miR-133a Exossomal de Células-Tronco da Medula Óssea Mitiga Fibrose e EMT em Miocardite Viral via Supressão de MAML1

Resumo

Miocardite é uma doença caracterizada por inflamação localizada ou difusa do miocárdio sem tratamento eficiente. Este estudo explorou o mecanismo regulatório do microRNA-133 (miR-133) secretado de exossomo derivado de células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSC-Exo) sobre fibrose miocárdica e transição epitelial-mesenquimal (EMT) em ratos com miocardite viral (VMC) através da regulação de mastermind-like 1 (MAML1). BMSCs em ratos foram isoladas e cultivadas para identificar seu fenótipo imune e capacidade osteogênica e adipogênica, e BMSC-Exo foram extraídos e identificados. Exossomos foram obtidos através de ultracentrifugação, que foram identificados por microscópio eletrônico de transmissão e análise de western blot. Os ratos foram injetados com vírus Coxsackie B3 para preparação do modelo VMC, e cardiomiócitos foram isolados, cultivados e agrupados da mesma forma que experimentos em animais (NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, Adas-miR-133a^Exo). Experimentos in vivo e in vitro foram conduzidos para elucidar os papéis do miR-133a exossomal e MAML1 em inflamação, apoptose, EMT, fibrose e viabilidade celular. A relação de alvo entre miR-133a e MAML1 foi verificada por ensaio de gene repórter de luciferase dual. BMSC-Exo aumentou a expressão de miR-133a em ratos VMC e efetivamente melhorou a função cardíaca e fibrose miocárdica em ratos VMC, aumentou a viabilidade de cardiomiócitos e inibiu o processo EMT. miR-133a elevado em exossomos fortaleceu as melhorias. miR-133a silenciado efetivamente reverteu os efeitos de BMSC-Exo em ratos VMC. miR-133a alvo MAML1. Inibição de MAML1 melhorou a função cardíaca e fibrose miocárdica em ratos VMC e pôde reverter o efeito de exossomos com miR-133a silenciado em ratos VMC. Nosso estudo sugere que miR-133a exossomal elevado suprime fibrose miocárdica e EMT em ratos com VMC via down-regulação de MAML1, inibindo assim a progressão da miocardite.

Introdução

Miocardite é considerada como uma doença inflamatória das células musculares do coração. Miocardite é obviamente mais familiar em homens em contraste com mulheres. Miocardite viral (VMC) é um fator principal levando a cardiomiopatia dilatada (DCM) e morte súbita em jovens. O desempenho clínico de miocardite é variado, variando de estados assintomáticos com sinais e sintomas ambíguos a destruição miocárdica séria por vírus e células imunes sofrendo de choque cardiogênico e arritmias. Miocardite pode ser induzida por uma variedade de elementos infecciosos, consistindo de vírus, bactérias, Chlamydia, rickettsia, fungos e protozoários, junto com indutores não infecciosos. Entre os quais, infecção viral tem sido a causa mais comum, especialmente em crianças. Vírus Coxsackie B3 (CVB3), como o vírus mais crucial que leva a miocardite, pode resultar em resposta de estresse oxidativo e apoptose na patogênese de VMC, mas tratamento especial de VMC não foi reportado ainda. Além disso, a patogênese de VMC não é bem documentada, e um tratamento clínico exato também está faltando. Portanto, novos alvos são urgentemente necessários para melhorar o prognóstico da doença.

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificantes endógenos que podem regular a expressão de genes codificadores de proteínas. MiR-133a, como um dos miRNAs cardíaco-específicos, é implicado no desenvolvimento do coração e algumas doenças cardiovasculares, contendo infarto do miocárdio (IM). Além disso, miR-133a é o que é aberrantemente expresso em cardiomiopatia de Chagas crônica. Além disso, nível de miR-133a no miocárdio está conectado com inflamação, função ventricular esquerda e desfecho clínico em cardiomiopatia inflamatória. MiRNAs foram encontrados em exossomos derivados de células masto de camundongo e humano. Exossomos, vesículas nanométricas liberadas pela maioria dos tipos de células são encontrados em diferentes fluidos biológicos. Exossomos podem transferir sua carga para células receptoras, o que tem sido mostrado para mudar a composição bioquímica e vias de sinalização das células receptoras. Evidência tem mostrado que miRNAs exossomais alterados estão conectados com a patogênese de miocardite induzida por CVB3. Foi abordado que miR-125b-5p exossomal de células-tronco mesenquimais da medula óssea condicionadas por hipóxia reduz apoptose de cardiomiócitos e melhora reparo cardíaco isquêmico. Além disso, miR-25-3p exossomal de MSCs alivia IM através de redução de apoptose de cardiomiócitos e resposta inflamatória. De interesse, miR-133a cardíaco-expresso exossomal está conectado à troponina cardíaca-I. Mastermind-like 1 (MAML1) foi um gene downstream cross-screened de miR-133a em nosso estudo que tem sido reportado para envolver em lesão de isquemia/reperfusão (I/R) miocárdica. Também, um estudo recente mencionou que knockdown de MAML1 possui função anti-fibrótica em fibrose hepática.

Iluminados por estudos prévios, questiona-se se miR-133 transportado por exossomo derivado de BMSCs poderia mediar miocardite. Portanto, este estudo foi iniciado com a hipótese de que miR-133 transportado por exossomo derivado de BMSC (BMSC-Exo) ameniza fibrose miocárdica e transição epitelial-mesenquimal (EMT) em ratos VMC através de regulação de MAML1.

Materiais e Métodos

Aprovação Ética

O estudo foi permitido pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do Quarto Hospital Afiliado da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang. Animais foram tratados humanamente.

Isolamento de BMSCs

Animais experimentais foram ratos Sprague-Dawley (SD) machos maduros de grau específico livre de patógenos (SPF) (Centro de Animais Experimentais da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, Zhejiang, China). Os ratos foram eutanasiados por injeção intraperitoneal com pentobarbital sódico e esterilizados com álcool 75%. O fêmur e tíbia foram retirados em uma mesa ultra-limpa, o músculo e tecidos conjuntivos foram removidos, e a cavidade medular foi enxaguada repetidamente com meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) de baixa glicose. O líquido foi centrifugado para coletar os precipitados que foram re-suspensos e incubados por 24 h (o meio foi trocado a cada 2-3 d). Quando crescendo para a fase logarítmica, BMSCs foram destacadas com 0,25% tripsina (Gibco, Carlsbad, California, EUA), centrifugadas e re-suspensas em solução de cultura MSC (Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, China). A suspensão foi passada na razão de 1:2. A operação acima foi repetida, e as BMSCs de 4ª passagem foram usadas para experimentos subsequentes.

Identificação de BMSCs

Os antígenos de superfície das BMSCs de 4ª passagem em crescimento logarítmico foram identificados por citometria de fluxo. As BMSCs foram destacadas com 0,25% tripsina (1 mL) contendo ácido etilenodiaminotetraacético, centrifugadas, re-suspensas com fosfato buffered saline (PBS) apropriado e centrifugadas a 151 g. As BMSCs foram então re-suspensas com PBS contendo 2% soro fetal bovino (FBS) fresco (Gibco) para fazer uma suspensão de célula única. Anticorpos monoclonais FITC-CD34, PE-CD29 e PE-CD44 (5 µL cada, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) foram incubados com a suspensão celular (100 µL), centrifugados a 151 g, re-suspensos com 500 µL PBS contendo 1% paraformaldeído e fixados por 30 min. Os marcadores de fundo foram identificados via uso de anticorpos monoclonais do controle do homotipo.

Citometria de fluxo: a suspensão de célula única foi fixada e centrifugada a 151 g. Então as BMSCs foram re-suspensas com PBS contendo 1% paraformaldeído, testadas no citômetro de fluxo MACS Quart e analisadas pelo software correspondente.

Indução de Osteogênese e Adipogênese de BMSCs

BMSCs na 4ª passagem foram semeadas em placas de 6 poços com 200 células/mL. Solução de indução de osteoblasto e solução de indução adipogênica (Cyagen Biosciences Inc.) foram adicionadas em BMSCs de 60-70% de confluência. BMSCs em outros dois poços não foram adicionadas com líquidos de indução como controles. As BMSCs foram induzidas por 14 dias e fixadas com 4% paraformaldeído. Então os osteoblastos e adipócitos diferenciados foram implementados com coloração alizarina vermelha e óleo vermelho O (Wuhan Pulande Biological Technology Co., Ltd., Wuhan, China), e observados sob microscópio.

Isolamento e Identificação de Exossomos

BMSCs na 4ª passagem foram cultivadas por 48 h para colher o sobrenadante que foi então centrifugado (800 g e 2000 g), filtrado com membranas de filtro 0,22 µm e 100.000 MW, e centrifugado (100.000 g) para coletar os precipitados. Então, os precipitados foram re-suspensos com PBS, centrifugados a 100.000 g novamente para obter precipitação de exossomo. A suspensão de BMSC-Exo em PBS foram submetidas a detecção de concentração por ácido bicinconínico (BCA) e detecção de proteína marcadora de exossomo (CD63, CD81 e CD9) por análise de western blot (Proteintech, Chicago, IL, EUA).

Infecção por Adenovírus Recombinante Media Modificação do Gene miR-133a de BMSCs

BMSCs foram passadas durante a noite. O controle normal (quantidade igual de PBS), o controle negativo de miR-133a (NC), a sobre-expressão de miR-133a (Ad-miR-133a), e a baixa expressão de miR-133a (Adas-miR-133a) (Hanbio Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) foram transfectados com BMSCs de acordo com 100 multiplicidade de infecção (MOI). As BMSCs foram cultivadas, e os exossomos correspondentes (NC^Exo, NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, e Adas-miR-133a^Exo) foram obtidos através de ultracentrifugação.

Estabelecimento do Modelo VMC em Ratos e Agrupamento de Animais Experimentais

Ratos SD machos maduros de grau SPF foram divididos em 10 grupos, com oito ratos cada. Coxsackievírus B3 (CVB3) foi fornecido pelo Instituto de Biotecnologia Médica, Academia Chinesa de Ciências Médicas (Beijing, China).

CVB3 (10 mg/kg) foi injetado intraperitonealmente em ratos enquanto PBS ou BMSC-Exo (100 µg) foi injetado através da veia da cauda. Ratos normais para controles foram injetados com solução de cultura CVB3 e PBS. Ratos injetados com 10 mg/kg CVB3 foram further injetados com PBS, MSC^Exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, Ad-miR-133a^Exo, si-NC, ou si-MAML1 (RIBOBIO, Guangzhou, China).

Os ratos foram continuamente injetados por 7 dias e o sangue do globo ocular foi obtido. O sangue foi centrifugado e o soro foi coletado, sub-embalado, e armazenado a -20 °C. Após os ratos serem eutanasiados, os espécimes cardíacos foram retirados, fixados com 10% formaldeído, desidratados com álcool gradiente, clarificados com xileno e embutidos em parafina, seccionados para observação histológica. Uma parte das seções foram colocadas a -80 °C como materiais de experimentos de biologia molecular.

Ecocardiografia

No 7º dia após injeção do vírus, os ratos foram injetados intraperitonealmente com pentobarbital sódico 25 mg/kg. Após anestesia completa, o membro do eletrocardiograma conectado com a agulha de eletrodo foi inserido subcutaneamente nas extremidades dos membros dos ratos, e o eletrocardiograma de membro foi registrado. Então, os ratos foram fixados na posição supina ligeiramente à esquerda, o tórax foi depilado, e o eletrocardiograma de derivação II foi conectado para obter o espectro Doppler do pulso de fluxo sanguíneo da aorta na seção paraesternal de quatro câmaras cardíacas. Indicadores incluíram espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo (LVPW), diâmetro telesistólico do ventrículo esquerdo (LVIDs), fração de encurtamento do ventrículo esquerdo (FS), e fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF).

Coloração Hematoxilina-Eosina (HE)

Os tecidos foram fixados com 4% paraformaldeído, desidratados, clarificados, e embutidos em parafina. Então as seções de 4-µm foram desparafinadas, coradas com hematoxilina (Servicebio, Wuhan, China), diferenciadas com 1% álcool de ácido clorídrico, retornadas ao azul, e coradas com eosina, desidratadas, clarificadas com xileno, seladas com goma neutra, e observadas sob microscópio óptico (Olympus, Tokyo, Japão).

Coloração de Colágeno Masson

Seções de parafina foram desparafinadas, coradas com hematoxilina menos de 2 min, coradas com solução magenta Lichun, e rapidamente enxaguadas com solução de ácido acético glacial 0,5%. Então as seções foram coradas com solução aquosa de fosfato de alumínio 1%, coradas de vermelho escuro para vermelho brilhante para rosa, e observadas sob microscópio. Então as seções foram coradas com azul anilina (Pulande), convencionalmente desidratadas com xileno e seladas. Software de análise de imagem médica Image-Proplus 6.0 foi usado para medir a área de coloração positiva de fibras colágenas, e fração de volume de colágeno (CVF) = área colágena/área total do campo. A localização e cor de coloração de fibras colágenas foram distinguidas (os cardiomiócitos eram vermelhos, e as fibras colágenas eram estruturas bandas azuis ou homogêneas no espaço intercelular).

Coloração TUNEL

Seções de parafina foram desparafinadas, colocadas no tampão citrato e assadas a 350 W por 10 min. As seções foram adicionadas com 50 µL solução TUNEL, unidas com 50 µL agente de conversão-peroxidase, desenvolvidas com DAB, e observadas sob o microscópio. As seções foram colocadas em hematoxilina, mergulhadas com etanol 95% I-II, unidas com etanol anidro I-II, xileno I-II, e seladas. Os resultados foram analisados sob microscópio óptico.

Ensaio Imunoenzimático (ELISA)

Fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina (IL)-1β e IL-6 foram detectados por kits ELISA (BOSTER Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, China). O sangue do globo ocular foi centrifugado a 604 g para coletar o soro superior. O sobrenadante obtido por centrifugação do meio de cultura celular foi detectado em experimento celular. Havia sete gradientes de concentração no padrão de diluição de amostras. O poço em branco foi unido com diluente de amostra, e outro poço foi adicionado com tetrametilbenzidina (TMB), dois poços duplicados foram definidos para cada concentração. Os poços de amostra foram unidos com 50 µL de diluente de amostra e as amostras por sua vez. Cada poço foi reagido com 100 µL de anticorpo primário (exceto poço TMB) por 1 h, assim como com 300 µL de 0,01 M tampão salino tris (TBS) e 100 µL Complexo de Trabalho Avidina-Biotina-Peroxidase (exceto poço TMB). Então cada poço foi adicionado com 300 µL de 0,01 M TBS e incubado com 100 µL TMB. O valor de densidade óptica (OD) e a concentração de cada poço foram imediatamente medidos e a curva padrão foi desenhada.

Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa Quantitativa (RT-qPCR)

MiR-133a, colágeno I, colágeno III, α-SMA, TGF-β1, CTGF, E-caderina, e FSP-1 expressão em tecidos miocárdicos e cardiomiócitos foram detectados via RT-qPCR. O RNA total foi extraído de cardiomiócitos ou tecidos miocárdicos e reversamente transcrito para cDNA via kit de extração de RNA (Takara, Dalian, China), e primers RT-PCR foram sintetizados via Invitrogen (Guangzhou, China), as sequências são mostradas na Tabela 1. Expressão gênica quantitativa relativa foi analisada usando gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou U6 como genes de controle de carga de acordo com o método 2^-ΔΔCt.

Análise de Western Blot

Os ratos foram eutanasiados com anestesia. Os tecidos miocárdicos foram congelados e moídos em nitrogênio líquido. Então inibidores de protease fenilmetansulfonilfluoreto solução estoque foi misturado com tampão de lise celular na razão de 1:100 (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China). As amostras foram lisadas com solução mista e proteínas das células foram extraídas. A concentração total de proteína foi detectada com o kit BCA. As amostras foram misturadas com tampão de carga 5× na razão 4:1, implementadas com banho-maria fervente por 10 min, banho de gelo, e centrifugadas. Separação por eletroforese foi realizada, e as proteínas foram transferidas para membrana de fluoreto de polivinilideno (Servicebio) com solução de transferência elétrica. Então a membrana foi bloqueada com 5% leite em pó desnatado, e unida com anticorpos primários CD63, CD81 e CD9 (anticorpos policlonais anti-rato de coelho da Proteintech, 1:100), MAML1 (ab65090, Abcam, MA, EUA, 1:1000), e GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, EUA, 1:1000). Então a membrana foi gotejada com o anticorpo secundário, peroxidase-marcado IgG (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA, 1:1000), e imersa em solução de reação quimioluminescente melhorada (Pierce, Rockford, IL, EUA). Com GAPDH como controle de carga, imagens de impressão de proteína foram analisadas com software ImageJ2x.

Cultura e Passagem de Cardiomiócitos

Ratos SD com 3-5 dias (Centro de Animais Experimentais da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, Zhejiang, China) foram tomados. A parte ventricular foi enxaguada com solução Hank's Balanced Salt Solution pré-resfriada, cortada em pedaços pequenos, e destacada com 0,25% tripsina. Os pedaços foram adicionados com quantidade adequada de meio completo 10% para terminação de destaque e centrifugados a 151 g. DMEM contendo 20% FBS foi aplicado para re-suspensão celular. Cardiomiócitos foram purificados por método de adesão diferencial, e a taxa de sobrevivência foi observada via coloração azul tripsina, os cardiomiócitos sobreviventes foram cultivados. Após 24 h, os cardiomiócitos aderiram à parede e começaram a pulsar. Após 72 h, os pseudópodes expandiram.

Construção do Modelo VMC de Cardiomiócito

Cardiomiócitos na 4ª passagem na fase de crescimento logarítmico foram selecionados e infectados com MSC^Exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, e Ad-miR-133a^Exo. A solução de vírus CVB3 100 Tcid50 (100 µL) foi adicionada nas células para induzir um modelo VMC celular. Ao mesmo tempo, quantidade igual de solução de manutenção foi adicionada às células para um controle, e exossomos correspondentes foram unidos aos cardiomiócitos após 1-h infecção para 47-h cultura.

Ensaio de Kit de Contagem Celular (CCK)-8

Kit de detecção celular CCK-8 (Beyotime) foi aplicado para detectar a taxa de sobrevivência de cardiomiócitos. Quando crescendo para fase logarítmica, as células foram destacadas com 0,25% tripsina, e semeadas em placa de cultura celular de 96 poços a 2,5 × 10⁴ células/poço. Unidas com solução CCK-8 (10 µL/poço), células foram continuamente cultivadas por 1-4 h, e o valor OD_{450 nm} foi medido via leitor de microplaca.

Citometria de Fluxo

Método de dupla coloração AnnexinV-APC/iodeto de propídio (PI) foi aplicado para detectar apoptose celular. As células foram centrifugadas, re-suspensas com 250 µL Tampão de Ligação (4 mL Tampão de Ligação + 12 mL água desionizada), e ajustadas a 1 × 10⁶ células/mL. A suspensão celular de 100 µL foi adicionada com 5 µL Annexin V-APC (BD Biosciences) e 5 µL solução PI (BD Biosciences), carregadas no citômetro de fluxo, e analisadas automaticamente por um computador.

Ensaio de Gene Repórter de Luciferase Dual

A sequência selvagem (wt) ou mutante (mut) da região 3'-não traduzida (UTR) de MAML1 foi clonada no vetor pGL3-M (Promega, WI, EUA), então MAML1-3'-UTR-wt ou MAML1-3'-UTR-mut foram gerados. Os vetores, junto com mimético de miR-133a ou NC, foram co-transfectados em cardiomiócitos via Lipofectamine 2000. A atividade de luciferase foi testada 48 h depois pelo sistema de gene repórter de luciferase dual (Promega).

Ensaio de Imunoprecipitação de RNA (RIP)

Kit RIP (Millipore, EUA) foi usado para detectar a ligação de MAML1 e miR-133a. Células foram lisadas por tampão de radio-imunoprecipitação (P0013B, Beyotime, Shanghai, China), centrifugadas a 1400 g e incubadas com anticorpos para co-precipitar. Esferas magnéticas (50 µL) foram re-suspensas em 100 µL Tampão de Lavagem RIP e incubadas com 5 µg anticorpo anti-MAML1 (1 µg/mL, ab155786) ou IgG (1:100, ab172730). O complexo esfera magnética-anticorpo foi re-suspenso em 900 µL Tampão de Lavagem RIP, interagiu com 100 µL extrato celular, digerido com protease K, e detectado por RT-qPCR.

Análise Estatística

Software estatístico SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EUA) foi aplicado para análise dos dados. Os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão. O teste t foi aplicado a comparações entre dois grupos. Análise de variância unidirecional (ANOVA) foi usada para comparação entre grupos, e teste post hoc de Tukey para comparações pareadas. Preditores foram mantidos se fossem significativos em um valor P de 0,05 ou menor.

Resultados

Identificação de BMSCs e BMSC-Exo

Mikroscopicamente, BMSCs eram fusiformes e arredondadas, e aderiram à parede em padrão de vórtice ou radial (Fig. 1A). Após coloração óleo vermelho O de indução adipogênica, as gotículas lipídicas das BMSCs de 4ª passagem eram vermelhas, e havia gotículas lipídicas redondas de diferentes tamanhos (Fig. 1B). Após indução de osteogênese, as células expressando nódulos calcificados mostraram vermelho após coloração alizarina vermelha, e distribuição desigual de nódulos calcificados e células sobrepostas (Fig. 1C). Citometria de fluxo manifestou que os marcadores MSC CD29 e CD44 (> 95%) foram expressos, mas o antígeno de superfície de célula-tronco hematopoiética CD34 (< 95%) não foi expresso (Fig. 1D). Estes resultados manifestaram que as BMSCs eram de alta pureza e conformavam aos padrões MSC da Sociedade Internacional de Terapia Celular.

Microscópio eletrônico de transmissão observou que BMSC-Exos eram vesículas ovais com estrutura membranosa periférica clara, tamanhos diferentes, e diâmetro de 40-100 nm (Fig. 1E). Análise de western blot demonstrou que os produtos extraídos expressaram proteínas características de origem exossomal de CD9, CD63 e CD81 (Fig. 1F).

miR-133a Exossomal Elevado Melhora os Sintomas de Miocardite

A transfeção de BMSCs com adenovírus recombinante de miR-133a foi observada (Fig. 2A). Um grande número de expressão de fluorescência verde de NC, Ad-miR-133a e Adas-miR-133a foi observado sob microscópio de fluorescência invertido, indicando que vetor de adenovírus recombinante poderia efetivamente transfectar BMSCs. Para testar a eficiência de transfeção de miR-133a, a expressão de miR-133a em BMSCs e seus exossomos foi medida por RT-qPCR. Foi descoberto que a up-regulação de miR-133a aumentou a expressão de miR-133a enquanto a down-regulação de miR-133a diminuiu a expressão de miR-133a (Fig. 2B). Subsequentemente, injetamos exossomos contendo miR-133a em ratos. Sob o microscópio de fluorescência invertido, expressão de fluorescência verde foi observada em ratos VMC após tratamento de NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo ou Adas-miR-133a^Exo, indicando que o vetor de adenovírus recombinante infectou tecidos miocárdicos de ratos (Fig. 2C). Experimento de RT-qPCR também encontrou que a expressão de miR-133a em ratos VMC foi aparentemente diminuída; a expressão de miR-133a foi obviamente elevada em ratos VMC injetados com Ad-miR-133a^Exo mas diminuída em ratos VMC injetados com Adas-miR-133a^Exo (Fig. 2D). Quanto às condições gerais dos ratos, foi observado que as condições gerais de ratos controle normais eram normais, e as características de VMC eram aparentemente expressas em ratos VMC e ratos VMC injetados com Adas-miR-133a^Exo, como pêlo áspero e desordenado, dispneia e pouca dieta. Em ratos VMC tratados com MSC^Exo, NC^Exo e Ad-miR-133a^Exo, estes sinais foram melhorados em diferentes graus. O peso dos ratos VMC foi continuamente diminuído a partir de 1 dia após infecção, e injeção de MSC^Exo, NC^Exo ou Ad-miR-133a^Exo aumentou o peso dos ratos. O peso dos ratos VMC tratados com Ad-miR-133a^Exo foi aumentado obviamente e o peso dos ratos VMC injetados com Adas-miR-133a^Exo foi claramente diminuído (Fig. 2E).

A observação da função miocárdica sugeriu que (Fig. 2F), os ratos VMC tiveram LVPW e LVIDs aumentados, e FS e LVEF diminuídos. Após injeção de exossomos, LVPW e LVIDs declinaram, e FS e LVEF obviamente elevados mostraram em ratos VMC. Tratamento Adas-miR-133a^Exo prejudicou enquanto Ad-miR-133a^Exo melhorou a função miocárdica em ratos VMC.

miR-133a Exossomal Up-regulado Inibe Inflamação em Tecidos Miocárdicos de Ratos VMC

Coloração HE manifestou que as fibras miocárdicas em ratos controle normais eram estreitamente arranjadas e não havia infiltração de células inflamatórias no mesênquima. Os cardiomiócitos em ratos VMC eram desorganizados e o mesênquima foi infiltrado por um grande número de células inflamatórias. Os cardiomiócitos em ratos VMC injetados com MSC^Exo ou NC^Exo eram ordenadamente arranjados, com uma pequena quantidade de células inflamatórias infiltrando no mesênquima. Os cardiomiócitos em ratos VMC após tratamento Adas-miR-133a^Exo eram desordenadamente arranjados, e as células inflamatórias no mesênquima foram infiltradas. Os cardiomiócitos em ratos VMC tratados com Ad-miR-133a^Exo eram ordenadamente arranjados sem infiltração óbvia de células inflamatórias (Fig. 3A).

ELISA indicou que (Fig. 3B, C) fatores inflamatórios (TNF-α, IL-1β e IL-6) foram obviamente aumentados em ratos VMC. Os ratos VMC injetados com Ad-miR-133a^Exo tiveram níveis reduzidos de fatores inflamatórios. Tratamento Adas-miR-133a^Exo causou fatores inflamatórios elevados em ratos VMC.

miR-133a Exossomal Elevado Diminui CVF em Tecidos Miocárdicos de Ratos com VMC

Coloração Masson revelou que as fibras miocárdicas em ratos normais eram estreitamente arranjadas, com quase nenhuma fibra colágena azul. Após injeção de CVB3, os cardiomiócitos eram hipertróficos, com hiperplasia de tecido conjuntivo e um grande número de fibras colágenas azuis, e CVF foi obviamente elevado. Tratados com exossomos, os cardiomiócitos eram ordenadamente arranjados, hiperplasia de tecido conjuntivo intercelular foi diminuída, fibras colágenas azuis e CVF foram claramente diminuídas. O espaço intercelular miocárdico de ratos VMC injetados com Adas-miR-133a^Exo foi alargado, as células eram obviamente aumentadas, as fibras colágenas azuis e CVF foram claramente aumentadas; o espaço intercelular foi diminuído, a distribuição de fibras colágenas azuis e o CVF foram diminuídos de ratos VMC com tratamento Ad-miR-133a^Exo (Fig. 4A, B).

miR-133a Exossomal Aumentado Reduz Expressão de Colágeno I, Colágeno III, TGF-β1 e CTGF em Tecidos Miocárdicos de Ratos com VMC

Colágeno I e colágeno III são os principais componentes de colágeno, que são principalmente distribuídos em junções celulares e membranas celulares, substância intercelular e citoplasma. TGF-β1 e CTGF são as proteínas marcadoras de fibrose. Achados de RT-qPCR demonstraram que níveis de expressão de mRNA de colágeno I, colágeno III, TGF-β1 e CTGF foram aumentados em ratos VMC, mas diminuíram após tratamento com exossomos. Os ratos VMC tratados com Ad-miR-133a^Exo tiveram níveis de expressão de mRNA de colágeno I, colágeno III, TGF-β1 e CTGF diminuídos enquanto os ratos VMC após tratamento Adas-miR-133a^Exo mostraram a situação oposta (Fig. 5A-C).

miR-133a Exossomal Up-regulado Inibe Apoptose de Cardiomiócitos em Tecidos Miocárdicos de Ratos com VMC

Coloração TUNEL mostrou que os cardiomiócitos apoptóticos eram marrom-escuros ou marrom-amarelados com condensação nuclear. O número de células apoptóticas foi aumentado em ratos VMC que seria atenuado por tratamento com exossomos. Os ratos VMC injetados com Ad-miR-133a^Exo tiveram número reduzido de células apoptóticas e aqueles injetados com Adas-miR-133a^Exo tiveram número aumentado de células apoptóticas (Fig. 6A, B).

miR-133a Exossomal Elevado Deprime EMT em Tecidos Miocárdicos de Ratos com VMC

E-caderina, α-SMA e FSP-1 são indicadores-chave de EMT. Resultados de RT-qPCR demonstraram que níveis de expressão de mRNA de α-SMA e FSP-1 foram elevados e nível de expressão de mRNA de E-caderina foi diminuído em ratos VMC. Além disso, níveis de expressão de mRNA de α-SMA e FSP-1 foram reduzidos e nível de expressão de mRNA de E-caderina foi aumentado em ratos VMC após tratamento com exossomos. Níveis de expressão de mRNA de α-SMA e FSP-1 foram elevados e nível de expressão de mRNA de E-caderina foi diminuído em ratos VMC tratados com Adas-miR-133a^Exo, enquanto a expressão destes indicadores foi oposta em ratos VMC injetados com Ad-miR-133a^Exo (Fig. 7A, B).

miR-133a Exossomal Elevado Deprime Inflamação de Cardiomiócitos em VMC

Como resultado, microscopia de fluorescência capturou expressão fluorescente verde em ratos VMC tratados com NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo ou Adas-miR-133a^Exo, indicando que o vetor de adenovírus recombinante infectou cardiomiócitos de ratos (Fig. 8A). RT-qPCR e ELISA descobriram que (Fig. 8B, D) a expressão de miR-133a foi reduzida e fatores inflamatórios (TNF-α, IL-1β e IL-6) foram aumentados em ratos VMC, que seria revertido por tratamento com exossomos. Os ratos VMC tratados com Ad-miR-133a^Exo tiveram miR-133a up-regulado e fatores inflamatórios diminuídos em ratos VMC, enquanto aqueles tratados com Adas-miR-133a^Exo apresentaram miR-133a diminuído e níveis aumentados de fatores inflamatórios em ratos VMC.

miR-133a Exossomal Elevado Promove Viabilidade Celular e Reprime Apoptose de Cardiomiócitos em VMC

A apoptose e a viabilidade celular foram detectadas via dupla coloração AnnexinV-APC/PI e ensaio CCK-8. Os resultados revelaram que houve um aumento óbvio na taxa de apoptose, uma diminuição na viabilidade celular de cardiomiócitos em ratos VMC. Tratamento com exossomos reduziu taxa de apoptose e aumentou a viabilidade de cardiomiócitos. Adas-miR-133a^Exo aumentou a taxa de apoptose e prejudicou a viabilidade de cardiomiócitos em ratos VMC. Tratamento Ad-miR-133a^Exo funcionou efeitos opostos nos cardiomiócitos de ratos VMC (Fig. 9A-C).

miR-133a Alvo MAML1

Foi reportado que miRNA-193b up-regulado reduz dano miocárdico I/R alvo MAML1. Baseado nisso, cross-screened genes downstream de miR-133a através de websites de bioinformática PITA, miRanda, PicTar, microT e miRmap, e selecionamos MAML1 como alvo de miR-133a (Fig. 10A). Construímos MAML1-wt ou MAML1-mut, e co-transfectamos cardiomiócitos com mimético de miR-133a ou NC. Os resultados mostraram que mimético de miR-133a reduziu a atividade de luciferase de MAML1-wt (Fig. 10B). O experimento RIP further verificou a relação de alvo entre miR-133a e MAML1 (Fig. 10C). Detecção de RT-qPCR e Western blot de expressão de MAML1 mostrou que a expressão de MAML1 foi diminuída em cardiomiócitos transfectados com mimético de miR-133a (Fig. 10D, E).

Inibição de MAML1 tem Efeito Protetor em Ratos com Miocardite e Reverte Efeito de Exossomos com miR-133a Inibido em Ratos com VMC

Para further estudar o efeito de MAML1 regulado por miR-133a em ratos com VMC, injetamos adenovírus si-MAML1 ou si-NC em ratos VMC ou ratos VMC que tinham sido tratados com exossomos com miR-133a silenciado. O sucesso da injeção foi validado por RT-qPCR e Western blot (Fig. 11A, B). Os resultados manifestaram que injeção de si-MAML1, o peso de ratos VMC foi aumentado (Fig. 11C), função cardíaca foi melhorada (Fig. 11D-G), patologia de tecido miocárdico e fibrose foram atenuadas (Fig. 12A-C), inflamação sérica (Fig. 12D, E) e apoptose de cardiomiócitos (Fig. 13A-G) foram inibidas. Também, os efeitos deletérios de exossomos com miR-133a silenciado em ratos VMC foram revertidos após injeção de si-MAML1.

Discussão

Miocardite é uma doença cardíaca inflamatória resultando em DCM e insuficiência cardíaca e é mais frequentemente induzida por infecções virais como CVB3. Um estudo revelou que miR-133 alivia apoptose de cardiomiócitos e remodelação elétrica em camundongos com VMC. Adicionalmente, miRNAs exossomais alterados também são encontrados ligados com a patogênese de miocardite induzida por CVB3. Exossomos derivados de células progenitoras cardíacas aliviam apoptose induzida por CVB3 via restrição da proliferação de CVB3 em VMC. Este estudo explorou o mecanismo regulatório de miR-133 derivado de BMSC-exossomal sobre fibrose miocárdica e EMT em ratos VMC (Arquivo adicional 1: Fig. 1).

O estudo encontrou que a expressão de miR-133a foi diminuída em VMC. Como demonstrado antes, a expressão de miR-133a é diminuída em IM. Um estudo também sugeriu que a expressão relativa de miR-133 em corações de camundongos de VMC é obviamente diminuída em contraste aos controles. Existem algumas conexões de miRNAs com exossomos. A expressão diferencial de exossomos e de miRNAs exossomais em doença tem sido considerada como biomarcadores de doença com desempenho de diagnóstico clínico não invasivo junto com seus potenciais terapêuticos. Lin et al. encontraram que miR-133 é especialmente classificado em exossomos derivados de células progenitoras endoteliais humanas causadas por hipóxia/reoxigenação (H/R) para aumentar angiogênese de fibroblastos e EMT. Outro estudo revelou que MSCs exibe uma comunicação com células parenquimatosas do cérebro e pode modular crescimento de neuritos por transferência de miR-133b para células neurais via exossomos.

O achado principal deste trabalho manifestou que miR-133a exossomal up-regulado promoveu viabilidade celular, inibiu inflamação, apoptose, EMT e fibrose em ratos com VMC. Eles se adequam bem com uma pesquisa anterior que silenciamento de miR-133a reverte o tratamento com polissacarídeos de Astragalus induzido inibição de proliferação de células de osteossarcoma MG63, junto com promoção de apoptose celular. Outro estudo revelou que miR-133a sobre-expresso suprime angiogênese, apoptose, fibrose e inflamação, enquanto acelera remodelação cardíaca terapêutica em doenças miocárdicas isquêmicas. Similar ao nosso estudo, Li et al. declararam que miR-133 inibe apoptose de cardiomiócitos regulando a expressão de genes relacionados à apoptose nos corações de camundongos VMC. O miR-133a sobre-expresso foi reportado para deprimir apoptose induzida por hipóxia e fortalecer sobrevivência de cardiomiócitos. Enquanto isso, o miR-30a e miR-181d exossomal sérico up-regulado podem ter potenciais para ser aplicados como biomarcadores para diagnóstico de VMC.

Outro achado em nosso estudo foi que miR-133a exossomal up-regulado diminuiu CVF, reduziu a expressão de colágeno I e colágeno III em ratos com VMC. Um artigo elucidou que fator de crescimento de fibroblasto-18 liberado de uma membrana de colágeno causa atividade osteoblástica participando em miR-133a down-regulado. In vitro sobre-expressão de miR-133a deprime hipertrofia de cardiomiócitos e reduz expressão de colágeno, como evidenciado em outro estudo. CVF iguala a razão de área de colágeno para a soma de área miocárdica e área de colágeno, e o valor médio mostra o CVF da seção. Este achado também é reportado por Wang et al. que modelo de camundongo VMC é construído com sucesso por infecção CVB3, manifestando aparente maior expressão de CVF em contraste com o grupo controle. Além disso, o achado é consistente com o de Ferreira et al. que demonstra que miR-133a pode assumir um papel maior na modulação de expressão gênica na patogênese de cardiomiopatia de Chagas crônica, com potencial link como ferramentas diagnósticas e prognósticas. Além disso, evidência tem mostrado que knockdown de MAML1 pode reduzir a hipertrofia de cardiomiócitos pré-tratados. Em nosso estudo, encontramos que MAML1 era o gene alvo de miR-133a e inibição de MAML1 reverteu os efeitos de exossomos com miR-133a silenciado em ratos com VMC. Em lesão miocárdica de isquemia-reperfusão, down-regulação de MAML1 mediada por miR-193b poderia em parte reduzir infarto e enzimas miocárdicas, assim como atenuar apoptose de cardiomiócitos. Também, há um relatório sugerindo que deficiência de MAML1 poderia aliviar fibrogênese hepática.

Conclusão

Em conclusão, este presente estudo oferece evidência que miR-133a é down-regulado em ratos com VMC, e miR-133a exossomal elevado melhora função cardíaca e restringe fibrose miocárdica e EMT em ratos com VMC, assim como aumenta viabilidade e reprime apoptose de cardiomiócitos em VMC através de alvo MAML1. Nosso estudo também sugere que inibição de MAML1 tem efeito protetor em ratos com miocardite e reverte o efeito de exossomos com miR-133a inibido em ratos com VMC. A identificação do miR-133a exossomal em fibrose miocárdica e EMT de miocardite pode potencialmente ampliar nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à miocardite e também ter valor clínico como um novo alvo molecular. Mais pesquisas devem ser empreendidas para fazer incursões no tratamento desta doença.