Nanopartículas biocompatíveis como uma plataforma para aumentar a eficácia antitumoral da combinação cisplatina-tetradrina

Resumo

A terapia combinada tem sido uma estratégia padrão no tratamento clínico de tumores. Demonstramos que a combinação de Tetradrina (Tet) e Cisplatina (CDDP) apresentou uma acentuada atividade anticâncer sinérgica, mas os efeitos colaterais inevitáveis limitam sua concentração terapêutica. Considerando as diferentes propriedades físico-químicas e farmacocinéticas das duas drogas, nós as carregamos em um nanoveículo juntos pelo método aprimorado de dupla emulsão. As nanopartículas (NPs) foram preparadas a partir da mistura de poli (etilenoglicol) -policaprolactona (PEG-PCL) e policarprolactona (HO-PCL), de modo que CDDP e Tet podem ser localizados nos NPs simultaneamente, resultando em baixo efeito de interferência e alta estabilidade . Imagens do microscópio de fluorescência revelaram a captação celular de agentes hidrofílicos e hidrofóbicos entregues pelos NPs. Estudos in vitro em diferentes linhas de células tumorais e tecido tumoral revelaram aumento da inibição tumoral e taxas de apoptose. Quanto aos estudos in vivo, eficácia antitumoral superior e efeitos colaterais reduzidos foram observados no grupo NPs. Além disso, ¹⁸ A imagem FDG-PET / CT demonstrou que os NPs reduziram as atividades metabólicas dos tumores de forma mais proeminente. Nossos resultados sugerem que os NPs copoliméricos em bloco de PEG-PCL podem ser um portador promissor para quimioterapia combinada com eficácia sólida e efeitos colaterais menores.

Introdução

Com o desenvolvimento da terapia abrangente de tumor, os compostos de platina desempenham um papel importante no tratamento de vários tipos de câncer, entre os quais a cisplatina (CDDP) é amplamente utilizada na clínica [1, 2]. Hoje em dia, o CDDP ainda é significativo quando combinado com a imunoterapia tumoral, apresentando um efeito favorável em tumores malignos, como o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) [3]. No entanto, esses agentes quimioterápicos sempre alcançam atividade antitumoral às custas de toxicidade indesejável [4], de modo que os agentes terapêuticos que podem reduzir a toxicidade e aumentar a eficácia da quimioterapia têm sido explorados incessantemente [5, 6]. A tetrandrina (Tet) é membro do alcalóide bis-benzilisoquinolina [7], apresentando efeito satisfatório na sensibilização à quimioterapia. Nosso trabalho anterior demonstrou que a combinação de Tet e CDDP tem uma acentuada atividade anticâncer sinérgica ao inibir a expressão de genes associados a agentes quimioterápicos, incluindo o grupo de complementação cruzada 1 (ERCC1) de reparo por excisão, sintase de timidilato (TS), β- tubulina III, etc [8]. No entanto, a aplicação clínica do Tet sofre de sua baixa solubilidade em água e baixa biodisponibilidade oral [7]. Além disso, o CDDP hidrofílico se distribui mais facilmente na matriz extracelular (ECM), enquanto o Tet hidrofóbico penetra nas membranas lipídicas pode ser transportado através das células, de modo que os dois medicamentos não podem realmente trabalhar juntos. Portanto, é essencial encontrar uma forma que possa efetivamente administrar os dois medicamentos simultaneamente, melhorando o efeito antineoplásico com redução dos efeitos colaterais.

Avanços recentes no campo da nanotecnologia gerem novas abordagens para o diagnóstico e tratamento do câncer [9, 10]. Nanopartículas (NPs) construídas com copolímeros anfifílicos, especialmente polietilenoglicol (PEG), são conhecidas por sua capacidade de reduzir a aderência da proteína sérica e prevenir a captação pelo sistema reticuloendotelial (RES) [11]. Se usados para transportar drogas hidrofóbicas, os nanocarreadores aumentam a solubilidade com tato e prolongam, bem como aumentam a residência da droga na circulação sanguínea e no tumor [12]. Com o uso clínico de NPs copoliméricos, a biocompatibilidade dos NPs atrai cada vez mais atenção. Por exemplo, descobertas recentes revelaram que algumas nanopartículas injetadas de dióxido de titânio, sílica e ouro aceleram o intravasamento e o extravasamento de células cancerosas em modelos animais [13]. Os NPs preparados a partir de nanomateriais com boa biocompatibilidade e segurança, principalmente aqueles aprovados pelo FDA, são os melhores candidatos a carreadores de drogas.

Preliminarmente, conseguimos construir NPs carregados com CDDP [14, 15] e NPs carregados com Tet usando polietilenoglicol-poli (caprolactona) (PCL-PEG) [16], cujos efeitos antitumorais in vivo foram ambos demonstrados. Neste estudo, usamos PEG-PCL para a co-entrega de CDDP e Tet. Com uma carga quase neutra, o PEG forma a camada hidrofílica de uma nanopartícula, que oculta epítopos antigênicos e evita a reação imunológica [14]. Imagens do microscópio de fluorescência demonstraram que o celular pode captar agentes hidrofílicos e hidrofóbicos entregues pelos NPs. Os resultados de estudos in vitro, não apenas em diferentes linhagens de células tumorais, mas também em tecidos tumorais, revelaram que as NPs CDDP-Tet inibem o crescimento tumoral de forma mais eficaz do que as drogas livres. Quando pesquisado in vivo, o aumento da eficácia antitumoral e diminuição dos efeitos colaterais foram observados no grupo NPs. Além disso, ¹⁸ A imagem FDG-PET / CT mostrou a taxa de metabolismo mais pobre do tumor no grupo de NPs, indicando assim a capacidade dos NPs de CDDP-Tet em retardar o crescimento do tumor.

Métodos

Materiais

Reagentes e células

CDDP (fórmula molecular PtCl ₂ (NH ₃ ) ₂ ) foi adquirido da Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Jinan China) [15]. Tetrandrina (fórmula molecular C ₃₈ H ₄₂ N ₂ O ₆ ) foi obtido como um pó com pureza> 98% da Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, China) [16]. Metoxipolietilenoglicol [MePEG; peso molecular médio ponderal (Mw =4 kDa; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China] foi desidratado por destilação azeotrópica com tolueno e, em seguida, seco a vácuo a 50 ° C por 12 h antes do uso. ε-caprolactona (ε-CL; Aldrich , EUA) foi purificado por secagem sobre CaH ₂ à temperatura ambiente seguida de destilação sob pressão reduzida. Álcool polivinílico (PVA; grau de polimerização =500, grau de alcoolização =88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., China) e octoato estanoso (fórmula molecular SnCl2) (Sigma) foram usados conforme recebidos. Meio RPMI 1640 (Gibco, EUA), soro de sangue de vitela (Lanzhou Minhai Bioengineering, China) e brometo de dimetiltiazoli-2,5-difeniltetrazólio (MTT; Amersco, EUA) foram usados conforme recebidos.

Linha celular de câncer gástrico humano bem diferenciado MKN ₂₈ , linha de células de adenocarcinoma colorretal humano LoVo, linha de células de câncer cervical humano Hela e linha de células de hepatoma murino H ₂₂ foram obtidos no Instituto de Biologia Celular de Xangai (Xangai, China). Todas as linhas celulares foram propagadas em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro bovino, penicilina (100 U / mL) -streptomicina (100 g / mL), piruvato, glutamina e insulina a 37 ° C em uma atmosfera saturada de água com 5% CO ₂ .

Síntese dos copolímeros

Conforme descrito anteriormente [16, 17], os copolímeros mPEG-PCL e HO-PCL foram sintetizados por uma copolimerização de abertura de anel. Resumidamente, uma quantidade predeterminada de ε-CL foi adicionada a um tubo de polimerização contendo PEG e uma pequena quantidade de octoato estanoso (0,1% p / p). O tubo foi então conectado a um sistema de vácuo, selado e colocado em um banho de óleo a 130 ° C por 48 h. Para a síntese de copolímeros HO-PCL, quantidades pré-determinadas de ε-CL e octoato estanoso foram adicionadas a um tubo de polimerização sem secagem. Após a polimerização estar completa, os copolímeros em bruto foram dissolvidos com clorofórmio e precipitados em uma quantidade em excesso de metanol frio para remover o monômero e oligômero que não reagiram. Os precipitados foram então filtrados e lavados com água várias vezes antes de serem completamente secos a pressão reduzida.

Preparação de nanopartículas carregadas com CDDP-Tet

Quantidade predeterminada de CDDP e nanopartículas carregadas com Tet foram preparadas pelo método de emulsão dupla (DE) [14, 18]. CDDP e Tet foram emulsificados com 1 mL de solução de diclorometano (DCM) contendo 5 mg de mPEG-PCL e 15 mg de HO-PCL, por sonicação por 15 s (15 W) em um banho de gelo (solução W1). Em seguida, 4 mL de solução W2 de PVA a 3% (p / v) foram adicionados e sonicados por 30 s para fazer uma emulsão W1 / O / W2. A emulsão dupla foi diluída em 50 mL de solução aquosa de PVA a 0,3% (p / v) e o DCM foi evaporado sob vácuo. As nanopartículas obtidas foram coletadas, lavadas e liofilizadas (Fig. 1).

O esquema de preparação de NPs de CDDP-Tet

Conteúdo de carregamento de drogas e eficiência de encapsulamento

Para determinar o conteúdo de carga de droga, o pó de NP carregado com Tet-CDDP-liofilizado foi dissolvido em dimetilformamida (DMF) e 30 L desta solução foi misturado com 30 L de 2 mmol / L de HCL seguido pela adição de 2,94 mL de 0,2 mmol / L SnCl ₂ solução em 2 mmol / L HCL. A absorbância a 403 nm foi medida após 1 h com referência a uma curva de calibração usando um Espectrofotômetro Shimadzu UV-1205 (Kyoto, Japão). A quantidade total da droga nos NPs pode então ser calculada. O conteúdo de carga de fármaco e a eficiência de encapsulação foram, respectivamente, obtidos pelas Eqs. (1) e (2):
$$ {\ text {Conteúdo de carregamento do medicamento}} \, (\%) =\ frac {{{\ text {Peso do medicamento nas nanopartículas}}}} {{{\ text {Peso das nanopartículas}}}} \ times 100 \, (\%) $$ (1) $$ {\ text {Eficiência de encapsulamento}} \, (\%) =\ frac {{{\ text {Peso do medicamento em nanopartículas}}}} { {{\ text {Peso do medicamento para alimentação}}}} \ times 100 \, (\%) $$ (2)

Citotoxicidade in vitro das nanopartículas e o estudo de biocompatibilidade

Estudos de captação celular

Com base em nosso trabalho anterior [15], as células LoVo foram colocadas na tampa da placa de 6 poros com cerca de 5 × 10 ⁵ células de cada poro e foram incubadas por 24 h (37 ° C, 5% CO ₂ ) NPs com rodamina B (21 μg / mL) foram adicionados nos poros. Após incubação por 2 h, o patê foi lavado com 4 ° C e 37 ° C de PBS por 3–4 vezes cada. As células LoVo em lamínulas foram então submetidas a um microscópio de fluorescência.

Ensaio de citotoxicidade

A citotoxicidade in vitro das drogas foi determinada por ensaios MTT padrão usando MKN28 e H ₂₂ linhas de celular. Resumidamente, as células foram semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 5000 células por poço 24 h antes do ensaio. Em seguida, as células foram expostas a uma série de doses de CDDP livre, Tet livre, CDDP livre mais Tet e nanopartículas carregadas com CDDP-Tet. Após a incubação, 20 μL de solução de MTT 5 mg / mL foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada por 4 h, permitindo que as células viáveis transformassem o MTT amarelo em cristais de formazan azul-escuro, que foram dissolvidos em 200 μL de dimetil sulfóxido (DMSO). A densidade óptica (DO) de cada poço foi medida por um leitor de ELISA (ELX800 Biotek, EUA) usando comprimentos de onda de teste e referência de 490 e 630 nm, respectivamente. A viabilidade celular foi determinada pela seguinte fórmula:
$$ {\ text {Viabilidade celular}} \, (\%) =\ frac {{{\ text {OD (poço de teste)}}}} {{{\ text {OD (poço de referência)}}}} \ vezes 100 \, (\%) $$ (3)
A compatibilidade in vitro das nanopartículas em branco também foi determinada por ensaios de MTT usando MKN ₂₈ e H ₂₂ linhas de celular. Todos os resultados obtidos nos ensaios de MTT foram confirmados pela repetição do experimento em pelo menos três ocasiões independentes e teste em triplicata de cada vez.

Ensaio de apoptose

O kit Annexin V-FITC (Bender MedSystem, EUA) foi adotado para examinar a alteração das taxas de apoptose celular. MKN ₂₈ as células foram submetidas a uma placa de cultura de 6 cm por 24 h. Os meios de cultura foram substituídos por 1 μg / mL de CDDP livre, 1 μg / mL de NPs carregados com CDDP e 200 μg / mL de NPs em branco, respectivamente. O grupo controle foi substituído por meio de cultura sem drogas. A enzima foi adicionada após 48 h de cultura. As células foram então coletadas, lavadas 2 vezes com PBS e ressuspensas em 100 μL de tampão. Anexina V 5 μL e PI 1 μL foram adicionados por sua vez, misturados e permaneceram por 15 min em temperatura ambiente sem exposição à luz. 400 mL de tampão foram adicionados e submetidos ao processo FCM (BD FACS CantoTM, EUA) para análise das taxas de apoptose celular.

Ensaio de resposta a drogas em histocultura (HDRA)

O HDRA foi realizado de acordo com nossos estudos anteriores [14, 19]. Resumidamente, camundongos ICR machos foram injetados por via subcutânea em ambos os espaços axilares com 4–6 × 10 ⁶ H ₂₂ células em solução salina. Quando os tumores atingiram 400–600 mm ³ em volume, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e espécimes frescos foram amostrados, lavados duas vezes em solução salina, imersos em solução de Hank e divididos em pedaços com pesos de aproximadamente 15 mg. As amostras de tecido foram colocadas em uma placa de 24 poços em que esponjas de gelatina quadradas com dimensões de 1 cm foram imersas em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal de bezerro e sulfato de amicacina (100 UI / mL) contendo CDDP ou CDDP- livre carregados NPs em duas concentrações diferentes. Quatro amostras de tumor foram incubadas sem qualquer droga como controle. Os tecidos foram então cultivados durante 7 dias a 37 ° C 5% CO ₂ . Uma solução mista de colagenase Tipo I (100 L, 0,6 mg / mL) e MTT (100 L, 5 mg / mL) em 100 mg / mL de succinato de sódio foi adicionada. Após incubação por mais 24 h, MTT formazan foi extraído com 1 mL de DMSO, e 100 L de solução de cada poço foram transferidos para os poços de uma microplaca de 96 poços. A DO de cada poço na microplaca foi medida usando o leitor de ELISA com comprimento de onda de teste e referência de 490 e 630 nm, respectivamente. As viabilidades dos tecidos foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula (4):
$$ {\ text {Viabilidade do tecido}} \, (\%) =\ frac {{{\ text {OD (teste)}} / {\ text {Peso (teste) / mg}}}} {{{\ texto {OD (controle)}} / {\ text {Peso (controle) / mg}}}} \ vezes 100 \, (\%) $$ (4)

Eficácia antitumoral in vivo

Medição do volume do tumor

Camundongos ICR machos com peso entre 18 e 20 g foram implantados com linha celular de hepatoma murino H ₂₂ e usado para qualificar a eficácia relativa de NPs carregados com CDDP-Tet. Criados sob circunstâncias específicas livres de patógenos (SPF), os camundongos foram realizados em conformidade com as diretrizes aprovadas pelo Animal Care Committee do Drum Tower Hospital. 0,2 mL de suspensão de células contendo 4–6 × 10 ⁶ H ₂₂ as células foram injetadas por via subcutânea no espaço axilar esquerdo dos camundongos. Os camundongos foram divididos em 6 grupos:grupo controle (solução salina), grupo NPs em branco, grupo CDDP livre (3 mg / kg), grupo CDDP livre mais Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg) e grupo CDDP- Grupo de NPs carregados com Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg). Cada grupo era composto por 6 camundongos. Os tratamentos foram iniciados após 7–8 dias de implantação, e o dia foi designado como ‘‘ Dia 0. ” Cada animal foi pesado no momento do tratamento para que as dosagens pudessem ser ajustadas para atingir as doses de mg / kg relatadas. Os animais também foram pesados a cada dois dias durante o experimento.

Ensaio de imunofluorescência

Os tecidos tumorais dos camundongos no grupo de controle e que receberam CDDP mais Tet e NPs CDDP-Tet livres foram selecionados para observação histológica no 21º dia após o tratamento. Os tumores foram dissecados e fixados em formol tamponado neutro a 10%, rotineiramente processados em parafina, seccionados com espessura de 5 mm. As seções de tecido foram observadas em um microscópio Zeiss LSM510 Meta confocal após as amostras serem coradas com (40,6-diamidino-2-fenilindol) (DAPI, azul) e desoxinucleotidil transferase terminal dUTP marcação final de corte (TUNEL, verde) [20] .

¹⁸ Imagens FDG-PET / CT

Os camundongos do grupo CDDP livre mais Tet e grupo de NPs carregados com CDDP-Tet receberam imagens de PET / CT no dia 6 após o tratamento. 4 horas de jejum foram realizadas antes da injeção do traçador. 14,8 MBq (400 lCi) de ¹⁸ O F-FDG foi injetado na veia da cauda como um radiotraçador. As imagens foram produzidas com um aparelho combinado de PET / CT (Jemini JXL, Philips, EUA). Imagens PET de alta resolução e o mesmo campo de visão CT foram adquiridos com os camundongos 45 minutos após a administração de ¹⁸ F-FDG. As imagens PET foram corrigidas para atenuação e dispersão com base nos dados de CT. A fusão de imagens foi realizada por um sistema automático de fusão de imagens, usando software fornecido pelo fornecedor. Os valores máximos de captação de FDG no tumor foram obtidos para os cálculos do valor de captação padrão (SUV), aplicando correções para peso corporal e atividade injetada.

Métodos estatísticos

As análises estatísticas dos dados foram feitas usando o t de Student teste. Os dados são listados como média ± DP e valores de P <0,05 foram aceitos como uma diferença estatisticamente significativa.

Resultados

Síntese e caracterização de copolímero

De acordo com nosso estudo anterior, sintetizamos os NPs com PEG-PCL e HO-PCL (a proporção ideal foi de 1:3) [14]. O diâmetro, polidispersidade, peso molecular médio numérico (Mn) e peso molecular médio ponderal (Mw) dos NPs copoliméricos de PEG – PCL ideais são mostrados no arquivo adicional 1:Tabela S1. Quando carregados com CDDP e Tet, o conteúdo de carregamento de drogas e a eficiência de encapsulamento também foram medidos (Arquivo adicional 1:Tabela S2), que são semelhantes aos de NPs copoliméricos PEG-PCL carregados com CDDP. No entanto, o conteúdo de carga de droga e a eficiência de carga de Tet são menores do que os NPs copoliméricos de PEG-PCL carregados com Tet, o que pode ter algo a ver com componentes HO-PCL.

Através do espalhamento de luz dinâmico (DLS), o diâmetro dos NPs copoliméricos de PEG-PCL carregados com CDDP-Tet foi de 359,1 ± 5,3 nm com uma polidispersidade em torno de 0,231. Quando observados por TEM e AFM (Arquivo adicional 1:Fig S1a e S1b), os NPs apresentaram forma esférica regular e tamanhos semelhantes que coincidem com os dados do DLS. Além disso, pequenas gotículas são dispersas nas nanopartículas, o que confirma que as nanopartículas são de fato a estrutura de emulsão dupla.

Captação celular de NPs carregados com CDDP-Tet

Partículas carregadas com corantes fluorescentes têm sido aplicadas como um método comum para explorar a absorção celular, que realiza detecção visual e em tempo real. Demonstramos que os NPs carregados com corante podem entrar nas células por meio de endocitose. Neste estudo, a rodamina-B é hidrofílica e pode ser detectada no canal de fluorescência do PI, que é usado para simular o CDDP. Assim como na simulação do Tet, a cumarina-6 é hidrofóbica, cujo sinal pode ser recebido no canal de fluorescência FITC. Após serem co-incubadas com NPs carregadas com cumarina-6 e rodamina-B por 2 h, as células LoVo foram detectadas por microscopia de fluorescência e lente óptica (200 ×). Como pode ser visto na Fig. 2, os sinais de fluorescência podem ser detectados no canal de fluorescência PI, no canal de fluorescência FITC, bem como no canal de fluorescência duplo PI / FITC. Os resultados confirmaram que os NPs podem transportar cumarina-6 e rodamina-B para as células tumorais ao mesmo tempo, com base no qual podemos inferir que CDDP e Tet podem ser carregados nos NPs e absorvidos pelas células tumorais simultaneamente.

Fotografias de células LoVo após 2 h de coloração com NPs carregados com rodamina B e cumarina-6 (200 ×; bar:50 um). a Morfologia celular sob a microscopia de luz, b morfologia celular sob microscópio de fluorescência (canal de fluorescência PI), c morfologia celular sob microscópio de fluorescência (canal de fluorescência FITC), e d morfologia celular sob microscópio de fluorescência (canal de fluorescência duplo PI / FITC)

Citotoxicidade in vitro das nanopartículas

A citotoxicidade de CDDP livre, Tet livre, CDDP livre mais Tet e NPs carregados com CDDP-Tet foram comparados na linha celular gástrica MKN28. A concentração de Tet foi 2,4 vezes maior que a concentração de CDDP. Como mostrado na Fig. 3, a citotoxicidade de NPs carregados com CDDP-Tet foi mais potente entre os quatro grupos. A diferença de citotoxicidade entre o Tet livre e o grupo de NPs e três outros grupos de drogas livres tornou-se proeminente com o aumento da concentração. Resultados semelhantes foram observados em células de câncer cervical humano Hela e células de carcinoma hepatocelular H ₂₂ (Arquivo adicional 1:Fig S2a, S2b).

Citotoxicidade in vitro das nanopartículas. a Viabilidades celulares de MKN28 após serem co-cultivadas com drogas por 48 h. A concentração de Tet foi 2,4 vezes maior que a concentração de CDDP. b Fotografias de células MKN28 sob a microscopia de luz (200 ×) após serem co-cultivadas com drogas por 48 h

O estudo de toxicidade de NPs em branco foi conduzido em nosso trabalho anterior. No estudo anterior, o branco de NPs teve pouca toxicidade em linhas de células tumorais, o que indicou que os NPs em branco são de biocompatibilidade satisfatória [14, 16].

Análise de apoptose in vitro de NPs carregados com CDDP-Tet

Medimos o impacto de 1 μg / mL CDDP livre, 2,4 μg / mL Tet livre, CDDP livre mais Tet (1 μg / mL + 2,4 μg / mL) e NPs carregados com CDDP-Tet (1 μg / mL + 2,4 μg / mL) na taxa apoptótica de células MKN28 após serem co-cultivadas por 48 h. A taxa de apoptose celular foi calculada como Q2 + Q4 (mostrado na Fig. 4). A alteração das taxas de apoptose das células foi semelhante entre os grupos CDDP livre mais Tet, CDDP livre e Tet livre (Fig. 4a-c). No entanto, a taxa de apoptose de células MKN28 induzida por NPs carregados com CDDP-Tet foi significativamente maior do que três outros grupos (Fig. 4d).

Análise de apoptose in vitro por citometria de fluxo a CDDP grátis, b Tet grátis, c CDDP + Tet e d grátis NPs CDDP-Tet

Ensaio de resposta a drogas em histocultura (HDRA)

Para avaliar a eficácia antitumoral dos NPs de forma mais abrangente, avaliamos os efeitos antitumorais de CDDP livre, CDDP livre mais Tet e NPs carregados com CDDP-Tet em H ₂₂ linhas celulares usando HDRA. Como um método clínico para predizer quimiossensibilidade, o HDRA simula as condições práticas dos tecidos tumorais de forma mais autêntica do que o experimento citológico [19], cujos resultados podem ser influenciados pelo microambiente e microestrutura do tecido tumoral como a penetração do fármaco, os valores de pH extracelular, intersticial pressão do fluido, etc.

A concentração de Tet é 2,4 vezes mais do que a concentração de CDDP. Conforme mostrado na Fig. 5, na concentração mais baixa, o efeito antitumoral do CDDP livre e do grupo Tet foi melhor do que o do CDDP, embora os efeitos fossem semelhantes com o aumento da concentração do fármaco. De acordo com a análise de apoptose, os NPs carregados com CDDP-Tet tiveram um efeito antitumoral consideravelmente melhor entre três grupos em todas as concentrações testadas.

Ensaio de resposta ao medicamento em histocultura

Análise de eficácia anti-tumor in vivo

Avaliação de eficácia e efeito colateral

Modelos murinos formados por H ₂₂ O enxerto de linha celular foi tratado com 3 mg / kg de CDDP livre, CDDP livre juntamente com Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg), NPs carregados com CDDP-Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg), respectivamente. O tumor foi obtido 12 dias após o tratamento com a droga. Os tamanhos dos tumores foram detectados a cada 2 dias para determinar o conteúdo ideal de entrega da droga. Como mostrado na curva de crescimento do tumor (Fig. 6), a tendência de crescimento do tumor do grupo de controle, bem como do grupo de nanopartículas em branco, foram semelhantes, mas existia inibição proeminente do tumor em outros três grupos com administração de droga. Comparado com o grupo CDDP livre, o grupo CDDP livre mais Tet apresentou melhor eficácia antitumoral durante os primeiros 6 dias. No entanto, após 6 dias, a diferença da taxa de inibição do tumor entre os dois grupos começou a diminuir e após 10 dias, CDDP livre mais Tet tinha efeito antitumoral ainda pior.

Volume do tumor de H ₂₂ estabelecido xenoenxertos em camundongos ICR durante terapia sob diferentes tratamentos. Os camundongos foram tratados com diferentes estratégias no dia 0, conforme mostrado na figura:3 mg / kg de CDDP livre, CDDP livre juntamente com Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg) e NPs carregados com CDDP-Tet ( CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg), respectivamente. Média ± SD ( n =6) de cada grupo foi medido

Durante os primeiros 6 dias, os efeitos antitumorais dos grupos de NPs carregados com CDDP mais Tet e CDDP Tet livres foram semelhantes. Portanto, murinos que receberam NPs carregados com CDDP-Tet mostraram melhor eficácia antitumoral desde o dia 6 após o tratamento. Arquivo adicional 1:A Figura S3a exibe diferentes tamanhos de tumor de cada grupo. O volume do tumor do grupo de NPs carregados com CDDP-Tet foi o menor, o que pode ser considerado o reflexo direto do efeito antitumoral proeminente. Além da capacidade de inibição do tumor, em comparação com CDDP livre ou CDDP livre mais grupo Tet, havia menos vasos sanguíneos localizados na superfície do tumor). Da mesma forma, conforme mostrado no arquivo adicional 1:Figura S3b, a densidade vascular foi a mais baixa no grupo de NPs em relação ao grupo de controle e CDDP livre mais grupo Tet.

Para investigar ainda mais a proporção de células apoptóticas em tecido tumoral in vivo, o ensaio TUNEL foi realizado para a detecção de células apoptóticas. Como mostrado na Fig. 7, as células apoptóticas em tumores podem ser coradas com fluorescência verde para indicar apoptose. As imagens mescladas mostram menos regiões fluorescentes verdes no grupo de controle e no grupo CDDP livre mais Tet, indicando a presença de menos células apoptóticas. Além disso, um grande número de regiões verdes fluorescentes foi observado no grupo tratado com CDDP-Tet NPs, indicando uma grande quantidade de células apoptóticas. Os resultados confirmaram que os NPs de CDDP-Tet podem promover a apoptose tumoral in vivo.

As células apoptóticas foram detectadas por um ensaio TUNEL (verde) e co-coradas por coloração nuclear DAPI (azul)

Além de uma melhor eficácia antitumoral do que o grupo CDDP livre e CDDP mais Tet livre, os NPs carregados com CDDP-Tet também exibiram menos efeitos colaterais. Como mostrado na Fig. 8a, CDDP livre e CDDP livre mais Tet causaram perda de peso significativa em comparação com o grupo de controle, indicando a toxicidade com a administração direta do fármaco. A curva de mudança de peso do grupo de NPs em branco foi semelhante à do grupo de controle, sugerindo que a toxicidade dos NPs em branco poderia ser desconsiderada. A perda de peso causada por NPs carregados com CDDP-Tet e grupos de controle foram comparáveis durante os primeiros 6 dias. Do dia 6 ao dia 12, os níveis de peso murino no grupo NPs foram ligeiramente menores do que no grupo de controle, mas foram maiores do que CDDP livre ou CDDP livre mais o grupo Tet. Vale ressaltar que o grupo CDDP livre mais Tet contribuiu para óbvia perda de peso e diminuiu o apetite dos camundongos durante os primeiros 4 dias, o que indica que a absorção dos medicamentos foi prejudicial a todo o corpo. Em contraste, os NPs carregados com CDDP-Tet podem ser liberados lentamente nos tecidos e manter a concentração em um grau estável; portanto, os efeitos colaterais foram obviamente reduzidos em comparação com a administração direta do medicamento. Em seguida, os efeitos colaterais do tratamento também foram avaliados por biópsia hepática (Fig. 8b). Em comparação com o grupo de controle, o limite entre as células do fígado do grupo de drogas nuas de drogas duplas é borrado, algumas células do fígado apresentam alterações inchadas, corpos celulares encolhem, picnose nuclear e aumento de eosinofilia (seta amarela), enquanto a droga dupla grupo de nanopartículas. A estrutura das células-tronco é normal, o espaço intercelular é claro e não há nenhuma mudança patológica óbvia. Esses resultados sugeriram que havia pouco prejuízo causado pela entrega de NPs.

Avaliação de efeitos colaterais a pesos corporais de H ₂₂ estabelecido xenoenxertos em camundongos ICR durante terapia sob diferentes tratamentos. b Espécimes de fígado corados com HE estavam em observação microscópica de luz (400 ×)

PET – CT

Para melhor comparar o efeito terapêutico in vivo de cada grupo, os camundongos foram submetidos a TC, PET / TC no dia 6 após o tratamento. As imagens de fusão de CT e PET são exibidas na Fig. 9. PET / CT é um método eficiente na reflexão de alterações metabólicas por meio de ¹⁸ Detecção de captação de FDG [21]. Conforme mostrado na tomografia computadorizada (Fig. 9), o volume do tumor do grupo CDDP livre mais Tet e grupo de NPs carregados com CDDP-Tet eram comparáveis (Fig. 9a), mas a taxa metabólica do tumor no grupo CDDP livre mais Tet era significativamente maior do que Grupo NPs (Fig. 9b). The decreased intensity at the tumor site of the murine received CDDP-Tet-loaded NPs symbolized poor metabolism rate of the tumor, and thereby indicating the capability of NPs to retard tumor growth.

Male ICR mice bearing a subcutaneous H₂₂ tumor at the left axillary (arrows). CT, PET and fused PET/CT images are arranged in the figure from left to right. Tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group (blue arrow) was significantly higher than NPs group (yellow arrow)

Discussão

Considering the heterogeneity and complexity of tumor, combination therapy has become a standard strategy in the clinical treatment of tumor [22]. Nevertheless, simple combination of two individual therapeutics can't necessarily reach anticipated effect because of the different physicochemical and pharmacokinetic properties of the two drugs [23]. To deliver different drugs to tumor cells in a synergistic ratio, a combination therapy vehicle has been designed in this study. CDDP is hydrophilic while Tet is hydrophobic, which cause problems for the loading method. In this study, we used the amphiphilic copolymer with PCL as the hydrophobic core and PEG as the hydrophilic corona [14]. By the improved double emulsion method, Tet located in the oil layer and CDDP located in the water layer, the unique structure imparts the NPs with the capacity to simultaneous encapsulation of Tet and CDDP to form NPs. CDDP and Tet are located in different layers of NPs, resulting in low interfering effect and high stability [24].

The combination therapy vehicle loaded with CDDP and Tet can enhance the efficacy of CDDP-Tet combination. Not only in the cellular experiments, CDDP-Tet NPs also significantly inhibit tumor tissue viabilities in the HDRA assays, validating the anti-tumor effect of the NPs in the model which take into account of tumor microenvironment [19]. As to in vivo study, antitumor efficacy was observed in tumor volume change, which demonstrated that CDDP-Tet NPs effectively suppressed tumor growth with lower proliferation level. ¹⁸ FDG-PET/CT imaging revealed that the glucose metabolism of the tumors in the CDDP-Tet group was inhibited more prominently and early by inducing higher apoptosis level of tumors, which was confirmed in the immunofluorescence assays [21]. Compared with free CDDP plus Tet, CDDP-Tet NPs are faster and safer to take effect, which can be explained by the three mechanisms as follows.

Firstly, as a lipid-soluble drug, Tet can hardly distribute in the ECM and therefore rarely diffuse around tumor cells [9]. Located in the oil phase of NPs, Tet is endowed with better solubility and bioavailability, reaching the tumor sites in the same synergistic ratio as CDDP. Furthermore, CDDP, which used to have systemic side effect, once carried by the nanoparticle, can easily reach the interstitium of tumor tissues from leaky tumor blood vessels and be held within the tumor on account of pressure made by destitute lymphatic drainage [25]. The more CDDP tumor tissues hold, the less damage will be done to normal organs. As a result of passive targeting strategies, CDDP-Tet NPs are much safer than free CDDP plus Tet, which can be observed in the murine body weight changes and liver biopsies.

Drug resistance is regarded as one of the greatest challenges in cancer treatment, not only because of genetic changes at the level of a single cell, but also due to tumor tissues and microenvironment [26]. On one hand, Tet is alkaline, so it will be protonated in the acidic tumor microenvironment and thus can’t cross the electronegative tumor cytomembranes, which is called pH-induced physiological drug resistance [27]. On the other hand, large distances between blood vessels in solid tumors and high interstitial fluid pressure contribute to limited distribution of CDDP and Tet [28]. Carried by the nanovehicle, Tet can enter tumor cells via endocytosis without influence of tumor microenvironment, overcoming the pH-induced physiological drug resistance. The small size of nanocarriers allows them to enter tumor vasculature and preferentially accumulating at the tumor site in vivo [29, 30].

In summary, this study represents an example of delivering a chemotherapeutic drug along with a chemosensitizer simultaneously. Carried by the NPs, both drugs are targeted to tumor site passively, reducing systemic toxicity. Besides, NPs offer a solution to physiological drug resistance by helping the chemosensitizer enter tumor cells more and faster, which play an important role in improving the efficacy of tumor chemotherapy. Therefore, we believed that this PEG–PCL block copolymeric NPs could be a promising carrier for combined chemotherapy.

Conclusions

Based on our previous studies [8, 14, 16], this paper investigated the application of PEG–PCL/HO-PCL NPs for delivery of the combination of two drugs with different physicochemical properties. For in vitro studies, NPs exhibited superior antitumor effect with great biocompatibility. Enhanced antitumor efficacy was observed in tumor volume change and ¹⁸ FDG-PET/CT Imaging as to in vivo study in murine model. The mice in NPs group also exhibited reduced side effects. Additionally, the apoptosis rate of tumor cells was promoted by NPs in both in vitro and in vivo studies. In summary, this block copolymeric NPs could be a promising carrier for the delivery of Cisplatin–Tetradrine combinations and other combinations, with enhanced antitumor effect and reduced toxicity, for the treatment of cancer.