Dieletroforese Modulada em Frequência de Vesículas e Células: Trajetórias Previsíveis em U-Turn na Frequência de Cruzamento

Resumo

Derivamos modelo abrangente para força dieletroforética (DEP) exercida em partículas micro e nanoscópicas quando expostas a campos elétricos modulados em frequência (FM). Ao sintonizar banda de frequência da onda FM para abranger a frequência de cruzamento f_X da parte real do fator de Clausius-Mossotti, nossa teoria prevê reversão sistemática da força DEP cada vez que a frequência instantânea cruza f_X. Experimentalmente, observamos U-turns periódicos em vesículas multilamelares (VMs), células de leucemia de células T humanas (TL), células de leucemia de células B (BL) e células vermelhas do sangue (RB) sob FM-DEP. Rastreamento por vídeo desses U-turns fornece método rápido, <30 segundos, e altamente preciso para determinar f_X, útil tanto para suspensões salinas quanto de nanopartículas onde fluxo de solvente induzido por campo elétrico é minimizado. A precisão de f_X foi confirmada através de dois experimentos independentes: (1) medindo força DEP em única vesícula sob DEP de corrente alternada (AC) em várias frequências senoidais e comparando f_X resultante com aquele obtido de FM-DEP; e (2) avaliando como f_X varia com condutividade do meio circundante para três tipos celulares. A segunda abordagem permitiu estimativa simultânea de condutividades citoplasmáticas e capacitâncias de membrana usando modelo single-shell refinado. Condutividades citoplasmáticas foram ligeiramente menores que faixas previamente relatadas, enquanto capacitâncias de membrana corresponderam de perto a valores da literatura.

Introdução

Polarizabilidade celular é dominada por propriedades elétricas de membrana e citoplasma, que variam com frequência do campo aplicado. Esse espectro dielétrico dependente de frequência permite discriminação livre de rótulo de fenótipos celulares via espectroscopia de impedância, DEP AC, DEP de onda viajante (twDEP) e eletrorotação [1–16]. Comparados com métodos de marcação baseados em anticorpos ou adesivos, essas técnicas elétricas evitam modificação celular e ativação potencial, tornando-as atraentes para triagem celular não-invasiva.

DEP surge em campo elétrico não-uniforme, gerando força proporcional ao gradiente da amplitude do campo e parte real do fator de Clausius-Mossotti (CM). Gradiente de fase dá origem a twDEP ou eletrorotação, que fornecem informação dielétrica complementar. Nosso trabalho estende DEP AC convencional introduzindo campos elétricos FM, permitindo travessia contínua da frequência de cruzamento f_X e permitindo caracterização dielétrica rápida.

Em configurações típicas de DEP AC, campo é aplicado entre eletrodos microfabricados fixos, limitando flexibilidade espacial. Pinças eletrônicas — onde agulhas de eletrodos micromanipuladas entregam campo — oferecem alternativa versátil, livre de contato. No entanto, medições dielétricas requerem tempos de exposição curtos (<30 s) para reduzir efeitos de fluxo de solvente, o que é desafiador com sistemas multi-eletrodos. FM-DEP aborda isso modulando frequência enquanto mantém geometria do eletrodo constante.

Nosso sistema plug-in (Fig. 1) emprega duas agulhas de eletrodo de tungstênio, cada uma com diâmetro de ponta 0,5 µm, posicionadas a 100 µm de distância. Agulhas são acionadas por gerador de forma de onda arbitrária e amplificador de corrente, e todo conjunto montado em micromanipulador patch-clamp sob microscópio invertido. Esta configuração permite manipulação precisa, sem contato, de vesículas ou células individuais acima do substrato.

A onda FM é definida por E(r,t)=A(r)cosθ(t), com fase relacionada à frequência instantânea f(t) por θ̇=2πf(t). Usamos modulação FM de banda larga: f(t)=f_c+Δf cos(2πf_mt), onde frequência de modulação f_m é muito menor que faixa de frequência da portadora, satisfazendo condição de limite de banda larga (WBL) Δf/f_m≫1.

Métodos

Materiais

VMs preparadas de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC; Avanti Polar Lipids). Solução 1 mL DOPC (20 mM) em clorofórmio/metanol (2:1 v/v) seca sob nitrogênio e selada a vácuo por >12 h. Filme fino reidratado com água desionizada e incubado a 25 °C por várias horas.

Linhas de leucemia de células T humanas (JKT-β-del) e leucemia de células B (CCRF-SB) cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% soro fetal bovino e 100 mM piruvato de sódio a 37 °C, 5% CO₂. Após 1 semana, células pelletizadas (370 g, 3 min, duas vezes) e ressuspensas em 1 mL RPMI 1640. Suspensões então diluídas em sacarose isotônica 200 mM para alcançar condutividades desejadas.

Células RB humanas isoladas de sangue total de voluntários saudáveis (início dos vinte anos). Células suspensas em mistura RPMI 1640 com hematócrito 3,1% e diluídas com sacarose 200 mM. Todos experimentos RB realizados dentro de 10 min da coleta de sangue.

Configuração Experimental

Condutividade de suspensões medida com medidor SevenMulti (Mettler-Toledo). Campo FM ou AC gerado por gerador de forma de onda Agilent 33220A e amplificado por amplificador de corrente F30PV. Duas agulhas de tungstênio 0,5 µm, separadas por 100 µm, entregaram campo. Par de agulhas posicionado em 50 µL de suspensão em palco aquecido (25 °C). Imagem realizada com microscópio Nikon TE2000-U e câmera CCD Retiga Exi (25 fps). Resolução de frequência da forma de onda FM verificada dentro de erro experimental.

Filmes adicionais S1–S3 demonstram manipulação DEP AC de células diatomáceas em água desionizada: (S1) rotação a 30 kHz, (S2) empurrar para parede de vidro a 100 kHz, e (S3) recuperação a 20 MHz.

Resultados e Discussão

Observação Experimental de Célula Leucêmica Experimentando FM-DEP

Agulhas plug-in permitem aplicação de campo acima do substrato, facilitando seleção precisa de célula. Filme S4 mostra célula diatomácea triangular respondendo a salto de frequência 100–500 kHz a intervalos de 0,5 s. Filmes S5 e S6 apresentam trajetórias típicas de U-turn de células TL sob FM-DEP (modulação 0,25 Hz, 200 kHz ≤ f(t) ≤ 3 MHz). Fig. 2 exibe trajetória 3-D (x, y, t) onde origem corresponde à ponta da agulha. Eixo x alinha com tangente à superfície do eletrodo; eixo y reflete amplitude do U-turn.

U-turns compreendem três fases: deixando a agulha, aproximando após U-turn, e permanecendo na superfície do eletrodo. Fluxo de solvente frequentemente impede retorno exato ao mesmo ponto, mas tempo de saída e início do U-turn é claro. Período de U-turn observado (≈4 s) corresponde ao período de modulação de 0,25 Hz.

Estudo Teórico sobre FM-DEP

Para partícula esférica com permissividade interna ε_in e condutividade σ_in e externa ε_out, σ_out, força DEP é F_DEP(r,t)=p(r,t)·∇E(r,t), com momento dipolar p(r,t)=4πR³ε_outK_H{E(r,t)+ (τ/Δτ) Ẽ(r,t)}, onde K_H=(ε_in–ε_out)/(ε_in+2ε_out), Δτ⁻¹=τ₀⁻¹–τ⁻¹, e τ₀ e τ são tempos característicos definidos no texto. Média sobre ciclo AC resulta força DEP média ⟨F_DEP⟩=χ(f_AC)∇A_RMS², onde χ(f) é proporcional à parte real do fator CM.

Substituindo campo AC por onda FM e invocando WBL, força DEP média torna-se ⟨F_DEP(r,t)⟩=χ{f(t)}∇A_RMS², mostrando que direção da força muda sempre que f(t) cruza f_X. Isso explica U-turns periódicos observados experimentalmente.

Resolvendo para o instante quando f(t)=f_X dá f_X=f_c–Δf cos(πf_mΔt_n), onde Δt_n é tempo medido da saída do eletrodo ao U-turn. Assim, método FM-DEP fornece determinação rápida de f_X a partir da trajetória observada.

Comparando Frequências de Cruzamento de Única VM Determinadas de FM- e AC-DEPs

Usando suspensão de VM livre de sal, comparamos f_X obtido de FM-DEP (faixa FM 10–50 kHz, f_m=0,1 Hz, período 10 s) e AC-DEP (senoide 30–100 kHz). Da trajetória FM, tempo médio de saída foi 5,8 ± 0,2 s, resultando f_X=35 ± 1 kHz. Medidas de força DEP AC via agulha móvel resultaram em curva força-frequência que ajustou modelo F_DEP(f)= [L+(2πfτ)²H]/[1+(2πfτ)²], com parâmetros ajustados L=–21,02 pN, H=19,03 pN, τ=4,9 µs, dando f_X=34,15 kHz, em excelente acordo com resultado FM.

Dependências de Condutividade das Frequências de Cruzamento para Células Biológicas

Aplicamos FM-DEP a células TL, BL e RB em faixas de condutividade 60–160 mS m⁻¹ (Δf≈700 kHz, f_m=0,25 Hz). Para cada tipo celular, medimos tempos de saída de 10 células por gota, média sobre duas gotas, e derivamos f_X usando Eq. (10). Figura 6 plota f_X resultante versus σ_out. Dados ajustados ao modelo single-shell estendido f_X= [σ_out–(σ_out²)/(2σ_cyt)]/(√2 π R C_m) + f_X0, resultando em capacitâncias de membrana C_m e condutividades citoplasmáticas σ_cyt que concordam com valores da literatura (C_m≈0,5–1,5 µF cm⁻², σ_cyt≈0,3–0,8 S m⁻¹). Consistência entre tipos celulares confirma confiabilidade de FM-DEP para caracterização dielétrica.

Conclusões

Nossa teoria baseada em WBL e experimentos confirmam que FM-DEP produz U-turns previsíveis na frequência de cruzamento, permitindo determinação rápida, <30 segundos, de f_X. Medidas FM-DEP de VMs correspondem a medições diretas de força DEP AC, enquanto dados de f_X dependente de condutividade resultam em capacitâncias de membrana que alinham com literatura. FM-DEP oferece, portanto, método robusto, sem contato, para espectroscopia dielétrica de vesículas e células, e pode ser estendido a partículas sub-micrônicas e nanoscópicas em configurações on-chip para espectroscopia eletrocinética em tempo real.

Abreviações

AC

Corrente alternada

BL

Leucemia de células B

CM

Clausius-Mossotti

DEP

Dieletroforese

DOPC

1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

FM

Modulada em frequência

VM

Vesícula multilamelar

RB

Glóbulo vermelho

RMS

Raiz quadrada média

TL

Leucemia de células T

twDEP

Dieletroforese de onda viajante

WBL

Limite de banda larga