Detecção rápida de rongalita por meio de um ensaio de faixa de fluxo lateral sanduíche usando um par de aptâmeros

Resumo

Um ensaio de faixa de fluxo lateral sanduíche (LFSA) usando um par de aptâmeros funcionalizados com nanopartículas de ouro (AuNPs) foi projetado para avaliar a presença de rongalita em produtos agroalimentares. Mais especificamente, um aptâmero A09 primário marcado com biotina imobilizado em uma membrana revestida com estreptavidina e um aptâmero B09 secundário conjugado com AuNPs foram desenvolvidos como sondas de captura e sinalização, respectivamente. Este sistema permite a detecção direta e bem-sucedida de rongalita em amostras de alimentos com concentrações tão baixas quanto 1 μg / mL, simplesmente observando a mudança de cor do controle LFSA e da linha de teste.

Histórico

Rongalite (hidroximetilsulfinato de sódio) é um reagente industrial normalmente usado para tingimento em cuba [1] ou para polimerização em emulsão [2] como agente redutor. A rongalita também pode ser encontrada em condicionadores de água (por exemplo, redução de cloro e cloramina) [3], em removedores de coloração de cabelo cosméticos comerciais, apesar da geração de formaldeído (um conhecido carcinógeno humano), ou mesmo em formulações farmacêuticas como antioxidante [4] . Este composto também causou efeitos adversos na China após sua incorporação em diversos produtos agroalimentares [5]. Este ensaio desenvolvido fornece uma plataforma confiável de detecção de rongalite no local e pode contribuir para resolver problemas de segurança alimentar.

Aptâmeros, oligonucleotídeos de fita simples e oligopeptídeos têm sido considerados como alternativas perfeitas aos anticorpos devido à sua alta especificidade, produção fácil e reprodutível, fácil modificação e menor resposta imunogênica [6]. Estudos recentes revelaram o forte potencial dos aptâmeros como bioprobes para o direcionamento de drogas, biossensorização e o desenvolvimento de novas drogas [7]. Ensaios eletroquímicos [8] e de aptâmeros ligados a enzimas [9] envolvendo alguns aptâmeros foram desenvolvidos como uma ferramenta promissora para a detecção de rongalita. No entanto, esses métodos normalmente sofrem com longos tempos de análise e procedimentos complexos, que dificultam suas aplicações [10].

O ensaio de faixa de fluxo lateral (LFSA, também chamado de teste de faixa) foi desenvolvido pela primeira vez em 1956 como uma extensão lógica da tecnologia de teste de aglutinação de látex [11]. Como uma abordagem de etapa única, o LFSA atraiu atenção significativa para a detecção no local de vários analitos devido ao seu formato amigável, baixo custo de produção, economia de tempo de uso e estabilidade de longo prazo em uma ampla gama de condições [ 12]. Apesar dessas características positivas, as aplicações práticas da plataforma de faixa de fluxo lateral à base de aptâmero ainda não foram comercializadas, e apenas alguns ensaios de faixa cromatográfica baseados em aptâmero foram relatados para a detecção de rongalita em amostras de alimentos [13] . Tendo em vista a alta ocorrência de questões de segurança alimentar e o uso comum de rongalite como um aditivo alimentar ilegal, é necessário desenvolver um LFSA baseado em aptâmero para a detecção rápida e no local deste composto em amostras de alimentos.

Dois tipos de sensores de aptâmeros de faixa de fluxo lateral podem ser desenvolvidos, a saber, competitivo e tipo sanduíche [14]. A plataforma do tipo sanduíche é altamente adequada quando um par de aptâmeros estão disponíveis para uma molécula alvo específica. No presente trabalho, nanopartículas de ouro específicas (AuNPs), que são conhecidos por serem os nanomateriais mais promissores para o desenvolvimento do sensor de aptâmero (por exemplo, propriedades físico-químicas), foram empregadas para o desenvolvimento de uma sonda de detecção de aptâmero de tira sanduíche de fluxo lateral. Enquanto isso, os processos de conjugação de aptâmero foram demonstrados anteriormente em AuNPs via quimissorção ou adsorção física, o que fornece uma plataforma simples, mas sensível para o sensor de aptâmero, que mais tarde foi usado como uma sonda de sinalização neste estudo [15]. Devido às vantagens derivadas do uso de AuNPs e aptâmeros, um ensaio de fluxo lateral visível, rápido, de uma etapa e no local foi desenvolvido para a análise de rongalita em amostras de alimentos. A fim de alcançar este sensor de aptâmero do tipo sanduíche, duas sondas de aptâmero (A09 / B09) foram usadas servindo como sondas de captura e sinalização. Os resultados positivos deste biossensor foram posteriormente confirmados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Métodos

Materiais e Reagentes

Rongalite foi fornecido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. HAuCl ₄ (citrato trissódico desidratado) foi adquirido a Sigma Aldrich (EUA). NaCl, BSA, sacarose, formalina, PEG20000 e Tween20 eram de Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd.

As membranas NC (isto é, pall 90, pall 170 e Millipore 135) são da Pall Corporation e Millipore Corporation, separadamente, e adquiridas da Jiening Biotech Company.

Amostras de alimentos, ersi (fitas quadradas de corte fino de bolo de arroz na China), macarrão, tofu e glucono-δ-lactona-tofu, foram comprados nos mercados próximos.

Preparação do Aptâmero por Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial (SELEX)

O processo SELEX compreende as seguintes etapas (Fig. 1):(i) incubação do alvo com uma biblioteca aleatória de DNA, (ii) isolamento do DNA ligado ao alvo, (iii) amplificação do DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) , (iv) preparação de DNAs de fita simples para a biblioteca de próxima rodada, (v) repetição das etapas i – iv por 5–15 ciclos envolvendo triagem de contador de intervalo com substâncias não-alvo para remover os ssDNAs não específicos, e (vi) clonagem final e sequenciamento da biblioteca enriquecida [16].

Processo típico de seleção de aptâmero (SELEX)

Os aptâmeros foram selecionados seguindo as etapas descritas anteriormente. Resumidamente, foi sintetizada uma biblioteca de aptâmero ssDNA inicial que consiste em nucleotídeos de 82-mer com uma longa sequência aleatória central baseada em 40 de cada aptâmero (Tecnologia Biológica de Tsingke). A sequência aleatória do pool de aptâmeros ssDNA é 5′-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3 ′, onde N significa um nucleotídeo randomizado de A, G, C ou T.

Nesta pesquisa, o primer 1 (5′-GACATATTCAGTCTGACAGC-3 ′) e o primer 2 (5′-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3 ′) foram usados para amplificação da biblioteca.

Para rastrear aptâmeros que se ligam especificamente a rongalite, a biblioteca de ssDNA aleatória sintetizada foi adicionada à placa com rongalite. Em seguida, o ssDNA não ligado foi removido por lavagem; o ssDNA ligado foi recuperado e amplificado por PCR. A afinidade de ligação de aptâmeros aumentou gradualmente conforme a rodada de seleção aumentou.

A especificidade e K _d valor de aptâmeros individuais foi determinado de forma semelhante aos métodos de Tang [17].

As sequências de aptâmeros utilizadas neste trabalho foram as seguintes:

Aptâmero primário A09,

5′-Biotina-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
Aptâmero secundário B09,

5′-Biotina-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3 ′

Estas sequências de aptâmeros (A09 e B09) foram sintetizadas e adquiridas da Tsingke Biological Technology.

Produção de AuNPs

AuNPs foram sintetizados através da redução de citrato de HAuCl ₄ protocolo [18]. A produção monodispersa de AuNPs com tamanho adequado foi confirmada por espectrofotometria UV / Vis (Thermo Scientific ™ Evolution 60S). Com formato esférico (cerca de 40 nm de diâmetro) e AuNPs de cor vermelha escura foram sintetizados. O tamanho desses AuNPs não modificados foi estimado usando a lei de Beer-Lambert em 530 ± 2 nm e microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 2) (JEOL Ltd. JEM-1011).

O aptâmero secundário B09 conjugado com AuNPs foi preparado seguindo os protocolos relatados [18]. Resumidamente, 1 mL dos AuNPs preparados foi incubado com 4 μL da solução secundária de aptâmero B09 (100 μM) e a mistura foi armazenada em uma gaveta à temperatura ambiente por pelo menos 16 h. Um molar de NaCl foi subsequentemente adicionado gota a gota ao frasco após agitação suave à mão até atingir uma concentração final de 0,1 M na mistura. Os frascos foram armazenados em uma gaveta por pelo menos 1 dia antes do uso. Os aptâmeros tiolados não conjugados foram removidos por centrifugação a 12.000 g por 20 min a 4 ° C. Os tubos foram retirados da centrífuga e um líquido sobrenadante límpido foi obtido, com as nanopartículas ficando no fundo dos tubos. A mistura foi centrifugada durante 5 min adicionais no caso do sobrenadante de cor vermelha. O sobrenadante foi suavemente pipetado e as nanopartículas foram finalmente dispersas em 1 mL de tampão PBS 0,01 M (solução salina tamponada com fosfato) (pH =7,4) contendo 5% de BSA, 5% de sacarose, 1% de PEG20000 e 0,05% de Tween20.

Design de faixa de fluxo lateral

O LFSA foi projetado como mostrado na Fig. 3. Resumidamente, a tira continha várias almofadas sobrepostas em uma amostra de cartão de suporte (GF-08, 20 × 300 mm), conjugado de ouro, membrana de nitrocelulose (NC) (Pall 90, 60 × 300 mm) e almofadas de absorção (H-5076, 20 × 300 mm). O comprimento da sobreposição foi de 2 mm. A almofada de amostra foi imersa em um tampão de PBS 0,01 M (pH =7,4) contendo BSA a 3% e Tween20 a 0,05% e subsequentemente seca a 37 ° C por 2 h. A almofada de conjugado de ouro foi tratada com um tampão de PBS 0,01 M (pH =7,4) contendo 5% de BSA, 5% de sacarose, 1% de PEG20000 e 0,05% de Tween20. Os AuNPs funcionais foram subsequentemente pulverizados com um pulverizador (XYZ3010-1429) na almofada de conjugado de ouro tratada. Um microlitro de aptâmero de biotina-A09 (10 μM) foi incubado com 10 μL de estreptavidina (1 mg / mL) por 1 h a 4 ° C. A estreptavidina conjugada com aptâmero foi subsequentemente revestida com um dispensador (XYZ3010-1429) em uma membrana NC para formar a linha de teste, enquanto a estreptavidina (1 mg / mL) foi revestida com o instrumento para formar a linha de controle. Em seguida, a membrana NC tratada foi seca a 37 ° C por 2 h para imobilização. Finalmente, as tiras foram montadas e o LFSA foi cortado em tiras de 40 mm de largura e armazenado a 37 ° C durante a noite até o uso.

Imagens TEM de AuNPs (40 nm)

Configuração típica da tira de teste de fluxo lateral (formato sanduíche)

Teste de especificidade

Oitenta microlitros de uma solução de rongalite (10 μg / mL) foram adicionados à almofada de amostra das tiras montadas. Esta etapa foi repetida para os outros contra-alvos, incluindo formalina e água deionizada para os testes de especificidade. Água desionizada foi usada como controle. Uma linha vermelha deve aparecer na área alinhada esperada. Cada controle foi repetido duas vezes.

Teste dependente de dose

Semelhante ao teste específico, soluções de rongalita com concentrações variáveis (0,8, 1, 5 e 10 μg / mL) foram preparadas. Oitenta microlitros da solução de rongalite foram adicionados à almofada de amostra das tiras montadas. A observação da cor vermelha dentro de 15 min na linha de teste foi considerada como o critério para determinar o limite de detecção.

Teste de amostra de alimentos

Para avaliar a praticabilidade e a precisão deste novo LFSA, cinco amostras de alimentos, possivelmente contendo rongalita adicionada, foram coletadas de um mercado ao redor do instituto. Um grama de amostra foi extraído com 10 mL de água. Em seguida, 80 μL de cada solução de extrato de amostra foram aplicados à tira de fluxo lateral à base de aptâmero para a detecção de rongalita. Esses resultados foram confirmados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Resultados e discussão

As constantes de especificidade e dissociação ( K _d ) dos Aptâmeros Selecionados

Diferentes concentrações de aptâmeros A09 e B09 foram incubadas com uma quantidade fixa de rongalita. As curvas de saturação traçando a absorbância medida a 450 nm contra a concentração de aptâmero de entrada correspondente são mostradas na Fig. 4a. A análise de regressão não linear foi usada para K _d cálculo do valor. O K _d o valor de A09 é 61,12 ± 16,36 nM e B09 é 39,81 ± 12,73 nM. Como mostrado na Fig. 4b, a afinidade de ligação entre A09 / B09 e rongalite é alta.

a Medição do K _d valor de A09 e B09. GraphPad Prism foi usado para realizar análise de ajuste de cura não linear para K _d Cálculo. b A afinidade de ligação específica entre A09 / B09 e rongalite

Especificidade e sensibilidade

O aptâmero A09 marcado com biotina (captura de aptâmero) foi ligado à estreptavidina inicialmente alinhada na membrana. Esta linha foi selecionada como a linha de teste. Enquanto isso, a estreptavidina foi alinhada na zona de controle.

Como mostrado na Fig. 5a, uma vez que o aptâmero secundário AuNP (como uma sonda de sinalização) é ligado a rongalite, o aptâmero primário alinhado na zona de teste é limitado a outro local deste composto. Uma linha vermelha gerada por AuNPs deve aparecer na zona de teste em caso de análise positiva. Com relação ao experimento de controle, a estreptavidina na zona de controle captura o aptâmero B09 marcado com AuNP restante modificado com biotina, fornecendo assim um sinal de controle em todos os momentos.

Especificidade ( a ) e sensibilidade ( b ) do LFSA para rongalite. a 80 μL de uma solução de rongalite (10 μg / mL) foram adicionados à almofada de amostra das tiras montadas. Esta etapa foi repetida para os outros contra-alvos, incluindo formalina, para os testes de especificidade. Água desionizada foi usada como controle. b Soluções padrão de Rongalite com concentrações variáveis (0, 0,8, 1, 5 e 10 μg / mL) foram preparadas. 80 μL das soluções padrão foram pipetados para a almofada de amostra, e a observação da cor vermelha dentro de 15 min na linha de teste foi considerada como o critério para determinar o limite de detecção

Conforme mostrado na Fig. 5b, o resultado mostra que a rongalita foi facilmente detectada a olho nu em concentrações tão baixas quanto 1 μg / mL.

Essas amostras de alimentos foram analisadas por meio do LFSA aqui desenvolvido e os resultados são mostrados na Tabela 1.

Curiosamente, a linha de controle não foi mantida após cada LFSA. Altas concentrações de rongalita ou íons de sal podem resultar em um sinal fraco na zona de controle. Portanto, a composição do tampão de ressuspensão afeta criticamente o desempenho do teste da tira. De acordo com os resultados obtidos, um tampão de PBS 0,01 M (pH =7,4) contendo 5% de BSA, 5% de sacarose, 1% de PEG20000 e 0,05% de Tween20 foi escolhido como o tampão de ressuspensão.

A composição das várias almofadas tem um efeito dramático no desempenho do ensaio de tira. Dentre as várias alternativas, a membrana NC mostrou ser o suporte sólido mais adequado para a adsorção e hibridização de ácidos nucléicos. NC tem sido amplamente utilizado como uma almofada de sinal na faixa de fluxo lateral, uma vez que fornece taxas de fluxo suficientes [19]. Diferentes tipos de tamanho de membranas NC com respectivas taxas de fluxo podem ser adequados para esses ensaios. Neste trabalho, três membranas NC comumente usadas (isto é, pall 90, pall 170 e Millipore 135) adquiridas da Jiening Biotech Company foram testadas. A Pall 90 foi escolhida aqui como a membrana NC mais adequada para LFSA.

Um grande número de tecnologias foram desenvolvidas para detecção de rongalite. No entanto, poucos foram amplamente aplicados na detecção no local, principalmente por causa dos altos custos associados e protocolos complexos, como GC e HPLC, que são incômodos para o operador diário. LFSA, uma abordagem de uma única etapa, tornou-se uma plataforma perfeita devido ao seu formato amigável, baixo custo de produção e conveniência. Apesar da pior sensibilidade do que as tiras do cromatógrafo, o LFSA seria um método promissor no campo de testes de ponto de atendimento.

O LFSA ainda tem uma sensibilidade mais baixa do que as tiras do cromatógrafo. Além disso, as tecnologias LFSA usando aptâmeros mostram algumas vantagens inerentes sobre o imunoensaio de fluxo lateral (LFIA, método baseado em anticorpos) e isso independentemente dos avanços recentes neste campo. Embora ensaios semelhantes também possam ser projetados usando anticorpos, os sensores de aptâmeros oferecem estabilidade e vantagens de baixo custo. Além disso, aptâmeros são mais flexíveis para o desenvolvimento de diferentes formatos, uma vez que são compostos de ácidos nucleicos com hibridização intra e inter-molecular, replicação enzimática e características de fácil determinação de sequência. Em virtude dessas propriedades positivas, vários sensores de aptâmero foram desenvolvidos para ensaios multiplexados.

Além disso, o LFSA pode usar rótulos diferentes, incluindo pontos quânticos recentemente desenvolvidos [20] e fósforos de conversão ascendente [21]. No entanto, entre todos os rótulos relatados, AuNPs são os mais amplamente usados para LFSA. A propriedade mais notável do rótulo Au está em sua capacidade de colorir a membrana NC, permitindo a observação direta a olho nu. Esta característica diferencia o LFSA dos atuais métodos de laboratório caros, tornando esta tecnologia uma ferramenta analítica conveniente.

O teste point-of-care (POCT) tem sido proposto como uma ferramenta ideal para reduzir os custos desses ensaios. A plataforma de biossensor LFSA, o ensaio mais conhecido, é atualmente usada para POCT [22]. A plataforma do biossensor LFIA inclui principalmente formatos sanduíche e competitivos (ou inibidores). Em geral, os ensaios em formato de sanduíche são projetados no caso de moléculas alvo tendo pelo menos dois epítopos. Um aptâmero duplo ligado a rongalite em dois locais de ligação diferentes foi desenvolvido aqui contendo sondas de captura e sinalização montadas no formato do tipo sanduíche.

Conclusões

Um LFSA fácil e de baixo custo com formato de sanduíche foi desenvolvido com sucesso para detecção rápida de rongalita no local. O ensaio envolveu um par de aptâmeros conjugados com AuNPs. Depois de otimizar alguns parâmetros-chave, o ensaio desenvolvido forneceu uma alta sensibilidade com valores de limite de detecção tão baixos quanto 1 μg / mL. Essa tecnologia poderia ser facilmente usada para estudar a contaminação de amostras de alimentos com rongalita. Este ensaio fornece uma plataforma confiável de detecção de rongalita no local e pode contribuir para resolver problemas de segurança alimentar.