; seu pH é mais baixo, o que geralmente impede a eficácia dos fármacos. Assim, fármacos responsivos ao pH têm atraído ampla atenção. Nanopartículas de ouro (AuNPs) mostram potencial como carreadores de fármacos devido ao seu pequeno tamanho, boa biocompatibilidade, fácil modificação de superfície e forte penetração celular. O Apt-Au@MSL exibe excelente monodispersidade e propriedades de direcionamento tumoral, podendo ser liberado em ambiente parcialmente ácido via diálise. Selecionamos nosso modelo de célula cancerígena por ensaio MTT e descobrimos que as células SGC-7901 podem efetivamente suprimir a proliferação. Resultados in vivo demonstram que a administração de Apt-Au@MSL pode inibir o crescimento tumoral em modelos de camundongos xenoenxertados. Coloração H&E e ensaio TUNEL confirmaram ainda que o Apt-Au@MSL pode promover a apoptose tumoral. O Apt-Au@MSL pode induzir apoptose ao desencadear superprodução de espécies reativas de oxigênio (ROS) e regular múltiplos cruzamentos de sinalização. Tanto testes bioquímicos sanguíneos quanto coloração H&E sugeriram que esses materiais exibem toxicidade aguda negligenciável e boa biocompatibilidade in vivo. Com sua poderosa função, o Apt-Au@MSL pode ser usado como material anticancerígeno baseado em direcionamento para futuro tratamento clínico do câncer.

Introdução

Uma das causas mais prevalentes de morte, o câncer, pode levar a perdas econômicas substanciais e danos aos seres humanos. Esforços consideráveis têm sido direcionados ao desenvolvimento de fármacos inteligentes para tratamento do câncer. Devido à sua capacidade de proteger fármacos até atingirem o local alvo, nanopartículas poliméricas podem potencialmente melhorar a entrega de agentes terapêuticos. Para garantir que o agente terapêutico seja entregue ao sítio ativo, nanopartículas altamente reativas são usadas. Tais nanopartículas podem ser projetadas para variar em propriedades de material sob diferentes estímulos biológicos. Nanopartículas reativas são projetadas usando diferentes estímulos, incluindo estímulos externos (ex.: temperatura e luz) e estímulos biológicos (ex.: pH ou condições redox). NPs responsivas ao pH atraíram interesse de pesquisa devido a mudanças no pH após endocitose de nanopartículas. Materiais que respondem ao pH também chamam atenção porque a função pH-responsiva pode ser facilmente integrada em uma variedade de estruturas poliméricas para projetar um conjunto de nanopartículas que respondem ao pH. Nanopartículas podem responder ao pH por alteração da química de superfície, mudança no tamanho ou forma da partícula, e quebra ou liberação de substâncias. Essa mudança nas propriedades da nanopartícula pode ser usada para regular a captação celular e liberação controlada. Portanto, nanopartículas pH-responsivas fornecem uma estratégia poderosa para o projeto de sistemas de entrega terapêutica.

Morina hidratada (3,5,7,2′,4′-pentaidroxiflavona) é uma substância ativa natural isolada de medicamentos fitoterápicos chineses ou plantas. É um composto de progesterona e um metabólito secundário de fenol em plantas. A Morina é amplamente distribuída na natureza e exerce bons efeitos antioxidantes, anticancerígenos e anti-inflamatórios significativos. O potencial da Morina para várias aplicações atraiu interesse considerável, mas tal potencial é significativamente limitado pela baixa solubilidade em água e biodisponibilidade da substância.

Lipossomos (ocos) compostos de lecitina e ceramida, entre outros, têm uma estrutura bicamada consistindo de moléculas lipídicas anfifílicas. Lipossomos fornecem características desejáveis, como biocompatibilidade, funcionalidade, efeitos colaterais reduzidos e capacidade de encapsular grandes quantidades de medicamento. Eles podem transportar eficientemente agentes hidrofílicos e hidrofóbicos e protegê-los de condições externas, transportando-os com sucesso para regiões teciduais alvo. Eficácia aprimorada é incorporada no projeto para facilitar a liberação desencadeada por pH do material anticancerígeno dentro do interstício tumoral via lipossomos pH-sensíveis. Estes lipossomos pH-sensíveis são lipossomos especiais que liberam fármaco em ambientes teciduais e desestabilizam rapidamente em ambientes ácidos, como endossomos de tecido cancerígeno.

Para maior seletividade e eficácia do tratamento tumoral, lipossomos pH-sensíveis devem ser modificados para formar nanopartículas direcionadas a tumores. Aptâmeros de DNA têm sido recentemente desenvolvidos como biossensores e sensores de imagem altamente seletivos e sensíveis, bem como agentes potenciais para terapêuticas direcionadas ao câncer. O aptâmero de fita simples de DNA AS1411 demonstrou funcionar como agente quimioterápico devido à sua alta afinidade de ligação para núcleos de células cancerígenas. Este aptâmero (Apt) foi combinado com NPs de Au para fabricar um nanoconstruto de dois componentes de NPs de Au carregadas com Apt que podem interagir com núcleos de células cancerígenas. Alguns estudos também demonstraram que o projeto de híbridos lipossomo-nanopartícula pode fornecer uma rica caixa de ferramentas para a fabricação de tais modalidades multifuncionais. Um sistema vesicular híbrido lipossomo-NP de Au consistindo de lipossomos catiônicos e NPs de Au foi projetado para melhorar a penetração do fármaco dentro do interstício tumoral e aumentar a atividade anticancerígena.

Nanopartículas de ouro (NPs de Au) têm sido consideradas bons carreadores de fármacos e podem ser modificadas com moléculas bio-relacionadas para aumentar a especificidade direcionada ao câncer. Com a modificação de superfície de NPs de Au, o aptâmero do grupo sulfidrila pode ser usado para modificar a superfície de NPs de Au, que pode ser direcionado pela ligação covalente Au-S, e o grupo sulfidrila apropriado na superfície do nanouro pode ser anexado à superfície do nanouro. De uma perspectiva de engenharia e aplicação, nanomateriais de ouro ligados a ligantes fornecem uma plataforma poderosa para facilitar identificação, detecção e tratamento direcionados.

No estudo atual, usamos lipossomos pH-sensíveis encapsulando Morina e montamos Au-Apt que foi modificado na superfície dos lipossomos (Apt-Au@MSL). A Morina, caracterizada por baixa solubilidade em água e biodisponibilidade, foi transformada. A morfologia, tamanho e outras propriedades do Apt-Au@MSL preparado foram caracterizadas. A nova nanopartícula mostrou propriedades de direcionamento tumoral e alta atividade anticancerígena. A atividade anticancerígena do Apt-Au@MSL foi explorada in vitro e in vivo.

Materiais e Métodos

Materiais

L-α-Fosfatidilcolina (PC), colesterol (Chol), hemissuccinato de colesteril (CHEMS), Morina (≥ 99,99%), citrato de sódio (99,9%), HAuCl₄·3H₂O (≥ 99,9%), polivinilpirrolidona (PVP, peso 40.000), NaOH (≥ 98,0%) e HCl (37%) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical Co. (EUA). O aptâmero AS1411 com modificação de dissulfeto foi sintetizado pela TaKaRa (Dalian, China) com a seguinte sequência: 5′-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3′. Brometo de tetrazólio de tiazolil azul (MTT), iodeto de propídio (PI), calcina e Annexina V Alexa Fluor 488 foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical. Todas as soluções aquosas foram preparadas em água duplamente destilada. Todos os outros reagentes eram os melhores comercialmente disponíveis.

Síntese de NPs de Au

Até 1 mL de HAuCl₄·4H₂O (1%) foi dissolvido em 25 mL de água Milli-Q (pH = 5,5), e 50 mg de PVP foram adicionados à solução. A solução obtida foi colocada em um balão de três bocas (150 mL) e tratada por irradiação de micro-ondas (MW) por 5 min com agitação mecânica. Subsequentemente, 1,5 mL de solução de citrato de sódio (1%) foi rapidamente adicionado à solução e irradiado por MW por 3 min. A solução foi coletada por centrifugação a 10000 rpm por 5 min.

Síntese de NPs Apt-Au

A ligação dissulfeto dos aptâmeros foi clivada usando fosfina tris(2-carboxietil). Após 30 min, a solução de aptâmero (100 μL, 100 μM) foi adicionada a 10 mL de solução 5 nM de NPs de Au e então incubada por 24 h para formar NPs Au-Apt. Após 1 dia, salinizamos a mistura com 2,5 mL de solução 500 mM de NaCl duas vezes, separadas por 4 h.

Preparação de Lipossomos pH-Sensíveis

Lipossomos compostos de PC de gema para CHEMS para Chol na razão molar de 33:13:5 e 5% de Morina foram preparados por hidratação de filme. PC de gema, CHEMS, Chol e 2 mg de Morina foram dissolvidos em 8 mL de CHCl₃, e os solventes orgânicos foram removidos a 40 °C com evaporador rotativo. Para lipossomos de Morina, o filme lipídico resultante foi hidratado usando PBS 2% (p/v) e então sonicado usando sonda de banho de gelo por 15 min. O lipossomo final foi sintetizado e estabilizado no sistema coloidal. Para lipossomos pH-sensíveis de Morina Apt-Au@ (Apt-Au@MSL), o filme lipídico foi hidratado com 475 μg/mL de NPs Au-Apt em 5% de dextrose seguido de sonicação.

Caracterização

Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis, S-3100 Photodiode Array, Scinco Co., Ltd., Coreia) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) foram conduzidas (Nicolet iS50, EUA, Thermo Fisher Scientific). A morfologia do Apt-Au@MSL foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão (MET, HT7700, Tóquio Japão, Hitachi). A porcentagem de liberação de Morina foi detectada por espectroscopia UV-vis. A morfologia dos lipossomos de Morina e Apt-Au@MSL também foi observada por microscopia eletrônica de varredura (MEV, S-4800, Hitachi, Japão). Espalhamento dinâmico de luz (DLS) e medições de potencial zeta foram usadas para caracterizar as propriedades ópticas e tamanhos dos lipossomos de Morina e Apt-Au@MSL em analisador de potencial Brookhaven ZetaPALS.

Cultura Celular

As linhagens de células cancerígenas humanas, SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 e Hs68, foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas em RPMI com 10% soro fetal bovino a 37 °C e 5% CO₂.

Estudo de Atividade Anticancerígena In Vitro

SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 e Hs68 foram semeadas em placas de 96 poços (2,0 × 10³ células/poço) e então cultivadas com Apt-Au@MSL em concentrações variadas (0, 5, 10, 15, 20 e 30 μg/mL). NPs de Au e Morina foram designadas como grupos controle. O grupo branco consistiu de células não tratadas. As placas de 96 poços foram incubadas em incubadora umidificada. Após incubação, 9,6 mL de solução MTT (5 mg/mL) foi adicionado em cada poço e incubado adicionalmente por 2 h. Cada grupo foi testado em triplicata, e valores IC₅₀ foram derivados dos valores médios de OD dos testes triplicados versus curvas de concentração do fármaco. O brilho de cada grupo foi obtido por microscopia de fluorescência confocal.

Adesão celular foi monitorada usando um sistema de detecção eletrônica celular em tempo real (RT-CES; ACEA Biosciences, Inc.) a cada 10 min por 75 h. Para determinar adesão celular, cada poço na placa foi semeado com células (1,0 × 10⁴ células/poço) com meio fresco para volume final de 200 μL e então incubado em solução de Apt-Au@MSL em concentrações variadas (10, 20 e 30 μg/mL) a 10 h incubado por 12 h. O grupo branco consistiu de células não tratadas, e os grupos controle consistiram dos grupos Morina e lipossomo-Morina.

Microscopia de Fluorescência

Células SGC-7901 foram cultivadas em placas de 48 poços durante a noite a 37 °C, 5% CO₂. As células foram então tratadas com soluções de Apt-Au@MSL (10 e 30 μg/mL) em diferentes concentrações por 12 h. Os grupos controle consistiram dos grupos Morina e lipossomo-Morina. Subsequentemente, o meio foi removido. O grupo branco consistiu de células não tratadas. As células foram lavadas com PBS três vezes. As células foram coradas e então medidas por co-coloração de células vivas e mortas (ensaio LIVE/DEAD). Após co-coloração com Calceína-AM/PI por 30 min, as células foram lavadas com PBS duas vezes para remover o excesso de corante, e imagens de fluorescência foram obtidas por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) (para calceína-AM, Ex = 488 nm e Em = 515 nm; PI Ex = 535 nm e Em = 615 nm).

Análise de Morte Celular Apoptótica

Para medir os efeitos anticancerígenos do Apt-Au@MSL, cada poço em uma placa de seis poços foi semeado com células SGC-7901 (1,0 × 10⁵ células/poço) e então incubado em soluções de Apt-Au@MSL em concentrações variadas (5, 10, 20 e 30 μg/mL) por 12 h. O grupo branco consistiu de células não tratadas, e os grupos controle consistiram dos grupos Morina e lipossomos-Morina. Após tratamento, as células foram coletadas e lavadas com PBS duas vezes. As células foram coradas com PI e Annexina V-FITC e então analisadas usando analisador CytoFLEX (Beckman Coulter) (para PI, Ex = 535 nm e Em = 615 nm; Annexina V-FITC, Ex = 488 nm e Em = 525 nm).

Estudos sobre Destruição da Parede Celular

Para estudar destruição da parede celular em ensaio anticancerígeno, as células SGC-7901 foram cultivadas em placas de seis poços a 37 °C e 5% CO₂. As células cultivadas sem o material foram usadas como grupo branco. Após as células serem cultivadas com Apt-Au@MSL em concentrações variadas (5, 10, 20 e 30 μg/mL) por 12 h, foram tratadas com solução Tripsina-EDTA 0,25%. Todas as células (incluindo células flutuantes no meio) foram coletadas a 2000 r/min por 5 min. As células coletadas foram então pós-fixadas em solução de dialdeído glutárico 2,5% por 4 h. As células fixas foram desidratadas em série de gradiente de acetona por 20 min. As células foram finalmente submetidas a uma série de procedimentos, montadas em grades de cobre e observadas por MET (HT-7700, Hitachi, Japão).

Ensaio Western Blot

A expressão proteica de células SGC-7901 foi detectada por análise Western blot. Células SGC-7901 (4,0 × 10⁵ células/poço) foram inoculadas em placa de cultura de 9 cm e 20 μg/mL Apt-Au@MSL por 1, 6, 12 e 24 h. Células foram colhidas após tratamento e suspensas em tampão de lise celular em gelo por 1 h. A mistura foi colocada em centrífuga a 11.000g a 4 °C por 10 min, e o sobrenadante contendo proteína celular total foi coletado. Concentração total de proteína no sobrenadante foi determinada usando método BCA. A proteína foi então ressuspensa no tampão de carga e fervida a 100°C por 10 minutos. Amostras contendo quantidades iguais de proteína (40 μg/faixa) foram submetidas a SDS-PAGE (géis de tricina 10%). Foram então transferidas para membranas de nitrocelulose (NC) a 100 V por 1,5 h e bloqueadas usando 5% leite desnatado em salina tamponada com Tris com 0,1% Tween-20 (TBST) por 1 h. Então, a membrana NC foi incubada com anticorpos primários e anticorpo secundário, respectivamente. Bandas de proteína alvo foram visualizadas na membrana usando reagentes de detecção ECL western blotting. β-actina foi usada como controle interno de carregamento e transferência de proteínas iguais. A expressão de proteínas foi quantificada pelo Software Quantity-One, e a taxa de expressão foi rotulada sob a banda.

Modelo Animal

Camundongos nude BALB/c machos (~ 17 g) foram adquiridos do Centro de Pesquisa de Animais Modelo da Universidade de Nanjing e criados em ambiente axênico (animais livres de patógenos específicos). Modelos tumorais foram estabelecidos por injeção subcutânea de suspensão celular (células SGC-7901, 100 μL, 1 × 10⁶/mL) no ombro dos camundongos nude. Imagens brilhantes de tumor foram geradas 15 dias após a injeção subcutânea de células tumorais. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Centro de Animais de Laboratório da Universidade Agrícola de Anhui (Número de Permissão: SYXK 2016-007). Um paquímetro foi usado para determinar o diâmetro longitudinal máximo (comprimento) e diâmetro transversal máximo (largura) de cada tumor. O volume tumoral foi então calculado usando a fórmula comprimento × largura² × 0,5.

Estudo Anticancerígeno In Vivo

Testes de acompanhamento foram realizados quando o volume tumoral atingiu 50 mm³. Camundongos divididos aleatoriamente em cinco grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos intravenosos: PBS (100 μL), Morina, lipossomos-Morina, Au-Apt e Apt-Au@MSL. Os camundongos foram injetados intravenosamente na cauda a uma dose de 2 mg/kg do material para tratamento. Os tamanhos tumorais dos camundongos foram medidos após 24 dias. O peso corporal e a sobrevivência dos camundongos também foram determinados. Os camundongos foram eutanasiados, e tecidos tumorais e órgãos dos camundongos foram coletados para coloração H&E.

Após bloqueio e permeabilização, as lâminas tumorais foram lavadas com PBS, coradas com ensaio TUNEL e submetidas a contra-coloração DAPI. Imagens de fluorescência foram obtidas por CLSM. Para imagem DAPI, Ex = 358 nm e Em = 461 nm, e para ensaio TUNEL, Ex = 450–500 nm e Em = 515–565 nm.

Ensaio de Avaliação de Toxicidade

Para avaliar a toxicidade do tratamento com Apt-Au@MSL em órgãos vitais, os camundongos nos quatro grupos de tratamento foram sacrificados após 30 dias. Os órgãos importantes (fígado, baço, rins, coração, pulmões e tumor) dos camundongos de todos os grupos foram coletados e corados com H&E. Amostras de sangue também foram coletadas, e glicose sanguínea foi medida. Além disso, os pesos dos camundongos foram determinados.

Resultados e Discussão

Caracterização

O presente estudo visou desenvolver um novo lipossomo que possui as vantagens de nanopartículas (NPs de Au carregadas com Apt) e pode ser efetivamente usado como agente anticancerígeno. As propriedades básicas dos novos lipossomos são importantes para conduzir estudos adicionais. O Apt-Au@MSL foi sintetizado conforme descrito em estudo anterior, com pequenas modificações, e então caracterizado usando vários métodos. A Figura 3b apresenta os resultados de espectroscopia UV-vis, que mostra o pico característico e pode monitorar a formação de NPs de Au. Picos característicos foram observados no espectro UV-vis de NPs de Au em aproximadamente 530 nm. Especificamente, análise de espectros UV-vis exibiu forte absorbância UV, que foi influenciada pela modificação de superfície Apt. Os mesmos resultados foram observados. Picos característicos foram deslocados após lipossomos pH-sensíveis serem revestidos com Morina. O pico característico do Apt-Au@MSL fabricado foi localizado em 362 e 550 nm. Esses resultados indicaram que a síntese foi completada com sucesso. Para caracterização adicional, espectroscopia FT-IR foi conduzida para verificar os resultados da síntese. O deslocamento para o vermelho dos picos característicos de lipossomos-Morina e Apt-Au@MSL indicou ainda mais a modificação bem-sucedida da Morina. Realizamos ensaio de liberação de Morina em PBS em diferentes níveis de pH para determinar a sensibilidade ao pH do Apt-Au@MSL. Esses três valores de pH simulam o ambiente neutro da circulação sanguínea, o ambiente levemente ácido do tumor e o ambiente ácido do corpo intracelular. A porcentagem de liberação de Morina foi detectada por espectroscopia UV-vis. A pH 5,0, cerca de 54% de Morina foi liberada dentro de 24 h, e liberação contínua foi observada nas 96 h seguintes; enquanto isso, a pH 7,4, apenas cerca de 10% de Morina foi liberada dentro de 24 h. Esses resultados mostram que o Apt-Au@MSL exibe boa estabilidade sob condições fisiológicas normais, prevenindo vazamento de fármaco; no entanto, o fármaco é liberado rapidamente no corpo nuclear. Esse comportamento de liberação de fármaco pode efetivamente melhorar o efeito do tratamento. MET e MEV foram conduzidos para elucidar as estruturas do lipossomo e Apt-Au@MSL. MET foi conduzida para elucidar as estruturas das NPs de Au. Como mostrado, as NPs de Au têm tamanho de partícula de cerca de 10 nm, o que é consistente com o tamanho da modificação nos lipossomos. Os resultados de MEV indicam que lipossomos brutos formam exclusivamente vesículas unilamelares com diâmetro não uniforme de cerca de 120 nm, o que é consistente com o tamanho determinado por DLS. Por outro lado, o Apt-Au@MSL mostra que a morfologia de vesículas híbridas é atribuída à modificação Au-Apt. O diâmetro de 150 nm também foi consistente com o tamanho determinado por DLS. Notavelmente, investigação por MET das interações entre lipossomos pH-sensíveis e Au-Apt revelou que as NPs de Au estavam associadas quase exclusivamente com a bicamada lipídica vesicular e localizadas na periferia das vesículas. As medições de ζ-potencial mostram que os potenciais zeta de NPs de Au e Au-Apt são negativos. O resultado mostra que tanto NPs de Au (− 57,1 ± 0,3 mV) quanto Au-Apt são carregados negativamente (− 31,7 ± 0,2 mV). O Apt-Au@MSL foi modificado com lipossomos-Morina carregados positivamente, e o potencial mudou para 36,4 ± 0,3 mV. Adsorção de cargas positivas e negativas é o mecanismo pelo qual Au-Apt e lipossomos-Morina se ligam. Além disso, a Figura 3k representa a mudança na taxa de encapsulamento da partícula ao longo do tempo, indicando a estabilidade da partícula por um período de tempo. Como mostrado, a taxa de encapsulamento da partícula mal muda dentro de 24 h, indicando que a partícula exibe boa estabilidade ao longo do tempo. A curva padrão de concentração de Morina versus absorbância UV-Vis de Morina foi preparada para estudar a taxa de encapsulamento de lipossomo-Morina e Apt-Au@MSL. Os resultados revelaram que a eficiência de aprisionamento de lipossomo-Morina e Apt-Au@MSL pode atingir 90,2% e 89,6%, respectivamente.

Teste de Atividade Anticancerígena do Apt-Au@MSL

In Vitro

A Morina exibe atividade antitumoral superior, mas tem baixa biodisponibilidade devido à sua baixa solubilidade em água. Após a Morina ser encapsulada por lipossomos pH-sensíveis e transformada em material solúvel em água, a superfície do lipossomo foi modificada usando Au-Apt para obter o efeito antitumoral direcionado. A Figura 4a mostra a atividade anticancerígena do Apt-Au@MSL por ensaio MTT in vitro. A concentração do fármaco é definida pela concentração de Morina. O grupo tratado com Morina não mostrou atividade anticancerígena aparente, comparado com o grupo branco. No entanto, o grupo tratado com Morina encapsulada por lipossomos pH-sensíveis exibiu atividade anticancerígena aprimorada. O resultado sugere que a atividade antitumoral de lipossomos-Morina foi superior à da Morina bruta. Simultaneamente, descobrimos que a atividade antitumoral do lipossomo modificado por Apt (Apt-Au@MSL) foi melhorada. A Tabela 1 lista os valores IC₅₀ de Morina, lipossomos-Morina, Apt-Au@MSL e cisplatina. Morina, lipossomos-Morina e Apt-Au@MSL exibiram ampla gama de atividade anticancerígena em células tumorais. Eles mostraram preferência distinta por células SGC-7901 com alta potência e baixa toxicidade para células humanas normais. O valor IC₅₀ do Apt-Au@MSL foi 15,6 ± 1,5 μg/mL para células SGC-7901. Esses resultados foram confirmados adicionalmente por teste RTCA. Células SGC-7901 foram cultivadas com Apt-Au@MSL em diferentes concentrações; o grupo branco foi tratado com PBS, e o grupo controle consistiu de Morina e lipossomos-Morina. Adesão e espalhamento foram monitorados usando iCELLigence. Os resultados foram amplamente semelhantes aos obtidos por teste MTT. A atividade antitumoral do Apt-Au@MSL foi significativamente maior que a de Morina e lipossomos-Morina. O Apt-Au@MSL pôde inibir a proliferação de células SGC-7901 com aumento de concentração. Mudanças na morfologia celular após tratamento com Apt-Au@MSL também foram observadas por microscopia de fluorescência. As células SGC-7901 sem Apt-Au@MSL mantêm a integridade estrutural da célula. Por outro lado, a integridade celular é comprometida após as células serem tratadas com Apt-Au@MSL em diferentes concentrações.

Análise de Morte Celular Apoptótica

Análise quantitativa de apoptose foi realizada por citometria de fluxo usando coloração Annexina-FITC. As células foram coradas com PI e Annexina V-FITC e então analisadas usando citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter). Annexina V foi usada para detectar células apoptóticas iniciais ligadas à fosfatidilserina exposta, e marcação PI foi usada para colorir células apoptóticas tardias. A razão de apoptose foi 1,57% para os grupos brancos. As células tratadas com Morina mostraram razão de apoptose de 3,51%. Apt-Au@MSL em diferentes concentrações exibiu capacidade indutora maior com razões de apoptose de 7,44%, 10,75%, 15,53% e 40,77%. A apoptose aprimorada também confirmou a excelente atividade anticancerígena induzida pelo Apt-Au@MSL. A razão de apoptose das células SGC-7901 aumentou com aumento da concentração de Apt-Au@MSL.

Estudo de Atividade Anticancerígena por Ensaio de Fluorescência

O efeito antitumoral em células SGC-7901 induzido pelo Apt-Au@MSL foi avaliado intuitivamente por ensaios de fluorescência LIVE/DEAD. Após as células serem incubadas com Morina, lipossomos-Morina e Apt-Au@MSL em diferentes concentrações, foram co-coradas com kit LIVE/DEAD por 30 min sob condições de escuro. No grupo branco, todas as células de fluorescência verde representam células vivas. Os grupos controle, incluindo Morina e lipossomos-Morina, mostram o número de células de fluorescência vermelha. No entanto, as células tratadas com Apt-Au@MSL em diferentes concentrações exibiram claramente grande número de células apoptóticas. Com aumento da concentração, células vivas diminuíram gradualmente. A porcentagem de células mortas aumentou predominantemente, e a densidade celular diminuiu. O resultado confirmou que o Apt-Au@MSL pode efetivamente promover apoptose tumoral.

Estudo de Integridade Celular

Para confirmar a influência de captação e transporte do Apt-Au@MSL na célula SGC-7901, conduzimos ensaio MET. A mudança na morfologia celular foi observada por MET. Imagens de MET foram conduzidas para observar a estrutura interna das células e fornecer referência para mecanismos anticancerígenos. As imagens do grupo branco de células SGC-7901 sem tratamento exibiram mudanças significativas na morfologia e aparência de paredes celulares claras. No grupo controle (Morina e lipossomos-Morina), a morfologia celular mostrou dano parcial, e a região nuclear contraiu. No entanto, mudanças significativas na parede celular e estrutura interna também foram observadas após exposição ao Apt-Au@MSL. O citoplasma vazou, e a estrutura nuclear tornou-se indistinta. Muitos fragmentos celulares foram formados ao redor de células ocas. Além disso, as paredes celulares se desintegraram ou foram destruídas. Perfis inteiros tornaram-se indistintos, células foram danificadas, e o citoplasma vazou. As setas vermelhas representaram a área de NP de Au. À medida que a concentração de Apt-Au@MSL aumentou, mais regiões de NP de Au apareceram no núcleo. Essa ocorrência sugeriu a liberação de Morina após Apt-Au@MSL entrar no interior da célula, daí o aparecimento de grande quantidade de NPs de Au. Esses resultados sugerem que a atividade antitumoral estava associada à integridade celular comprometida e estrutura nuclear.

Mecanismo Molecular Induzido pelo Apt-Au@MSL

Para explorar o mecanismo molecular da apoptose induzida pelo Apt-Au@MSL, detectamos os níveis de expressão de caspases e PARP. Ativação de caspase-3, -8 e -9 foi primeiro detectada com substratos específicos. Como mostrado, o tratamento com Apt-Au@MSL induz ativação dependente de dose de caspase-3, -8 e -9. Caspase-9 promove apoptose mediada por mitocôndrias mais do que caspase-8, indicando que a via de sinalização de apoptose mediada por mitocôndrias é dominante. Análise Western blot confirmou ainda a existência de apoptose induzida pelo Apt-Au@MSL no nível proteico. Após as células serem tratadas com Apt-Au@MSL, ativação de caspases e clivagem de PARP mostram dependência de tempo e dose. Em conclusão, o Apt-Au@MSL inibe o crescimento de células SGC-7901 principalmente induzindo apoptose.

Apt-Au@MSL Inibe Crescimento Tumoral

In Vivo

As atividades antitumoral in vivo do Apt-Au@MSL foram avaliadas usando modelo de xenoenxerto tumoral SGC-7901. Comparação das imagens dos tumores com as do grupo controle (Morina e lipossomos-Morina) mostrou que camundongos tratados com Apt-Au@MSL reduziram marcadamente o peso e tamanho do tumor. As curvas de volume tumoral relativo e curvas de peso dos camundongos indicam que o Apt-Au@MSL in vivo exibe maior eficiência anticancerígena que os outros grupos de tratamento. Nenhuma diferença significativa no volume tumoral médio foi indicada entre o grupo controle (Morina e lipossomos-Morina) e o grupo branco. O volume tumoral do grupo Apt-Au@MSL foi apenas quase um décimo do grupo branco e quase um sexto do grupo controle. O resultado indicou que Morina bruta e lipossomos-Morina a 40 mg/kg não exerceram efeito na taxa de crescimento dos tumores. No entanto, o Apt-Au@MSL pôde inibir o crescimento tumoral. O peso corporal dos camundongos nos diferentes grupos (PBS, Morina, lipossomos-Morina e grupos Au-Apt) não mostrou flutuação marcada durante o período de tratamento. Esse resultado sugeriu que o tratamento foi tolerado e não causou efeitos colaterais agudos. Notavelmente, descobrimos que camundongos com tratamento Apt-Au@MSL mostraram sobrevivência marcadamente prolongada. Os camundongos sobreviventes neste grupo comportaram-se normalmente, não mostrando sinal aparente de condição não saudável. Esses resultados demonstraram que a administração de Apt-Au@MSL pode inibir o crescimento tumoral em modelos de camundongos xenoenxertados.

Análise Histológica da Atividade Anticancerígena

Coloração H&E de tecido tumoral e amostras de órgãos foi conduzida após fixação e tratamento. Eficácia do tratamento com respeito à morte de células tumorais também foi avaliada por coloração H&E de tecido tumoral de diferentes grupos. Camundongos tratados com Au-Apt, Morina e lipossomos-Morina mostram a mesma extensão de dano térmico que os camundongos no grupo branco. Nenhuma apoptose aparente foi observada no grupo branco. As seções de tecido tumoral consistiam de células tumorais compactamente empacotadas. No entanto, o tratamento com Apt-Au@MSL exibiu o dano mais significativo ao tecido tumoral, com apoptose celular moderada no tumor. O resultado sugeriu atividade anticancerígena nos modelos de camundongos tratados com Apt-Au@MSL. Para investigar ainda a razão de células apoptóticas em tecido tumoral in vivo, ensaio TUNEL foi realizado para detecção de células apoptóticas. As células apoptóticas em tumores podem ser coradas com fluorescência verde para indicar apoptose. As imagens mescladas mostram menos regiões de fluorescência verde no grupo branco e grupo controle (Morina e Au-Apt), indicando presença de menos células apoptóticas. As células dos camundongos tratados com lipossomos-Morina aparecem parcialmente apoptóticas. Além disso, grande número de regiões de fluorescência verde foram observadas no grupo tratado com Apt-Au@MSL, indicando grande quantidade de células apoptóticas. Os resultados foram consistentes com os da coloração H&E, confirmando que o Apt-Au@MSL pode promover apoptose tumoral in vivo.

Avaliação de Toxicidade In Vivo

A potencial toxicidade in vivo é frequentemente uma preocupação significativa para aplicação clínica de medicamentos anticancerígenos. Para verificar a aplicabilidade do Apt-Au@MSL in vivo, os camundongos foram avaliados sob diferentes tratamentos (Morina, lipossomos-Morina, Au-Apt e Apt-Au@MSL). Ensaios bioquímicos sanguíneos também foram conduzidos para examinar possíveis mudanças na bioquímica dos camundongos após tratamento. O índice de glicose sanguínea para função sanguínea dos grupos Apt-Au@MSL foi semelhante aos dos grupos branco e controle. Nenhuma diferença no peso corporal foi encontrada em cada grupo. Um aumento constante foi observado, indicando que o fármaco não exibiu toxicidade. Coloração H&E de seções de órgãos não mostrou sinal de dano ou inflamação no grupo tratado com Apt-Au@MSL, comparado com grupos branco e controle. Essa descoberta indicou que PBS, Morina, lipossomos-Morina, Au-Apt e Apt-Au@MSL tiveram efeitos colaterais negligenciáveis in vivo. Esses resultados, bem como os da coloração H&E, indicam ainda mais segurança no uso de Apt-Au@MSL para tratamento tumoral.

Conclusões

Em conclusão, este estudo apresenta a síntese de um nanomaterial antitumoral, Apt-Au@MSL. O Apt-Au@MSL exibiu excelente monodispersidade e propriedades de direcionamento tumoral. A polaridade da Morina foi modificada, e a atividade antitumoral foi aprimorada. O pH da solução foi 5,0, e a taxa de liberação de Morina do Apt-Au@MSL foi a máxima nos experimentos de caracterização. O Apt-Au@MSL mostrou que a morfologia de vesículas híbridas era atribuível à modificação Au-Apt. O diâmetro de 150 nm foi consistente com o tamanho determinado por DLS. Selecionamos nosso modelo de célula cancerígena por ensaio MTT e descobrimos que células SGC-7901 poderiam efetivamente suprimir proliferação. O IC₅₀ do Apt-Au@MSL foi 15,6 ± 1,5 μg/mL para células SGC-7901. Ensaios citométricos de fluorescência confirmaram que o Apt-Au@MSL pode ser usado como material anticancerígeno efetivo e induziu apoptose in vitro. O Apt-Au@MSL encontrado na célula interna, como mostrado nas imagens de MET, sugeriu que o Apt-Au@MSL pode direcionar a célula cancerígena. A administração de Apt-Au@MSL pode inibir o crescimento tumoral em modelos de camundongos xenoenxertados, conforme determinado por testes de peso tumoral. Coloração H&E e ensaio TUNEL confirmaram ainda que o Apt-Au@MSL pode promover apoptose tumoral in vivo. Tanto testes bioquímicos sanguíneos quanto coloração H&E sugeriram que esses materiais exibem toxicidade aguda negligenciável e boa biocompatibilidade in vivo.