Nanopartículas de Hidroxiapatita Aumentam Osteogênese de MSC via Interação com Células Endoteliais

Resumo

Nano-hidroxiapatita (nano-HA) tem atraído atenção substancial no campo da medicina regenerativa. Interações entre células endoteliais (CE) e células-tronco mesenquimais (CTM) são necessárias para reconstrução óssea, mas a maneira como nano-HA interage neste processo permanece desconhecida. Aqui, investigamos a citotoxicidade e efeitos osteoindutivos de NPs de HA (NP-HA) em CTMs usando um modelo de co-cultura indireta mediado por CEs e destacamos os mecanismos subjacentes. Foi encontrado que em uma dose subcitotóxica, NP-HA aumentaram a viabilidade e expressão de genes osteoblásticos, bem como nódulos mineralizados e produção de fosfatase alcalina de CTMs. Estes fenômenos dependeram de HIF-1α secretado por CEs, que desencadeou a cascata de sinalização ERK1/2. Além disso, um modelo matemático de linhagem celular de dois estágios foi estabelecido para analisar quantitativamente o impacto de HIF-1α na diferenciação osteogênica de CTMs. Demonstrou que HIF-1α exerceu um efeito estimulatório dependente de dose na taxa de diferenciação osteogênica de CTMs até 1500 pg/mL, o que estava de acordo com os resultados acima. Nossos dados implicaram que interações cooperativas entre NP-HA, CEs e CTMs provavelmente servem para estimular a regeneração óssea. Além disso, o modelo de linhagem celular de dois estágios é um sistema in vitro útil para avaliar a influência potencial de moléculas efetoras na engenharia de tecido ósseo.

Introdução

A reconstrução de defeitos ósseos causados por trauma, má-formação congênita ou ressecção cirúrgica representa um grande desafio para a cirurgia ortopédica. Hidroxiapatita (HA), um cerâmico bioativo representativo, tem sido empregado como substituto ósseo. No entanto, propriedades mecânicas e osteoindutivas indesejáveis restringem sua aplicação clínica. Nos últimos anos, nano-HA demonstrou bioatividade mais otimizada e desempenhos mecânicos melhorados devido às suas características biomiméticas únicas e tem despertado interesse significativo em campos biomédicos relacionados à medicina regenerativa. Quando nano-HA é implantado em defeitos ósseos, múltiplas células envolvidas no reparo ósseo serão expostas a ele. Como tal, é necessário avaliar o comportamento biológico de nano-HA. Várias linhas de evidência demonstraram diretamente que NPs de HA (NP-HA) podem ser internalizadas por células-tronco mesenquimais derivadas de geléia de Wharton do cordão umbilical humano (hWJ-CTMs) e células osteoblásticas, resultando em diferenciação osteogênica aprimorada. Dua et al. relataram anteriormente a capacidade de NP-HA de promover a integração de cartilagem engenhada em cartilagem de novo; inversamente, NP-HA inibem a capacidade angiogênica de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Em termos de saúde humana, uma compreensão mais abrangente do impacto de NP-HA na regeneração óssea é necessária, e aplicações contínuas de osso artificial nano-engineered aumentam a urgência de tais estudos.

A regeneração óssea é inevitavelmente acompanhada pela invasão de neovasos. CEs são o revestimento celular interno do sistema vascular que servem para entregar sangue passivamente e também desempenham papel em induzir, especificar e guiar regeneração de órgãos, bem como manter homeostase e metabolismo. CTMs são parte do nicho perivascular e possuem habilidades de auto-renovação e multi-diferenciação sob indução de microambientes fisiológicos e bioquímicos particulares dentro de seus nichos residentes. Tsai et al. descobriram que CEs podem secretar endotelina-1 para direcionar CTMs para diferenciação osteo- e condro-linhagem. Adicionalmente, Saleh et al. usaram análise de dados de microarray para identificar proteínas secretadas por HUVECs e vias de sinalização de crosstalk relacionadas que interagem com receptores ligados à membrana de CTMs para aumentar proliferação e diferenciação osteogênica. Na engenharia de tecido ósseo, NP-HA podem entrar em contato com neovasos e ser endocitadas por CEs, o que tem mostrado alterar a função fisiológica destas células. Isso também pode influenciar as células osteoprogenitoras circundantes e afetar o reparo ósseo alterando sinalização parácrina. No entanto, enquanto o impacto direto de NP-HA em CTMs tem sido explorado, ainda há falta de compreensão clara se NP-HA podem indiretamente induzir diferenciação osteogênica de CTMs através de CEs, o que é essencial para nossa compreensão do efeito de NP-HA no reparo ósseo.

Neste estudo, em um esforço para obter mais insights sobre os efeitos biológicos de NP-HA na interação entre CEs e CTMs, um modelo de co-cultura indireta foi estabelecido usando HUVECs e hWJ-CTMs. Utilizando este sistema, a citotoxicidade e efeitos osteoindutivos de NP-HA em hWJ-CTMs via sinalização parácrina mediada por HUVECs foram avaliados. Para identificar fatores-chave influenciando interações NP-HA-CE-CTM, fatores solúveis no sobrenadante de HUVECs que haviam sido estimulados com NP-HA foram avaliados com ênfase nos mecanismos relacionados nos níveis gênico e proteico. Os resultados demonstraram que fator de indução por hipóxia (HIF)-1α desempenha papel crítico nestas interações.

Para observar e prever quantitativamente o impacto de HIF-1α no processo de osteogênese, um modelo matemático que combina uma linhagem celular de dois estágios com HIF-1α foi estabelecido. Aqui, analisando os dados empíricos, o modelo de linhagem celular de dois estágios foi usado para prever o número de CTMs e grau de diferenciação em qualquer ponto no tempo, baseado na densidade inicial de semeadura celular definida e concentração de HIF-1α, e isso pode, por sua vez, fornecer sugestões apropriadas para condições iniciais de cultura e tempos de incubação. Os resultados deste estudo ajudarão a lançar luz sobre as interações entre substitutos ósseos baseados em nano e sistemas biológicos, o que pode servir para promover o desenvolvimento de biomateriais inovadores para uso em medicina regenerativa.

Materiais e Métodos

Preparação e Caracterização de Partículas

NP-HA a 20 nm (np20), 20*80 nm (np80) e partículas de HA de tamanho micro (m-HAP) com ≥ 99,0% pureza foram compradas da Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Nanjing, China). O tamanho e forma das partículas foram visualizados usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, Hillsboro, OR, EUA) e microscopia eletrônica de varredura (SEM; LEO1530VP, Alemanha). O tamanho hidrodinâmico e potencial zeta de partículas de HA (HAPs) foram determinados via Zetasizer Nano ZS90 e Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, UK).

Preparação e Cultura Celular

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Nanjing. HUVECs e hWJ-CTMs foram colhidos de cordões umbilicais humanos frescos, como descrito anteriormente, após obter consentimento informado por escrito dos doadores. Brevemente, o cordão umbilical e veia umbilical foram enxaguados com tampão fosfato salino (PBS) contendo 1% penicilina e estreptomicina (PS; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Pasching, Áustria). Então, a veia umbilical foi preenchida com 0,1% colagenase I (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e incubada por 15 min a 37 °C. Após coleta, os HUVECs foram cultivados em meio EC (ECM) (Sciencell, San Diego, CA, EUA).

Subsequentemente, os vasos sanguíneos foram removidos, e a geléia de Wharton foi cortada em pedaços de 1 mm² e então colocada em frascos de cultura de tecido de 25 cm² (Corning Incorporated, Corning, NY, EUA). Estas células foram incubadas em L-DMEM (GIBCO Life Technology, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 10% soro fetal bovino (GIBCO) e 1% PS.

hWJ-CTMs foram avaliados para confirmar o fenótipo usando anticorpos monoclonais contra CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51 e CD105 (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). HUVECs foram avaliados usando fator de von Willebrand (vWF; Shanghai ChangDao Biotech Co, Ltd., Shanghai China). HUVECs entre passagens 3–7 e hWJ-CTMs entre passagens 3–5 foram usados nestes experimentos.

Suspensões de partículas a 1 mg/mL em PBS foram então diluídas em L-DMEM para a concentração final. Conforme mostrado na Fig. 1, os HUVECs foram incubados na concentração indicada de HAPs por 18 h. O meio de cultura foi centrifugado a 15.000 rpm a 4 °C por 15 min, e os sobrenadantes suplementados com 10% FBS foram usados como meio condicionado (MC) para hWJ-CTMs realizar os seguintes experimentos. O MC consistia de meio osteogênico suplementado com fluido de indução osteogênica, que continha 10 mM β-glicerofosfato, 50 μg/mL ácido L-ascórbico-2-fosfato e 0,1 μM dexametasona (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). Adicionalmente, 2-metoxiestradiol (2-MeOE2) (Selleck Chemicals, Houston, TX, EUA) foi usado como inibidor específico de HIF-1α. No grupo 2-MeOE2(+), hWJ-CTMs foram cultivadas com MC de HUVECs, que foram pré-tratadas com 5 μM 2-MeOE2 por 40 min antes da suplementação de HAP. PD98059 foi usado como inibidor específico de MEK. No grupo PD98059, hWJ-CTMs foram cultivadas com MC contendo 5 μM PD98059.

Determinação de Viabilidade e Número Celular

Viabilidade celular foi avaliada usando Kit de Ensaio MTS (MTS; Bestbio, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). hWJ-CTMs foram deixadas para aderir por 24 h e então cultivadas com MC por 24 e 72 h. A absorbância de formazan foi avaliada a 490 nm usando leitor de microplacas (SpectraMax M2; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EUA). A absorbância também foi convertida em números celulares usando curvas de calibração padrão sob as mesmas condições.

Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (RT-PCR)

Reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foi usado para isolar RNA total de células hWJ-CTMs incubadas em MC pelo tempo indicado. DNA complementar foi transcrito de 1,0 µg RNA usando kit PrimeScript First Strand cDNA Synthesis (TaKaRa, Tokyo, Japão) em um termociclador T3 (Mastercycler 5333; Eppendorf, Hamburg, Alemanha). Os níveis de expressão dos genes indicados foram analisados usando kit FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche, Basel, Suíça) em um sistema de amplificação quantitativa em tempo real (7900HT Fast; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A expressão relativa de mRNA do gene alvo foi normalizada para GAPDH e então determinada usando o método 2^(-ΔΔCt). Sequências de primers para os genes alvo estão listadas na Tabela 1.

Coloração Alizarin Red S (ARS) e Análise Quantitativa

hWJ-CTMs foram cultivadas em placas de 12 poços com meio osteogênico por até 14 d, e então a mineralização da matriz extracelular foi observada usando coloração ARS (Leagene, Leagene Biotechnology, Beijing, China). Brevemente, as amostras foram fixadas com álcool etílico absoluto por 15 min e então coradas em 1% (p/v) ARS (pH 4,2) à temperatura ambiente por 5 min. As células coradas foram lavadas duas vezes com água duplamente destilada e então fotografadas. Para análise quantitativa do processo de mineralização, 300 μL de cloreto de cetilpiridínio monoidratado 10% (p/v) (BOMEI, BOMEI Biotechnology, Hefei, China) foi adicionado a cada poço, e as placas foram incubadas por 30 min. Um total de 90 μL de cada amostra foi transferido para uma placa de 96 poços, e a absorbância foi então medida a 405 nm em triplicata.

Coloração de Fosfatase Alcalina (ALP) e Análise Quantitativa

Após as hWJ-CTMs serem cultivadas em placas de 12 poços com meio osteogênico por até 14 dias, coloração ALP foi conduzida usando Kit de Desenvolvimento de Cor de Fosfatase Alcalina BCIP/NBT (Beyotime). Brevemente, hWJ-CTMs foram fixadas em 4% paraformaldeído. Então, as amostras foram coradas em uma mistura de tetrazólio nitro-azul e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato por 4 h e fotografadas. Para quantificar síntese de ALP, as células foram lisadas em tampão de lise RIPA gelado (Beyotime) por 30 min. Lisados celulares foram centrifugados a 12.000 rpm a 4 °C por 10 min, e os sobrenadantes foram submetidos a análise quantitativa de ALP usando kit de Ensaio ALP (Beyotime). A absorbância foi medida em triplicata a 405 nm e convertida em atividade ALP usando curva padrão.

Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA)

HUVECs foram semeadas a 2 × 10⁵ células/poço. MC foi coletado de HUVECs cultivadas com HAPs por 18 h, e o sobrenadante foi submetido a análise ELISA. Kit ELISA humano HIF-1α (Anhui Joyee Biotechnics, Anhui, China) foi usado de acordo com as instruções do fabricante.

Imunofluorescência

HUVECs foram semeadas em lâminas em placas de 12 poços (7,6 × 10⁴ células/poço). Após exposição a MC por 18 h, as células foram fixadas em 4% paraformaldeído (Biosharp, Beijing, China) e permeabilizadas com 0,1% Triton X-100 (Beyotime) em PBS antes de incubação com 1% anticorpo anti-HIF-1α [EPR16897] (ab179483, Abcam, UK) durante a noite a 4 ℃. Subsequentemente, as células foram incubadas com 1% CoraLite594-conjugado Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) (Proteintech, EUA) no escuro por 1 h. Então, os núcleos foram corados com DAPI (Beyotime, Shanghai, China), que foi adicionado às células e reagiu por 30 s. As amostras foram examinadas usando microscópio confocal a laser (Olympus, Japão). A intensidade de fluorescência foi quantificada usando software de análise ImageJ v.1.4 (Bethesda, MD, EUA).

Análise de Western Blot

hWJ-CTMs foram incubadas em MC por 24 h (quinase regulada por sinal extracelular (ERK)1/2, p-ERK1/2) ou em meio osteogênico por 7 d (fator de transcrição relacionado a runt (RUNX)-2, colágeno tipo 1/collagen 1 (COL I)). Então, as células foram lisadas em tampão de lise RIPA por 30 min. Lisados celulares foram centrifugados, e os sobrenadantes foram armazenados a −20 °C para análise. Após SDS-PAGE 12%, as proteínas foram transferidas para membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Os anticorpos primários usados foram anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-RUNX-2, anti-COL I e GAPDH (1:1.000, anticorpos policlonais de coelho; Cell Signaling Technology, Boston, MA, EUA). Após remover anticorpos não ligados, a membrana foi incubada com anticorpos secundários por 1 h. O sinal nas membranas foi detectado usando sistema de imagem de gel quimioluminescente (LAS4000M; GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). A razão de p-ERK para ERK e RUNX-2/COL I para GAPDH foi quantificada usando software de análise ImageJ v.1.4 (Bethesda).

Avaliação de Apoptose Celular

hWJ-CTMs foram semeadas a uma densidade de 10⁵ células por poço em placas de 6 poços. Células aderentes foram tratadas com as concentrações indicadas de HIF-1α pelo tempo indicado. As células foram então coletadas e marcadas com FITC-Annexin V e PI (Fcmacs, Nanjing, China) por 15 min no escuro. Todas as amostras foram testadas usando citômetro de fluxo FACScan (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). Os dados foram analisados usando FlowJo v10 (BD Biosciences).

Modelo de Linhagem Celular de Dois Estágios

Em consideração ao enorme potencial de HAPs, e a dificuldade em analisar o sistema de co-cultura, um modelo matemático que pudesse fornecer análise quantitativa e previsão confiável era necessário para entender o papel de HIF-1α na diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs.

hWJ-CTMs foram cultivadas com 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000 e 4000 pg/mL HIF-1α bem como fluido de indução osteogênica. Após ajustar os dados nestas concentrações, usamos as concentrações de HIF-1α (produzidas por HUVECs) nos grupos controle, m-HAP, np80 e np20 (240, 300, 325 e 375 pg/mL, respectivamente) para testar as equações de ajuste usando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EUA). Para simplificar o modelo, consideramos seus padrões de crescimento similares nas diferentes concentrações de HIF-1α como idênticos. O grau médio de diferenciação foi empregado para ajustar a equação grau de diferenciação-tempo. A taxa de proliferação, taxa de apoptose e graus de diferenciação osteogênica das hWJ-CTMs nos diferentes grupos foram detectados em tempos definidos.

Um modelo simplificado de linhagem celular de dois estágios, similar a um modelo de linhagem celular multi-estágio, foi estabelecido de acordo com os dados experimentais. C₀ e C₁ representam o número de células de hWJ-CTMs e células terminais, respectivamente. C₀ e C₁ são governados por um sistema de equações diferenciais. Aqui, p, afetado por HIF-1α e tempo, representa a probabilidade de replicação das hWJ-CTMs. Correspondentemente, d = 1 − p é a taxa de diferenciação que pode ser obtida ajustando os dados estimados e experimentais de número celular. O parâmetro v₀ quantifica quão rapidamente as células se dividem em cada estágio de linhagem (em particular, v = ln2/c, onde c é a duração de um ciclo celular). A taxa de apoptose das células terminais é simbolizada por A. Para simplificar, negligenciamos que a taxa de apoptose variará ligeiramente ao longo do tempo, e portanto A = 4,5% é uma constante. K denota a capacidade ambiental porque as células não poderiam passar por proliferação ilimitada. HIF-1α aumenta a taxa de diferenciação das hWJ-CTMs, levando a uma taxa de diferenciação modelada por uma equação do tipo Hill.

Análise Estatística

Todos os dados que atendem aos requisitos de normalidade e homocedasticidade são expressos como média ± desvio padrão (DP) de três ou mais experimentos independentes. Software SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, EUA) foi usado para realizar análises estatísticas via ANOVA de uma via ou ANONA de duas vias. Um valor P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Análise estatística é apresentada usando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Resultados

Caracterização de HAPs

Como mostrado na Fig. 2, HAPs foram preparados com tamanho e forma particulares. Os diâmetros dos np20 com forma quase esférica eram 20 nm em média, e o np80 era em forma de bastão com comprimento médio de 80 nm e largura de 20 nm. Os m-HAPs também eram quase esféricos em forma e aproximadamente 12 μm de diâmetro. Todas as partículas tinham carga de superfície negativa em L-DMEM. Sugere-se que valores negativos de potencial zeta têm efeito favorável significativo na fixação e proliferação de células ósseas, bem como ligação óssea direta e formação de novo osso. Partículas observadas em L-DMEM têm tendência a agregar em sistemas aquosos. Seu tamanho hidrodinâmico também foi testado, o que também pode ser um fator importante afetando seus comportamentos biológicos.

Toxicidade Indireta de HAPs para hWJ-CTMs

Para avaliar a toxicidade indireta de HAPs em hWJ-CTMs, viabilidade celular foi medida via ensaios MTS. MC com 50 µg/mL NP-HA poderia estimular significativamente a viabilidade de hWJ-CTMs após 24 h e 72 h e especialmente a 24 h. No entanto, MC com 100 µg/mL NP-HA diminuiu a viabilidade celular em 15–20% comparado ao controle após 72 h. Além disso, MC com 25 µg/mL np20, mas não np80, estimulou viabilidade celular após 24 h. Estes fenômenos confirmaram que 50 µg/mL NP-HA eram uma concentração subcitotóxica usada em todos os experimentos subsequentes.

Efeito Osteoindutivo Indireto de HAPs em hWJ-CTMs

Para identificar os efeitos osteoindutivos indiretos de NP-HA em hWJ-CTMs, a expressão de genes osteogênicos foi avaliada por análise RT-PCR quantitativa. O nível de transcrição para fator de transcrição relacionado a runt 2 (RUNX-2) nos grupos NP-HA, especialmente np20, exibiu aumento notável do Dia 7 ao Dia 21. A expressão gênica de colágeno tipo I (Col I) no grupo np20 demonstrou aumento do Dia 7 ao Dia 21, enquanto o grupo np80 demonstrou aumento sustentado do Dia 7 ao Dia 14. mRNA de osteocalcina (OCN) foi claramente upregulado nos grupos NP-HA no Dia 14, indicando taxa acelerada de osteogênese. Os níveis de mRNA de fosfatase alcalina (ALP) obviamente aumentaram nos grupos NP-HA, indicando diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs. No entanto, o grupo m-HAP apresentou mudanças limitadas em relação aos níveis destes três genes osteogênicos comparado ao grupo controle. Além disso, a expressão de marcadores de pluripotência, NANOG, OCT3/4 e SOX2, diminuiu nos grupos NP-HA comparados com o controle, implicando que as hWJ-CTMs nos grupos NP-HA haviam diferenciado, especialmente no grupo np20. Resultados similares foram obtidos por análise de Western blot, indicando que o grupo np20 poderia indiretamente aumentar a expressão de RUNX-2 e COL I em hWJ-CTMs.

Para observar visualmente o efeito osteoindutivo indireto de NP-HA em hWJ-CTMs, as células foram incubadas com o meio osteogênico indicado por 14 d, seguido por coloração ARS e ALP. Um número aumentado de nódulos mineralizados e maior atividade ALP das hWJ-CTMs foram observados nos grupos NP-HA comparados com os grupos m-HAP e controle. Adicionalmente, m-HAP, similar ao controle, demonstrou efeitos limitados na diferenciação osteogênica das hWJ-CTMs.

HAPs Ativaram Sinalização ERK1/2 em hWJ-CTMs Indiretamente Co-cultivadas com HUVECs

Para investigar os efeitos na função parácrina de HUVECs por HAPs, ensaios de imunofluorescência e ELISA foram usados para identificar a possível proteína promovendo a diferenciação osteogênica das hWJ-CTMs. A produção intracelular e extracelular de HIF-1α foi significativamente facilitada por NP-HA (especialmente np20), enquanto houve efeito limitado de m-HAP em sua produção.

Para entender mais precisamente a via de sinalização de diferenciação das hWJ-CTMs ativada por HIF-1α, examinamos os reguladores-chave da via ERK1/2 via análise de Western blot. Enquanto os níveis de proteína de ERK1/2 total permaneceram inalterados, níveis de p-ERK1/2 foram distintamente aumentados nas hWJ-CTMs cultivadas com NP-HA, e isso foi especialmente verdadeiro no grupo np20. No entanto, m-HAP teve pouco efeito nos níveis de p-ERK1/2 nas hWJ-CTMs, similar ao seu efeito na produção de HIF-1α em HUVECs. Importante, os níveis aumentados de p-ERK1/2 nas hWJ-CTMs ativados por HIF-1α poderiam ser bloqueados por 2-MeOE2, um inibidor específico de HIF-1α, indicando que HIF-1α funcionou upstream da via de sinalização ERK1/2 em hWJ-CTMs.

HIF-1α Promoveu Diferenciação Osteogênica de hWJ-CTMs via Via ERK1/2

Para determinar se HIF-1α era necessário para a estimulação observada de diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs, um inibidor específico de HIF-1α (2-MeOE2) foi aplicado a estas culturas celulares. A deposição de matriz mineralizada e atividade ALP do grupo hWJ-CTMs tratado com 2-MeOE2(+) cultivadas em meio osteogênico foram enfraquecidas, indicando que HIF-1α era indispensável para a diferenciação osteogênica das hWJ-CTMs. Baseado nestes resultados, exploramos further o papel da via ERK1/2 na diferenciação osteogênica das hWJ-CTMs ativada por HIF-1α. A deposição de matriz mineralizada e atividade ALP nas hWJ-CTMs cultivadas com meio osteogênico foram suprimidas após administração de PD98059, um inibidor específico de MEK.

Modelos de Linhagem Celular de Dois Estágios

Para revelar quantitativamente a conexão intrínseca entre a concentração de HIF e diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs, 0–4000 pg/mL de HIF-1α foi usado para tratar oito grupos de hWJ-CTMs. Um modelo matemático de linhagem celular de dois estágios foi usado para analisar as taxas de proliferação, apoptose e diferenciação osteogênica destas hWJ-CTMs tratadas com diferentes concentrações de HIF-1α. Dados de ajuste foram empregados para obter a fórmula simulada e curva, mostrando que a taxa de diferenciação primeiro aumentou e depois diminuiu com o aumento da concentração de HIF. Mais especificamente, a taxa de diferenciação atingiu pico a 1500 pg/mL HIF-1α.

De acordo com nosso estudo, as concentrações de HIF-1α produzidas por HUVECs nos grupos controle, m-HAP, np80 e np20 foram 240, 300, 325 e 375 pg/mL, respectivamente. O quadrado preto representa a taxa de diferenciação promovida por 240, 300, 325 e 375 pg/mL HIF-1α, e isso combina bem com a curva simulada. Além disso, os graus de diferenciação das hWJ-CTMs (atividade ALP relativa) tratadas com diferentes concentrações de HIF-1α aumentaram similarmente com o tempo. Portanto, para simplificar o modelo, consideramos seus padrões de crescimento como similares ou até idênticos. Descobrimos que o aumento na atividade ALP do Dia 0 ao Dia 7 foi proporcional ao número de osteoblastos, e células osteoblásticas atingiram seu pico no período de platô. Portanto, após ajustar a atividade ALP com a curva de número relativo de osteoblastos (número de células osteoblásticas / número máximo de células osteoblásticas), o máximo de atividade ALP foi predito e atividade ALP relativa (atividade ALP / máximo de atividade ALP), representando o grau de diferenciação, foi adquirida. Combinando estes dois estudos, a superfície tridimensional do grau de diferenciação evoluindo com tempo e HIF-1α foi obtida.

Para estimar o tempo de cultura ótimo, foi necessário simular números celulares. Após elucidar a taxa de diferenciação sob diferentes concentrações de HIF-1α, simulamos o tamanho de cada população. A simulação utilizou densidade inicial de semeadura de 1500 células por poço (em placa de 96 poços) usando diferentes concentrações de HIF-1α. Os dados experimentais combinam bem com os números totais de células simulados, o que suporta a capacidade deste modelo de prever o número de hWJ-CTMs e osteoblastos em qualquer ponto no tempo. Além disso, o número de células osteoblásticas abordou o período de platô em 21, 18 e 15 dias com 0, 375 e 1500 pg/mL HIF-1α, respectivamente. Este modelo fornece o tempo de cultura ótimo para guiar engenharia de tecido, e também fornece evidência direta de que HIF-1α acelera a diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs.

Discussão

Com avanços recentes em nanobiomateriais, substitutos ósseos artificiais baseados em nano têm sido área de intensa investigação. Evidências acumuladas sugerem que existem interações complexas entre células e nanobiomateriais devido à sua capacidade de penetrar membranas celulares e aumentar tempos de retenção interna. Um estudo anterior revelou que nanofilmes colágeno/alginato podem adsorver na membrana de CTM para ativar cascatas de sinalização intracelular e promover diferenciação osteogênica. Experimentos elegantes por Wu e colegas claramente demonstraram que nanotubos de TiO₂ podem melhorar vascularização e diferenciação osteogênica facilitando efeitos parácrinas e junções celulares via interações CE-CTM. Para o propósito de desenvolver excelentes candidatos para engenharia de tecido ósseo, é necessário esclarecer o crosstalk direto entre substitutos ósseos baseados em nano e células implicadas no reparo ósseo, bem como suas interações indiretas. No entanto, nossa compreensão atual disto ainda é limitada. No presente estudo, utilizamos um modelo de co-cultura indireta para elucidar further os efeitos biológicos de NP-HA em CTMs no que diz respeito às interações indiretas mediadas por CEs.

Citotoxicidade é uma questão primária para avaliar a biocompatibilidade de qualquer nanobiomaterial. Embora nosso estudo anterior encontrou que NP-HA não influenciaram diretamente viabilidade ou apoptose de hWJ-CTMs, eles ainda podem exercer impactos diferentes via mediação de outras células. Assim, foi necessário avaliar os efeitos citotóxicos de NP-HA em hWJ-CTMs mediadas por HUVECs. Curiosamente, após incubação em MC por 24 h e 72 h, viabilidade de hWJ-CTMs foi mantida e até elevada nos grupos 0–50 µg/mL NP-HA, especialmente no grupo np20, indicando a existência de moléculas efetoras no MC. Quando a concentração de NP-HA atingiu 100 µg/mL, eles se tornaram citotóxicos para hWJ-CTMs. No entanto, 0–100 µg/mL m-HAP não tiveram influência na viabilidade de hWJ-CTMs. Jiang et al. mostraram que nanopartículas engenheiradas de tamanho particular podem ter rotas endocíticas e cinéticas distintas associadas com sinalização downstream alterada envolvida na regulação de funções de células alvo. Em nosso estudo anterior, mostramos que np20 e np80 foram endocitados por HUVECs, e isso foi seguido por mudanças morfológicas e aparecimento de grandes vacuolas, indicando estado ativado dos HUVECs. Adicionalmente, np20, com sua velocidade de captação mais rápida e acúmulo aumentado, pode resultar em ativação mais forte de HUVECs, possivelmente resultando em aumento da viabilidade de hWJ-CTMs via sinalização parácrina. Inversamente, poucos m-HAPs podem ser endocitados por HUVECs, e isso pode explicar sua influência limitada no metabolismo de hWJ-CTMs.

Para explorar further o potencial efeito osteoindutivo de HUVECs ativados, uma dose subcitotóxica de 50 µg/mL HAPs foi usada em estudos subsequentes. O MC coletado de HUVECs ativados promoveu deposição de cálcio extracelular, atividade ALP e expressão de proteínas osteogênicas em hWJ-CTMs, bem como expressão de mRNA de genes osteogênicos. Runx2, um fator de transcrição essencial envolvido na especificação da linhagem osteoblástica, mostrou aumento substancial no grupo np20, indicando forte efeito osteoindutivo em hWJ-CTMs. O grupo np20 demonstrou melhora de 1,5 vezes na expressão de COLI no Dia 7 e aumento duplo no Dia 14, o que implicou a presença de osteoblastos diferenciados adicionais nos grupos tratados com NP-HA. OCN é um marcador ósseo de estágio maduro, e este gene mostrou aumento significativo nos grupos NP-HA no Dia 14, indicando que np20 e np80 podem acelerar maturação óssea comparado a m-HAP. ALP é um marcador precoce de diferenciação osteoblástica, e obviamente aumentou com tempo de cultura em cada grupo, especialmente o grupo np20, revelando que transformação adicional ocorreu de CTMs para osteoblastos. Marcadores de pluripotência, NANOG, OCT3/4 e SOX2 implicam capacidade de diferenciação. A expressão diminuída nos genes dos grupos NP-HA implicou que a maioria das hWJ-CTMs nos grupos HAP haviam se transformado em osteoblastos.

Nossos dados demonstraram que a endocitose de NP-HA por HUVECs foi associada com diferenciação osteogênica melhorada de hWJ-CTMs. No entanto, a causa deste resultado é atualmente incerta. Em termos da função parácrina de HUVECs, focamos em proteínas indutoras de diferenciação solúveis no sobrenadante de HUVECs ativados. Sinalização HIF-1α é essencial no acoplamento de ossificação e angiogênese durante regeneração óssea. Heikal et al. relataram que CEs lesionadas secretam mais HIF-1α mesmo sob condições de normoxia. Também foi mostrado que exposição a NP-HA inibe a capacidade angiogênica de HUVECs. Assim, medimos as concentrações de HIF-1α no MC, e os resultados mostraram que o conteúdo de HIF-1α aumentou nos grupos de tratamento NP-HA comparados aos grupos m-HAP e controle. Para identificar o papel de HIF-1α na diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs, 2-MeOE2, um inibidor específico de HIF-1α, foi usado. A concentração diminuída de HIF-1α paralela ao depósito de matriz mineralizada e atividade ALP prejudicadas nestas hWJ-CTMs, indicando que NP-HA podem promover produção de HIF-1α de HUVECs para facilitar osteogênese de hWJ-CTMs.

Para aplicar adequadamente NP-HA para uso em engenharia de tecido ósseo, é necessário obter mais insights sobre os mecanismos pelos quais NP-HA promovem diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs mediadas por HUVECs. A via ERK1/2 é downstream de HIF-1α e é fundamental para diferenciação de CTMs. Neste trabalho, as concentrações de HIF-1α no MC coincidem bem com os níveis de p-ERK1/2 nas hWJ-CTMs. Quando 2-MeOE2 foi aplicado, a expressão de p-ERK1/2 nas hWJ-CTMs falhou em ser ativada, indicando que HIF-1α funcionou upstream da sinalização ERK1/2. Para abordar diretamente o papel da sinalização ERK1/2 na diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs, PD98059, um inibidor específico de MEK, foi usado. A supressão da sinalização ERK1/2 resultou na menor diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs. Uma possível razão para esta ocorrência é que a via ERK1/2 desempenha papel chave tanto na sinalização HIF-1α quanto nas vias de sinalização de apoptose e proliferação, que poderiam ser responsáveis pelas mudanças observadas na diferenciação osteogênica nestas células. Adicionalmente, isso também poderia estar relacionado à presença de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). VEGF é um dos efetores downstream da sinalização HIF-1α, e também pode promover diferenciação osteogênica de CTMs via ativação da via ERK1/2. Nosso estudo anterior encontrou que np20 induziu produção de VEGF em HUVECs; portanto, é possível que a supressão da via ERK1/2 possa resultar em inibição de VEGF, o que levaria à diminuição da diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs. De acordo com os resultados experimentais disponíveis, podemos resumir: NP-HA são capazes de processar mais otimamente melhores efeitos osteoindutivos diretos e indiretos que m-HAPs. Comparado a enxertos ósseos autogênicos e alogênicos, há fonte extensiva de NP-HA sem dano secundário e potencial imunogenicidade. No entanto, comparado a m-HAPs, NP-HA podem suprimir a capacidade angiogênica de HUVECs e exibem citotoxicidade leve tanto de forma tempo- quanto dose-dependente.

Recentemente, evidências crescentes demonstraram a importância de HIF-1α na regeneração óssea. No entanto, poucos estudos foram capazes de prever quantitativamente a taxa de diferenciação de CTMs sob condições iniciais específicas, como concentração de HIF-1α. Levando em conta proliferação celular, apoptose e diferenciação osteogênica, apresentamos um modelo matemático que combina uma linhagem celular de dois estágios com HIF-1α que é altamente correlacionado com nossos dados experimentais. Ajustando a taxa de diferenciação de hWJ-CTMs em 0–4000 pg/mL HIF-1α, adquirimos as equações para descrever a taxa de diferenciação, concentração de HIF-1α e tempo. Este modelo pode retratar o mapa de número celular sob diferentes concentrações de HIF-1α, de modo que é possível explorar a dinâmica intrínseca do sistema de dois estágios. Adicionalmente, este modelo valida matematicamente o efeito de HIF-1α na diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs. Além disso, baseado em modelo de linhagem celular multi-estágio e modelo logístico, nosso modelo é suficientemente estável para permitir previsões de longo prazo sem cair na armadilha de explosão populacional ilimitada.

Usando os dados experimentais existentes, tanto o número celular quanto a taxa de diferenciação podem ser preditos com densidade inicial de semeadura celular definida e concentração de HIF-1α. Como tal, o tempo de incubação ótimo também é obtido. Consequentemente, podemos prever a concentração ótima de HIF-1α e determinar o tempo mais ótimo para osteogênese, o que é importante para engenharia de tecido eficiente. Um modelo de linhagem celular de dois estágios é aplicável para prever proliferação e diferenciação de células-tronco, que têm duas linhagens celulares. Nesta base, o modelo fundado nas condições iniciais e dados experimentais existentes pode ser estabelecido para identificar as condições de cultura ótimas in vitro, o que auxiliará em otimizar reparo ósseo in vivo.

Conclusão

Neste estudo, exploramos os efeitos biológicos específicos de NP-HA em hWJ-CTMs mediadas por HUVECs. Comparado a m-HAPs, tanto np20 quanto np80 mostraram citotoxicidade leve tanto de forma tempo- quanto dose-dependente. Importantemente, o tamanho das NP-HA pareceu não ter impacto significativo nesta citotoxicidade. Nossos dados também mostraram que NP-HA, especialmente np20, foram capazes de facilitar HUVECs a secretar níveis aumentados de HIF-1α, que correlacionou diretamente com a diferenciação osteogênica aprimorada de hWJ-CTMs via ativação da via ERK1/2. Mais notavelmente, os resultados do modelo de linhagem celular de dois estágios sugeriram que HIF-1α exerceu um efeito estimulatório dependente de dose na taxa de diferenciação osteogênica de hWJ-CTMs. Adicionalmente, a concentração ótima de HIF-1α e tempo de incubação foram estimados baseados nas condições iniciais usando um modelo in vitro, o que poderia ser inestimável no futuro para aplicações de engenharia de tecido. Coletivamente, estas observações fornecem evidência de que NP-HA podem melhorar regeneração óssea modulando interações célula-célula.