Nanopartículas de fósforo preto promovem a diferenciação osteogênica de EMSCs por meio da expressão de TG2 regulada positivamente

Resumo

Em concentrações biosseguras, as nanopartículas de fósforo preto ativam o TG2 e promovem a expressão de ECM, o que promove ainda mais a diferenciação osteogênica de EMSCs. A partir desses resultados, podemos concluir que as nanopartículas de fósforo preto são adequadas como fatores biológicos na engenharia do tecido ósseo. Nanopartículas de fósforo preto (BPs) apresentam excelente biocompatibilidade e boa biodegradabilidade, as quais foram rigorosamente estudadas e comprovadas. No entanto, sua utilização nas áreas de engenharia de tecido ósseo ainda está em sua infância. Assim, o objetivo principal do presente estudo foi investigar os efeitos dos BPs na diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais ectodérmicas (EMSC) in vitro. BPs biocompatíveis com alto rendimento foram preparados com uma técnica de ultra-som simples e eficiente. As EMSCs foram isoladas da mucosa respiratória nasal de rato adulto. Em seguida, tratamos EMSCs com BPs em diferentes concentrações in vitro e examinamos o efeito dos BPs na diferenciação osteogênica de EMSCs. Além disso, o inibidor da transglutaminase 2 (TG2) e o western blot foram usados ​​para esclarecer o mecanismo do efeito promotor dos BPs na osteogênese. Nossos resultados indicaram que os BPs podem aumentar significativamente a diferenciação osteogênica de EMSCs in vitro. No entanto, BPs não tiveram efeito sobre a proliferação de EMSCs. Mecanisticamente, os BPs promoveram a diferenciação da osteogênese de EMSCs por meio da regulação positiva da expressão de TG2. Esses resultados destacam a vantagem do uso de materiais químicos para novas estratégias de engenharia dessas pequenas moléculas altamente promissoras para a regeneração do tecido ósseo.

Introdução

Em ambientes clínicos, a falta de regeneração óssea pode resultar em um prognóstico ruim, mesmo em fraturas ósseas comuns, e existe uma necessidade urgente de materiais regenerativos ósseos [1]. Posteriormente, muitas estratégias terapêuticas, como autoenxertos, aloenxertos e arcabouços ósseos artificiais, têm sido usados ​​como materiais regenerativos. Nos últimos anos, os biomateriais têm demonstrado contribuir com a regeneração óssea, o que mostra o impressionante progresso em aplicações diversificadas de biomateriais [2]. No entanto, o desenvolvimento de um substituto ósseo artificial com excelentes osteocondução, osteoindução e osteointegração ainda é necessário com urgência. Polímeros bioativos [3,4,5] e cerâmicas [6] foram transformados em estruturas para engenharia óssea, e estruturas que aumentam a osteogênese pela liberação de íons [7] são de particular preocupação. Notavelmente, os fosfatos inorgânicos que atuam especificamente em células ou tecidos alvo podem fornecer um caminho promissor para estudar processos biológicos relacionados à mineralização e avançar a engenharia médica guiada por mineralização bioinspirada [8].

Em 2014, Li e colegas de trabalho relataram que nanofolhas de fósforo preto (BP) poderiam ser esfoliadas de BP em massa e demonstraram o potencial das nanofolhas de BP como um novo material bidimensional (2D) para aplicações em dispositivos nanoeletrônicos [9]. Devido às propriedades superiores do BP, como estruturas plissadas distintas em camadas, um intervalo de banda direto ajustável, alta mobilidade de portadores e muitas anisotropias em camada interessantes, o BP está atualmente sob investigação para potenciais aplicações biomédicas [10]. Devido a essas vantagens, os andaimes baseados em nanomateriais da BP para estimular a regeneração óssea foram extensivamente investigados nos últimos 2 anos. Estudos anteriores demonstraram que os biomateriais à base de fósforo podem aumentar a mineralização e a regeneração óssea, aumentando a concentração local de íons fosfato [11]. Embora o BP possa ser considerado um candidato ideal para promover a regeneração óssea, ele é comumente encapsulado em polímeros ou introduzido em um arcabouço de biomaterial por imersão para aplicação por um engenheiro de tecido ósseo. Até agora, os mecanismos moleculares que modulam a regeneração óssea por BP permanecem amplamente desconhecidos e, portanto, impedem o desenvolvimento de terapias baseadas em BP para reparo ósseo na clínica.

As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células estromais multipotentes com capacidade de se auto-renovar e se diferenciar multi-linhagem [12]. Após fraturas ósseas, as CTMs assumem um papel fundamental no processo de reparo ósseo in vivo [13,14,15]. As células-tronco da medula óssea (BMSCs) e seu potencial de diferenciação osteogênica têm sido amplamente estudados ao longo dos anos. No entanto, o processo de coleta de BMSCs pode ser doloroso para os provedores, com riscos de infecção. Originário da crista neural craniana durante o desenvolvimento embrionário, as células-tronco mesenquimais ectodérmicas (EMSCs) podem ser facilmente colhidas da mucosa respiratória da cavidade nasal em adultos. Além disso, as EMSCs são auto-renováveis ​​com potencial de diferenciação multidirecional, o que foi amplamente caracterizado em nossos estudos anteriores [16, 17]. Provamos que as EMSCs podem se diferenciar em várias linhagens celulares, incluindo adipócitos, neurócitos, condrócitos e osteócitos [18, 19]. Essas propriedades especiais tornam as EMSCs uma ferramenta promissora para explorar os mecanismos moleculares potenciais que modulam a diferenciação osteogênica das EMSCs por sinais químicos, incluindo BPs. No entanto, a diferenciação osteogênica é um processo complexo que envolve forte coordenação de proliferação e diferenciação de diferentes células, síntese e mineralização da matriz extracelular (MEC) [20]. Estudos anteriores relataram que a transglutaminase 2 (TG2) é capaz de estimular a osteogênese dos osteoblastos, influenciando a proliferação, diferenciação, produção da matriz extracelular e mineralização dos osteoblastos [21,22,23].

Os relatórios citados acima indicam que os BPs possuem um tremendo potencial para aplicações biomédicas que poderiam ser um indutor de diferenciação osteogênica superior para EMSCs. Até agora, não foram relatadas pesquisas sobre os efeitos dos BPs na diferenciação do EMSC. O objetivo principal do presente estudo foi investigar os efeitos dos BPs na diferenciação e proliferação osteogênica in vitro associada a EMSC. Após essa investigação, o potencial mecanismo molecular dos BPs na proliferação de EMSC e na diferenciação osteogênica também foi examinado cuidadosamente. No geral, nossos dados mostram que os BPs podem ser um agente químico potencialmente útil para os andaimes de engenharia de tecidos.

Materiais e métodos

Nanopartículas de fósforo preto

Bulk BP foi adquirido por Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd. Dimetilsulfóxido (DMSO), hidróxido de sódio (NaOH) e N -metil-2pirrolidona (NMP) foram fornecidos por Aladdin Industrial Co., Ltd. A solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi obtida de Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. Mistura de meio / nutrientes de Eagle modificada por Dulbecco F12 (DMEM / F12; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences), estreptomicina, penicilina, soro fetal bovino (FBS), foram obtidos de BI Science and Technology Co., Ltd.

A síntese da PA foi semelhante à de relatórios anteriores com pequenas modificações [24]. Primeiro, 20 mg de BP em massa foi imerso em solução saturada de NaOH / NMP e refinado com um método mecânico de moagem. A mistura foi então centrifugada durante 10 min a 1500 rpm após o que o precipitado foi descartado. Posteriormente, a mistura foi sonicada por 6 h em um banho de gelo / água e a mistura foi então filtrada através de um filtro BD Falcon de 100 μm (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Finalmente, centrifugação adicional da suspensão (10 min a 13.000 rpm, 4 ° C) foi realizada e o precipitado foi coletado.

Coloração por imunofluorescência de EMSCs na Mucosa Nasal

A fim de mostrar as EMSCs in vivo, a mucosa respiratória do septo nasal foi dissecada e então fixada em 4% de PFA durante a noite para coloração por imunofluorescência. Os tecidos foram lavados com PBS e depois desidratados com soluções gradientes de sacarose. Os tecidos foram incluídos em OCT (Sakura Finetek, Japão) para criosseção e foram cortados em seções coronais em série com uma espessura de 25 mm usando um crio-micrótomo Leica. Essas seções foram lavadas em PBS por 10 min e permeabilizadas com albumina de soro bovino a 1% e Triton-X 100 a 0,1% em PBS. EMSCs na mucosa nasal foram coradas por imunofluorescência com o anticorpo primário de anti-nestina e o anticorpo secundário conjugado com Cy3. Os controles paralelos negativos foram submetidos aos mesmos procedimentos sem anticorpos primários. Os tecidos corados foram observados em microscópio de imunofluorescência (AxioObserver, ZEISS, Alemanha).

Cultura de células

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidado Animal da Universidade Jiangnan, e as Diretrizes Internacionais para Pesquisa Animal foram estritamente seguidas neste estudo. Células-tronco ecto-mesenquimais primárias foram isoladas da mucosa respiratória de ratos de acordo com nossos estudos anteriores [17, 25]. Resumidamente, ratos Sprague Dawley (SD) adultos de 100 g foram anestesiados com injeções intraperitoneais de pentobarbital de sódio (0,05 g / kg). O terço médio do septo nasal foi picado e então incubado em uma solução de tripsina a 0,25% (Hyclone; GE Healthcare Life Sciences) a 37 ° C por 25 min, após o que a mucosa do septo nasal foi cuidadosamente removida. Finalmente, o tecido da mucosa do septo nasal foi cortado em pedaços. A suspensão resultante dos tecidos foi passada através de uma peneira de malha de náilon de 100 µm, centrifugada a 1000 g por 5 min e depois lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). A suspensão de tecido foi colocada em um frasco de cultura de células em meio de crescimento (DMEM / 12 contém 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina e 100 μg / ml de estreptomicina) e cultivada a 37 ° C em 5% de CO ₂ e 95% de ar com umidade saturada. O meio foi substituído a cada três dias, e as células foram passadas todas as semanas. As células em sua terceira passagem foram usadas para todos os estudos de caracterização. A imunofluorescência foi realizada para caracterizar as células cultivadas com anticorpos contra marcadores de células-tronco, incluindo vimentina e nestina [26].

Identificação da capacidade de diferenciação multidirecional de EMSCs

As EMSCs foram semeadas nas placas de 6 poços e cultivadas com meio DEME / F12 por 24 horas a 70% de confluência. O meio foi então trocado com meio de diferenciação osteogênica (DMEM suplementado com FBS 10%, dexametasona 0,1 mM, β-glicerofosfato dissódico 10 mM e ácido l-ascórbico 0,2 mM) para induzir a osteogênese. O meio foi trocado a cada sete dias e a coloração de Alizarin Red S foi realizada com 0,5% de Alizarin Red S (Sigma-Aldrich) no dia 28. EMSCs crescidas em 90% de confluência foram cultivadas em meio de diferenciação adipogênico para induzir adipogênese por 21 dias. A coloração com óleo vermelho foi realizada com o kit de coloração com óleo vermelho (Solarbio) de acordo com as instruções do fabricante.

Caracterização de BPs

Microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi usada para caracterizar a morfologia e o tamanho do PB. As amostras foram preparadas colocando uma gota da solução de BP a uma concentração de 1 mg / ml em água desionizada em uma grade de cobre revestida com formvar e, em seguida, secando ao ar. As amostras foram fotografadas por microscopia eletrônica de varredura (H-7500; Hitachi, Tóquio, Japão). O tamanho médio dos BPs foi analisado com o software Image Pro Plus (Media Cybernetics Inc., MD, EUA). A avaliação do potencial zeta foi confirmada pelo Malvern zeta sizer (ZEN3600). A difração de raios-X (XRD) foi realizada com um difratômetro Bruker D8 Discover em uma geometria para-focada de Bragg-Brentano e radiação Cu Kα. Os padrões de difração foram coletados entre 10 ° e 80 ° de 2 θ com um passo de 0,01 ° 2 θ e tempo de aquisição de 0,2 s por etapa. Os dados resultantes foram avaliados usando o software HighScore Plus 3.0e. Espectrômetro Raman (LabRam HR800) com excitação de laser 514 nm foi usado para medir os espectros Raman da amostra. A composição da superfície da amostra foi medida por espectroscopia de fotoelétrons de raios-X ([XPS] Omicron NanoTechnology GmbH, Germany).

Ensaio do kit de contagem de células-8 (CCK-8)

O efeito dos BPs na proliferação celular foi avaliado usando o ensaio do kit de contagem de células (CCK-8). Resumidamente, EMSCs (3000 células / poço) foram semeados em placas de 96 poços e tratados com BPs (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 e 512 μg / ml) por 24 h a 37 ° C. Para a detecção de CCK8, 10 μl de reagente CCK8 foram adicionados ao meio de cultura 4 h antes da análise. A densidade óptica (OD) a 450 nm foi medida usando um leitor de microplaca (Thermo Fisher Scientific, Madrid, Espanha) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de BPs usada para investigação posterior foi selecionada com base nos resultados do ensaio CCK-8. Quanto à coloração Ki-67, EMSCs (1 × 10 ⁴ ) foram cultivadas em placas de 24 poços e coradas por imunofluorescência para Ki-67 (policlonal de coelho; nº cat. ab15580; abcam; 1:300). DAPI foi usado para corar os núcleos. As imagens foram capturadas por microscopia de fluorescência (ampliação, 200 ×; eclipse Ti; nikon corporation) e foram analisadas com o software Image Pro Plus.

Diferenciação Osteogênica

Para a diferenciação osteogênica, as EMSCs foram semeadas a uma densidade de 3.000 células / cm ² e cultivadas em meio de crescimento para confluência de 70%. As células foram então induzidas com meio de diferenciação de osteogênese por 2 semanas. Notavelmente, a fim de evitar a influência do β-glicerofosfato de sódio, o meio de diferenciação de osteogênese foi suplementado com 10% de FBS, 0,1 mM de dexametasona e 0,2 mM de ácido l-ascórbico (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), mas não com glicerofosfato de sódio β. Após induzir a diferenciação, coloração com fosfatase alcalina (ALP) e vermelho de alizarina e RT-qPCR foram usados ​​para avaliar quaisquer efeitos de BPs na diferenciação osteogênica de EMSCs. EMSCs foram semeados a uma densidade de 2 × 10 ⁵ células / poço em placas de 6 poços e incubadas com meio osteogênico. De acordo com as instruções do fabricante, a coloração de ALP foi avaliada usando um kit de coloração de ALP (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) no dia 14. A coloração com vermelho de alizarina S foi aplicada para visualizar a deposição de fosfato de cálcio. Resumidamente, as células fixadas foram lavadas novamente com água desionizada e incubadas com 1 ml / poço de solução de coloração com vermelho de Alizarina (0,5% (p / v) de Alizarina Red S (Sigma-Aldrich) em PBS por 10 min a 37 ° C. a solução foi retirada, a amostra foi lavada novamente com água deionizada, área de coloração positiva indicativa de nódulos calcificados por campo foi contada com software Image-Pro plus e normalizada para o respectivo controle.

RT-qPCR

RT-qPCR foi realizado conforme descrito anteriormente. Resumidamente, o RNA total foi isolado de monocultura ou classificado usando o kit de purificação de RNA (TaKaRa, Japão), de acordo com as instruções do fabricante. Dois microgramas de mRNA foram transcritos reversamente em cDNA usando um kit de síntese de cDNA (Fermentas). Os primers usados ​​para RT-PCR foram projetados e construídos por Nanjing GenScript Bioengineering Technology and Services Co., Ltd (Nanjing, China), mostrados na Tabela 1. RT-PCR foi manipulado usando um kit SYBR Green / Fluorescein qPCR Master Mix (Fermentas) com o sistema ABI Prism 7500. Os dados foram normalizados para gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) para indicar os níveis de expressão relativa. Todas as medições foram realizadas em triplicado.

Western Blot

As células cultivadas foram lavadas duas vezes com PBS e depois lisadas em gelo por 30 min com tampão de lise RIPA contendo uma fosfatase e coquetel de inibidor de protease. Para coletar o TG2 total, os lisados ​​celulares e ECM nas placas de 6 poços foram coletados por um raspador de células. As placas foram lavadas com PBS e os fluidos de lavagem de células também foram coletados. Os lisados ​​foram colhidos do sobrenadante por centrifugação a 12.000 × g por 5 min, misturado com um volume igual de tampão de carregamento SDS e, em seguida, fervido por 5 min. As concentrações de proteína foram determinadas usando um kit BCA Protein Assay (Beyotime, Shanghai, China, P0012). As proteínas foram extraídas em tampão de lise RIPA, separadas em géis de dodecilsulfato de sódio (SDS) poliacrilamida e transferidas eletroforeticamente para membranas de nitrocelulose (Millipore, LA, EUA). As membranas foram bloqueadas com albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução salina tamponada com Tris 0,01 M (TBS) contendo Tween 20 a 0,5% (Suolaibao, Pequim, China) e manchadas com os anticorpos indicados, incluindo anti-TG2 (1:200; sc-48387, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-FN (1:500; nº cat. BA1772; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.) e anti-LN (1:500; nº cat. BM4921; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), anti-OCN (1:200; sc-390877, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-OPN (1:200; sc-73631, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti- COL I (1:500; cat. No. BA0325; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), a 4 ° C durante 12 h. As membranas foram então feitas reagir com IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (1:5000; Boster, Wuhan, China) durante 2 h à temperatura ambiente. As bandas de proteína foram visualizadas usando um substrato Pierce ECL Plus (Thermo Fisher Scientific) e, em seguida, digitalizadas com um Chemiluminescence Imaging System (Clinx Science Instruments, Shanghai, China).

Experimentos de inibição

Para confirmar o envolvimento de TG2, experimentos de inibição de TG2 foram realizados em EMSCs. As experiências de neutralização foram realizadas com um anticorpo neutralizante anti-TG2 (de BD Biosciences, San Diego, CA). As células foram semeadas em placas de 6 poços com meio de cultura normal por 24 horas para aderir e foram tratadas com anticorpo anti-TG2 (10 μg / ml). Ao mesmo tempo, o grupo de controle foi definido. Após ser semeado em placas de 6 poços por 24 h, a osteogênese EMSC foi induzida por 14 dias usando meio osteogênico com BPs (2 μg / ml), e o meio de cultura contendo inibidores foi trocado por meio osteogênico fresco a cada 7 dias. A coloração com vermelho de alizarina S foi aplicada para visualizar a deposição de fosfato de cálcio. O Western blotting foi usado para avaliar os níveis de osteocalcina, osteopontina e colágeno tipo 1 (expressão de OCN, OPN e COL I, respectivamente).

Coloração por imunofluorescência

As células cultivadas foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 8 h a 4 ° C. As células fixadas foram lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas por 30 min em PBS contendo 0,2% de Triton X-100 e 1% de BSA (Suolaibao, Pequim, China). Após a permeabilização, essas células fixadas foram lavadas com PBS e, em seguida, incubadas com anticorpos primários a 4 ° C por 8 h, seguido pela remoção de todos os anticorpos primários. As células foram então lavadas três vezes com PBS e incubadas durante 2 h à temperatura ambiente com anticorpos secundários Alexa Fluor-594 (1:800, Life Technologies Molecular Probes, Carlsbad, CA, EUA) a 37 ° C durante 2 h. Os núcleos foram contrastados com 4′6-diamidino-2-fenilindol ([DAPI]; Sigma-Aldrich). Todos os grupos testados foram observados em microscópio de imunofluorescência.

Análise estatística

Os dados foram obtidos a partir dos três experimentos separados descritos acima e apresentados como média ± desvio padrão (DP). A análise da distribuição de dados foi realizada usando o t do aluno -teste para analisar a significância das diferenças entre os grupos tratado e controle. A análise de variância (ANOVA) de uma via seguida do teste post-hoc de Tukey foi realizada para avaliar as diferenças significativas entre os grupos. p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Caracterização de BPs

A distribuição de tamanho de BP medida por espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi relativamente estreita na faixa de 100 a 200 nm com um valor de pico em 132 nm. O resultado é mostrado na Fig. 1A. O potencial zeta dos BPs foi determinado como - 23,7 ± 0,65 mV (fig. 1B), confirmando a estabilidade dos BPs. O tamanho das partículas foi investigado por microscopia eletrônica de varredura (MEV) (Fig. 1C). Os resultados correspondem bem com a medição da distribuição do tamanho de partícula por DLS.

Caracterização de BPs. A Distribuição de tamanho de nanopartículas de fósforo preto (BPs); B relatório de potencial zeta de BPs com potencial zeta de - 23,7 ± 0,65 mV; C Imagens de microscopia eletrônica de varredura (SEM) das nanofolhas BP (BPNs). D Espectros Raman de BPs; E Difractograma de raios-X e F Espectroscopia de fotoelétrons de raios-X de alta resolução P 2p (XPS) de BPs; G Espectros XPS de BPs

O espalhamento Raman (Fig. 1D) revelou três picos proeminentes em 362,3, 438,5 e 466,9 cm ⁻¹ associado ao modo fonon fora do plano ( A ¹ _g ) e dois modos no avião ( B ² _g e A ² _g ) da BP, [17, 18], respectivamente. XRD (Fig. 1E) mostra a pureza de fase do material preparado, com um tamanho cristalino médio de 102,7 nm. O alargamento do padrão de difração indica o tamanho nanométrico de cristalitos individuais. Os espectros XPS de alta resolução de P 2 p (Fig. 1F) mostram o pico principal em 130 eV correspondendo à ligação P – P do fósforo preto, além de um pico adicional em 135 eV originado de ligações P – O causadas pela oxidação da superfície dos BPs. As superfícies do BP foram examinadas por raio-X de varredura ampla (Fig. 1G).

Caracterização de EMSCs

A coloração por imunofluorescência da mucosa nasal mostrou que as EMSCs positivas para nestina estavam localizadas na lâmina própria sob o epitélio respiratório do septo nasal (Fig. 2A). As EMSCs cultivadas na terceira passagem apareceram como células semelhantes a fibroblásticos e proliferaram rapidamente em placas de plástico (Fig. 2B). Avaliamos a diferenciação osteogênica em meio osteogênico por coloração com vermelho de alizarina no dia 28 (Fig. 2C). A diferenciação adipogênica em meio de indução adipogênica foi avaliada no dia 21 por coloração com solução de óleo vermelho-O (Fig. 2D). A coloração por imunofluorescência mostrou quase todos os marcadores celulares da crista neural expressos EMSCs, como nestina (> 95%), como mostrado na Fig. 2E e vimentina (> 95%), como mostrado na Fig. 2F. Os resultados para a coexpressão de marcadores de células-tronco indicam que essas EMSCs são um tipo de célula-tronco mesenquimal.

Identificação das células-tronco mesenquimais ectodérmicas (EMSCs). A As EMSCs positivas para nestina (cy3, red) estavam localizadas na lâmina própria sob o epitélio respiratório do septo nasal; B Uma imagem de contraste de fase mostrou que as EMSCs cultivadas na terceira passagem apareceram como células semelhantes a fibroblásticas e proliferaram rapidamente em placas de plástico; C As EMSCs diferenciadas osteogênicas em meio osteogênico foram coradas por vermelho de alizarina; D As EMSCs adipogênicas diferenciadas em meio de indução adipogênica foram coradas com óleo vermelho-O; E , F A coloração por imunofluorescência dos marcadores de células da crista neural mostrou que quase todas as EMSCs expressaram nestina e vimentina. O IgG-Cy3 (vermelho) foi usado como o segundo anticorpo para a coloração de imunofluorescência e os núcleos foram contra-corados com Hoechst 33342 (azul)

Citotoxicidade

Como um experimento preliminar, o ensaio CCK-8 foi realizado para avaliar a citotoxicidade dos BPs. A viabilidade dos EMSCs após 24 h de exposição aos BPs é mostrada na Fig. 3. Nenhuma citotoxicidade significativa após a exposição a até 32 μg / ml de BPs foi observada. No entanto, a exposição a BPs causa citotoxicidade significativa em doses mais altas (> 32 μg / ml). A expressão de Ki-67 no nucléolo e cromossomos foi observada no grupo de doses baixas (Fig. 4A-C). No entanto, a razão entre os núcleos Ki-67 positivos e a população total de núcleos não mostrou nenhuma diferença significativa em EMSCs tratadas com BP de baixa dose em comparação com controles não tratados (Fig. 4D). Portanto, no presente estudo, escolhemos concentrações de 2 e 4 μg / ml de BPs nos seguintes experimentos nos quais não foi observada citotoxicidade significativa.

A citotoxicidade dos BPs. As células foram tratadas com BPs (0, 2, 4, 8, 16, 32, 64,128, 256 e 512 µg / ml) por 24 h, e a viabilidade de EMSC foi testada por ensaio de proliferação de kit de contagem de células (CCK-8) ( n =9). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). ** p <0,01.

A avaliação da proliferação celular do grupo tratado com BPs. EMSCs foram tratados com BPs (0, 2 e 4 μg / ml) por 24 h. A proliferação celular foi medida por coloração imunofluorescente com anticorpo anti-Ki67 (vermelho) e DAPI (azul), e imagens mescladas foram mostradas ( A - C ) Células Ki67-positivas entre células 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) -positivas foram contadas em dois campos de alta potência em cada uma das três placas. Os dados são expressos como a média ± SD ( D )

Coloração com vermelho de alizarina S

Como mostrado na Fig. 5A, a mineralização nas células foi avaliada por coloração com vermelho de Alizarina S após serem tratadas com o meio condicionado por 14 dias. Nódulos de cálcio foram observados em três grupos, enquanto nódulos de cálcio sem forma estavam presentes no grupo controle. Em comparação com o grupo de controle, os nódulos de cálcio depositados nos grupos de 2 e 4 μg / ml eram maiores ( p <0,05), mas nenhuma diferença óbvia foi observada entre os grupos de tratamento ( p > 0,05) como mostrado na Fig. 5C.

Ensaios de coloração com fosfatase alcalina (ALP) e vermelho de alizarina. A EMSCs diferenciados osteogênicos corados com solução de Alizarin Red no dia 14; B A coloração de ALP foi visualizada ao microscópio; C o gráfico mostra a quantificação das áreas de deposição de vermelho de Alizarina; D atividade de ALP significativamente maior foi mostrada no grupo de EMSCs tratados com BP do que no grupo de controle. Os dados foram expressos como média ± DP. ** p <0,01

Testes ALP

A coloração de ALP foi conduzida para estudar a diferenciação osteogênica de EMSCs. Em comparação com aqueles no grupo de controle, as EMSCs nos grupos de 2 e 4 μg / ml de BP eram de cor mais escura (Fig. 5B), sugerindo que a adição de BPs causou aumento da expressão de ALP em EMSCs. As células tratadas com BPs tiveram maior atividade ALP do que o grupo de controle no dia 7 ( p > 0,05), mas nenhuma diferença significativa entre 2 e 4 μg / ml foi observada ( p > 0,05) como mostrado na Fig. 5D.

RT-qPCR

Os principais marcadores de diferenciação, incluindo fator de transcrição relacionado ao runt 2 (RUNX 2), ALP, COL 1, OCN, OPN e proteína morfogênica óssea 2 (BMP-2), foram analisados ​​no dia 14, conforme mostrado na Fig. 6. Expressão de todos esses marcadores gênicos foi encontrado nos três grupos de células no dia 7. Não foram encontradas diferenças óbvias na expressão gênica entre os grupos de 2 e 4 μg / ml. No entanto, em comparação com as células de controle, a expressão dos genes descritos acima em células tratadas com BP foi significativamente aumentada.

BPs potencia a osteogênese de EMSCs. EMSCs foram cultivadas em meio osteogênico com 0 μg / ml, 2 μg / ml, 4 μg / ml de BPs 14 dias. A expressão de genes envolvidos na osteogênese de EMSCs foi quantificada por reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa quantitativa (RT-qPCR). ** p <0,01, * p <0,05.

BPs melhora a osteogênese de EMSCs por regulação positiva da expressão de TG2

Uma vez que um impacto significativo de TG2 na diferenciação mediada por integrina e deposição de ECM foi demonstrado para uma ampla gama de células, investigamos se os BPs promoveriam a diferenciação osteogênica de EMSCs via suprarregulação da expressão de TG2. Conforme mostrado na Fig. 7, detectamos a regulação positiva óbvia do TG2 intracelular e extracelular nos grupos tratados com BP. A laminina (LN) e a fibronectina (FN) nas células tratadas com BP de 2 e 4 μg / ml apresentavam níveis mais elevados do que as do grupo de controle (Fig. 7A). EMSCs expostos a BPs mostraram um aumento de aproximadamente duas vezes nos níveis de TG2 em comparação com o grupo de controle, mas nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos tratados com BP (Fig. 7B). Como uma proteína macro-molecular, o anticorpo anti-TG2 não conseguiu atravessar as membranas celulares. Assim, o TG2 extracelular foi bloqueado pelo anticorpo e não conseguiu reticular vários fatores de crescimento e proteínas ECM. Os resultados do Alizarin Red S (Fig. 8A, C) mostraram que o anti-TG2 suprimiu marcadamente o aumento mediado pela BP no cálcio e na deposição de ECM. Meanwhile, as shown in Fig. 8D, anti-TG2 significantly inhibited BP-treated cells’ increase in ALP activity. Moreover, anti-TG2 effectively abolished the effects of BPs on the bone matrix proteins expression, including OCN, OPN, and COL I (Fig. 9).

Transglutaminase 2 (TG2) was involved in the osteogenic differentiation of EMSCs. EMSCs were incubated with BPs (2 and 4 μg/ml) for 14 days, and fibronectin (FN), LN, and TG2 levels were assessed by immunoblotting. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05.

Osteogenic differentiation of EMSCs with TG2 neutralizing antibody. A ALP staining. B ARS staining performed to examine extracellular mineralization. C Quantitative ALP analysis. D Quantitative Alizarin red staining analysis. **p  < 0.01

Anti-TG2 inhibited BP-induced EMSC osteogenic differentiation. A Representative western blots of osteoponin, osteocalcin, and collagen 1 (OPN, OCN, LN, FN, and COL I, respectively) in differentiated EMSCs following treatment with 2 μg/ml BPs and 2 μg/ml anti-TG2 or 2 μg/ml BPs alone. B Quantification of OPN, OCN, and COL I protein expression. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05

Discussion

To the best of our knowledge, modification of phosphorus was first exhaustively studied as early as 1914; unfortunately, these studies did not receive much attention for an entire century [27]. Phosphorus is one of the essential elements making up about 1% of the total body weight as a bone component in the human body [28], while most of the other materials cannot warrant such a natural biocompatibility. In 2014, BP was introduced as a new member of the 2D layered materials.

In this study, the BP nanoparticles were prepared on a large scale from bulk BP crystals by using an improved mechanical grinding and continuous ultrasound method. Compared with other methods, this ultrasound and mechanical grinding synthesis is facile and efficient and enables production of BPs on a large scale. For characterization of BPs, SEM was carried out to examine the morphology of BPs. SEM images illustrated that BPs were successfully synthesized, and the typical sizes of BPs are about 100 to 150 nm. The size of particles was further investigated using DLS in the relatively narrow range around 133 nm. The result of SEM corresponded well with the measurement of particle size measurements based on DLS. Interestingly, previous studies demonstrated that BP with larger lateral size has higher cytotoxicity than small BP, while ultra-small BPs were even considered nontoxic up to the high concentration of 1000 μg/ml [29, 30]. Thus, for biomedical applications, the BP nanomaterials still need further study. In addition, Raman scattering revealed the presence of three prominent peaks at 361.5, 437.1, and 465.2 cm ⁻¹ that were associated with the out-of-plane phonon mode (A ¹ _g ) and two in-plane modes (B ² _g and A ² _g ) of BPs. These results were consistent with previous reports [31] in which showed that the BPs had been prepared successfully from bulk BP. XRD shows the phase purity of the prepared BPs. Broadening of the diffraction pattern indicates the nanometer size of individual crystallites.

To evaluate the stability and degradation rate of BPs, Wang and co-workers performed an experiment in which normalized absorption spectra of the BP nanosheets were dispersed in water and exposed to air. After 6 days, they found that the absorbance of the BP nanosheets at 450 nm decreased by 43% compared to the initial value, indicating that BP is easily degraded in the physiological environment [32]. Also, it is well-known that BP is sensitive to water and oxygen, but this shortcoming is considered a merit for biomedical applications. Because of these special characteristics compared with other biomaterials, BPs could potentially avoid material accumulation in human body and then reduce cytotoxicity caused by such material noumenon.

Since MSCs play key roles in bone formation, there is no doubt that transplanting MSCs in animal models of bone defects enhance bone regeneration and promotes functional recovery via BMSC acquisition [33]. Unfortunately, BMSC acquisition procedures are painful for the donor and frequently cause surgical site infection, and the number of harvested BMSCs is low [34]. Previous studies from our laboratory and other reports have shown that EMSCs could be isolated from several adult tissues, such as dental pulp and the nasal mucosa, without causing invasive injury. Moreover, EMSCs were easily induced into osteoblasts, rendering those cells as promising seed cells for bone tissue engineering. Therefore, EMSCs were used in this study. We attempted to obtain the maximum safety BP concentration for EMSCs. As shown in the results, we achieved the maximum safe concentration of BPs (less than 64 μg/ml). The concentrations of 2 and 4 μg/ml of BPs were chosen for further study to avoid any possible potential toxic. The Ki-67 assay was also used to quantify and evaluate EMSC proliferation in these samples after treating these cells with BPs (2 and 4 μg/ml) for 24 h. We did not observe any statistically significant suppression of EMSCs growth in the case of BPs. Meanwhile, our results indicate that during treatment with safe concentrations of BPs, promotion of EMSCs proliferation also occurred.

Some reports have shown that the concurrent binding of BP and calcium ions may benefit osteogenic differentiation, thereby leading to enhanced bone regeneration [35, 36]. To investigate these effects, in vitro EMSCs exposed to BPs were used in osteogenic differentiation experiments. Interestingly, the results of the ALP test and Alizarin Red S staining show that exposure to BPs could promote rather than compromise osteogenetic differentiation of EMSCs compared to the control group. Similar findings have been reported in which phosphorus-rich materials can stimulate mineralization and bone regeneration. Co-expression of osteogenesis-related genes, including ALP, OPN, OCN, COL1, and RUNX2, in differentiated EMSCs was detected at days 7 and 14 by RT-qPCR. Indeed, the expression levels of these osteogenic genes significantly increased in differentiated EMSCs treated with BPs, also providing confirmation of the osteogenic potential of the BPs. Similar results were reported in which BP could induce both the proliferation and osteogenic differentiation of human pre-osteoblast cells. Together these results indicate that the BPs were able to induce osteogenic differentiation of EMSCs.

It can be asked, “How do BPs promote osteogenetic differentiation of EMSCs?” It is well accepted that phosphorus can capture Ca ²⁺ in vivo to form calcium phosphate deposits that accelerate bone regeneration, while BP can be the resource of phosphorus ions [36]. Tong et al. believes that BP generate mild heat (40–42 °C), which causes up-regulation of heat shock protein (HSPs) expression and stimulates bone regeneration [37, 38]. Moreover, in this study, the upregulated activation of TG2 levels was also observed in BPs treatment groups. To the best of our knowledge, TG2 has important enzymatic and non-enzymatic functions at these locations in which it crosslinks various ECM proteins and modulates the interactions of cells with the ECM and soluble growth factors by non-covalent interactions with and regulation of integrins [39,40,41]. Obviously, the BPs can react strongly with oxygen and water and finally degrade to non-toxic phosphate in aqueous solutions, which is a crucial component of ATP. Nakano Y et al. reported that ATP can act as a significant phosphate (Pi) source for mineralization in MC3T3-E1 osteoblast cultures, indicating that ATP-hydrolyzing enzymes could induce mineral deposition [42]. They also found that TG2 could not only act as a phosphatase but could be involved in ATP hydrolysis in the osteoblast cultures thus further contributing to the elevation in Pi levels required for mineral deposition, which may be beneficial to EMSC energy metabolism. This process may be part of the contribution that BPs makes toward enhancement of EMSC osteogenic differentiation. On the other hand, thanks to TG2 bio-functions, a wide variety of ECM adhesion proteins, including LN, COL I, and FN, could maintain a stable state. Indeed, in the present study, we observed that ECM (FN, COL I, and LN) were significant higher in BP-treated EMSC groups. BPs provide a favorable ECM microenvironment for promoting greater osteogenic EMSC differentiation and proliferation.

Until now, no secretory signal sequences and hydrophobic or transmembrane domains have been clearly identified in TG2 because the protein is not localized in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi compartments [39, 43], and only few studies reported about these factors that control TG2’s secretion. Therefore, it remains unclear as to the exact mechanism of BP regulation of expression patterns of TG2 in the progress of EMSC osteogenic differentiation.

Conclusion

In the present study, BPs were successfully fabricated using mechanical grinding and continuous ultrasound method. At bio-safe concentrations, BPs activated TG2, and promoted the expression of ECM, which further promoted osteogenic differentiation of EMSCs. From these results, we can conclude that BPs would be suitable for incorporation into tissue-engineered scaffolds that utilize EMSCs to repair bone defects. Although our research highlights the great potential of BPs in nano-biomedicine, large-scale preclinical and clinical studies concerning its safety are needed before any clinical applications are established.

Availability of Data and Materials

The datasets generated during and/or analyzed during the study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abbreviations

BPs:

Black phosphorus nanoparticles

EMSCs:

Ectodermal mesenchymal stem cells

TG2:

Transglutaminase 2

2D:

Two-dimensional

ECM:

Extracellular matrix

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

NMP:

N -Methyl-2pyrrolidone

PBS:

Phosphate-buffered saline

DMEM/F12:

Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F12

FBS:

Fetal bovine serum

SD:

Sprague Dawley

SEM:

Scanning electron microscopy

XPS:

X-ray photoelectron spectroscopy

CCK-8:

Cell counting kit

OD:

Optical density

RT-qPCR:

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

GAPDH:

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

BSA:

Bovine serum albumin

TBS:

Tris-buffered saline

DAPI:

4′6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamic light scattering

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