Detecção Rápida no Local de Rongalita em Alimentos Usando Ensaio de Fluxo Lateral Sanduíche Baseado em Aptâmeros

Resumo

Apresentamos um ensaio de fluxo lateral (LFSA) rápido e amigável que emprega dois aptâmeros altamente específicos — A09 e B09 — funcionalizados com nanopartículas de ouro (AuNPs) para detectar rongalita, reagente perigoso ocasionalmente usado como aditivo alimentar. O aptâmero A09 biotinilado é imobilizado em membrana de nitrocelulose revestida com estreptavidina como sonda de captura, enquanto o aptâmero B09 conjugado a AuNPs serve como sonda de sinalização. O ensaio fornece linha vermelha clara na zona de teste para concentrações de rongalita tão baixas como 1 µg mL⁻¹, observável a olho nu dentro de 15 minutos, tornando‑o ideal para triagem no local de produtos agrícolas e alimentícios.

Introdução

Rongalita (sulfinato de hidroximetilsódio) é amplamente empregada em tingimento industrial e química de polímeros como agente redutor. No entanto, sua adição inadvertida ou intencional a itens alimentícios causou sérias preocupações de saúde, incluindo liberação de formaldeído e efeitos adversos relatados na China. Métodos de detecção confiáveis e rápidos são essenciais para salvaguardar segurança alimentar e saúde pública.

Aptâmeros — moléculas de DNA ou RNA de fita simples — oferecem vantagens distintas sobre anticorpos: são sintetizados quimicamente com alta consistência de lote, exibem baixa imunogenicidade e podem ser prontamente modificados para diversas plataformas de sensoriamento. Embora ensaios aptaméricos eletroquímicos e enzimáticos existam para rongalita, eles frequentemente requerem instrumentação complexa e tempos de análise prolongados. Em contraste, ensaios de fluxo lateral (LFSAs) fornecem solução de passo único, portátil e de baixo custo adequada para testes de ponto de cuidado.

Até o momento, apenas alguns ensaios cromatográficos baseados em aptâmeros visaram rongalita. Dado o escrutínio regulatório crescente e prevalência de aditivos ilícitos, desenvolvemos LFSA em formato sanduíche que aproveita especificidade de dois aptâmeros e clareza óptica de AuNPs, permitindo detecção rápida no local de rongalita em diversas matrizes alimentícias.

Materiais e Métodos

Materiais e Reagentes

Rongalita foi obtida da Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Cloreto de ouro(III) tri‑hidratado (HAuCl₄) e citrato trissódico foram comprados da Sigma‑Aldrich (EUA). Reagentes de suporte (NaCl, BSA, sacarose, PEG₂₀₀₀₀, Tween‑20) foram obtidos da Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd. Membranas de nitrocelulose (NC) (Pall 90, Pall 170, Millipore 135) foram fornecidas pela Pall Corporation e Millipore Corporation via Jiening Biotech Company. Amostras de alimentos — incluindo bolo de arroz (ersi), macarrão, tofu e tofu de glucono‑δ‑lactona — foram coletadas de mercados locais.

Preparação de Aptâmeros via SELEX

Protocolo de evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) foi seguido para isolar aptâmeros com alta afinidade para rongalita. Biblioteca inicial de ssDNA de 82‑mer foi incubada com rongalita, sequências não ligadas foram lavadas, e aptâmeros ligados foram amplificados por PCR. Após 12 ciclos de enriquecimento — incluindo contra‑seleção contra compostos estruturalmente relacionados — sequenciamento clonal resultou em dois aptâmeros de alta afinidade: A09 e B09. Suas sequências estão listadas abaixo e foram sintetizadas pela Tsingke Biological Technology.

• Aptâmero primário A09 (biotinilado): 5′‑Biotina‑GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
• Aptâmero secundário B09 (biotinilado): 5′‑Biotina‑GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC‑HS‑3′

Produção de AuNPs

Nanopartículas de ouro (~40 nm de diâmetro) foram sintetizadas por redução de citrato de HAuCl₄ seguindo protocolo padrão. Tamanho e monodispersidade foram confirmados por espectroscopia UV/Vis (λ_max ≈ 530 nm) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Aptâmero secundário B09 foi conjugado a AuNPs incubando 1 mL de solução de AuNP com 4 µL de B09 100 µM, seguido por precipitação induzida por sal, centrifugação e ressuspensão em 1 mL PBS (pH 7,4) contendo 5% BSA, 5% sacarose, 1% PEG₂₀₀₀₀ e 0,05% Tween‑20.

Desenho da Tira de Fluxo Lateral

Montagem do LFSA envolveu almofada de amostra, almofada conjugada de ouro, membrana NC (Pall 90) e almofada absorvente em cartão de suporte. Almofada de amostra foi pré‑tratada com PBS + 3% BSA + 0,05% Tween‑20 e seca a 37 °C por 2 h. Almofada conjugada recebeu B09‑AuNPs. Linha de teste na membrana NC foi criada depositando 1 µL de biotina‑A09 (10 µM) misturado com 10 µL de estreptavidina (1 mg mL⁻¹) por 1 h a 4 °C, enquanto linha de controle consistiu de estreptavidina sozinha. Após secagem, tira foi cortada em seções de 40 mm e armazenada durante noite a 37 °C.

Teste de Especificidade

Tiras de teste foram desafiadas com 80 µL de rongalita, formalina ou água desionizada a 10 µg mL⁻¹. Aparição de linha de teste vermelha distinta confirmou especificidade, enquanto linha de controle permaneceu visível sob todas condições.

Teste Dose‑Dependente

Concentrações de rongalita (0, 0,8, 1, 5, 10 µg mL⁻¹) foram preparadas em PBS e 80 µL aplicado à almofada de amostra. Linha vermelha visível dentro de 15 min definiu limite de detecção, observado a 1 µg mL⁻¹.

Teste de Amostras Alimentícias

Cinco amostras de alimentos suspeitas de conter rongalita foram extraídas (1 g + 10 mL água). Após filtração, 80 µL de cada extrato foi testado no LFSA. Resultados foram cruzados‑validados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).

Resultados e Discussão

Afinidade e Especificidade dos Aptâmeros

Regressão não linear de curvas de saturação rendeu constantes de dissociação de 61,1 ± 16,4 nM para A09 e 39,8 ± 12,7 nM para B09, confirmando ligação forte e específica à rongalita.

a Curvas de ligação para A09 e B09 (determinação de Kd). b Interação de alta afinidade entre aptâmeros e rongalita.

Desempenho do Ensaio

LFSA sanduíche produz linha de teste vermelha quando AuNP‑B09 liga rongalita e é capturado por A09 imobilizado. Linha de controle, formada por estreptavidina ligando excesso de AuNP‑B09, confirma integridade do ensaio. Teste de especificidade contra formalina e água desionizada não produziu falsos positivos, e limite de detecção foi estabelecido em 1 µg mL⁻¹ — bem abaixo dos níveis relatados em amostras de alimentos contaminados.

Especificidade (a) e sensibilidade (b) do LFSA. a 80 µL de rongalita 10 µg mL⁻¹; b Soluções padrão (0–10 µg mL⁻¹) testadas.

Análise de amostras alimentícias confirmou presença de rongalita em vários produtos, corroborada por CLAE. Robustez do ensaio foi atribuída ao tampão otimizado (PBS pH 7,4 + 5% BSA + 5% sacarose + 1% PEG₂₀₀₀₀ + 0,05% Tween‑20) e seleção de membrana NC Pall 90, que proporcionou fluxo ótimo e ligação não específica mínima.

Comparado com métodos cromatográficos (GC, CLAE), LFSA oferece sensibilidade comparável enquanto elimina necessidade de instrumentação sofisticada e tempos de processamento prolongados. Seu baixo custo, operação de passo único e leitura visual tornam‑no ideal para inspeções de segurança alimentar no local e conformidade regulatória.

Conclusões

Desenvolvemos LFSA confiável e custo‑efetivo em formato sanduíche que detecta rongalita em matrizes alimentícias com limite de 1 µg mL⁻¹. O ensaio aproveita especificidade de aptâmeros duplos e clareza óptica de AuNPs, permitindo triagem imediata no local. Esta plataforma pode desempenhar papel fundamental na mitigação de contaminação alimentar por rongalita e salvaguarda da saúde pública.

Abreviações

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

HPLC:

Cromatografia líquida de alta eficiência

LFIA:

Ensaio imuno de fluxo lateral

LFSA:

Ensaio de tira de fluxo lateral

Membrana NC:

Membrana de nitrocelulose

POCT:

Teste de ponto de cuidado

SELEX:

Evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão