Detecção de peróxido de hidrogênio com base na modificação de superfícies internas de nanopore de estado sólido

Resumo

Existem muitas técnicas para a detecção de moléculas. Mas a detecção de moléculas por meio de nanoporos de estado sólido em uma solução é uma das tecnologias promissoras, de alto rendimento e baixo custo usadas atualmente. Na presente investigação, uma plataforma de nanoporos de estado sólido foi fabricada para a detecção de peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ), que não é apenas um produto sem rótulo, mas também um participante significativo na reação redox. Temos fabricado com sucesso nitreto de silício (Si ₃ N ₄ ) nanoporos com diâmetros de ~ 50 nm usando um feixe de íons Ga focado, a superfície interna do nanoporo foi modificada com peroxidase de rábano (HRP), empregando química de acoplamento de carbodiimida. As enzimas HRP imobilizadas têm capacidade de induzir reações redox em um único canal de nanopore. Além disso, um único ABTS agregado em tempo real ^{• +} eventos de translocação molecular foram monitorados e investigados. O biossensor de nanoporos de estado sólido projetado é reversível e pode ser aplicado para detectar H ₂ O ₂ várias vezes.

Histórico

A tecnologia de detecção de nanopore origina-se do contador de Coulter [1] e do canal de íon celular [2]. Nanopore detecta moléculas carregadas presentes em uma solução que passa por ele. O aparecimento das moléculas no nanopore pode alterar a condutância do poro aparentemente, conseqüentemente uma mudança no sinal de corrente. A mudança na corrente fornece informações sobre os tamanhos e concentração das moléculas dentro do poro, para revelar o processo de dinâmica dos comportamentos de translocação das moléculas [3]. Alguns objetos em nanoescala podem ser detectados usando um nanoporo, como nanopartículas [4,5,6], vírus [7,8,9], moléculas de proteínas [10,11,12,13] e sequências de DNA [14,15,16 , 17]. Os nanoporos são de dois tipos. Nanopore de biologia e o nanopore de estado sólido. O nanoporo de biologia tem menor relação sinal-ruído (SNR) e resolução mais alta. Proteínas pequenas e não dobradas podem ser detectadas usando nanoporos de biologia [18,19,20,21,22,23]. Nanopore de estado sólido tem tamanho ajustável e maior estabilidade. O nanoporo de estado sólido é normalmente perfurado em um filme, este filme divide a célula fluídica em duas partes [24]. Uma tensão polarizada é aplicada através de uma membrana fina contendo um nanopore, resultando em uma corrente iônica de uma célula para outra [25]. Moléculas de proteína incluindo estruturas dobradas e não dobradas são detectadas e analisadas por nanopore de estado sólido [26,27,28,29]. A interação de proteínas também pode ser detectada usando nanoporos de estado sólido [30, 31]. Além disso, tem a capacidade de detectar a cinética de proteínas [32, 33]. A fim de resolver os limites na faixa de detecção, nanoporos de estado sólido quimicamente modificados foram aplicados extensivamente [34,35,36,37,38,39], nanoporos de estado sólido quimicamente modificados foram aplicados para detectar DNA de fita simples [40] e proteínas [41].

Muitos métodos quantitativos já foram aplicados para a detecção de H ₂ O ₂ , a maioria deles são baseados em espectrometria [42,43,44,45], quimioluminescência [46,47,48,49], amperometria [50,51,52,53] e eletroquímica [54,55,56,57] . Os métodos convencionais de espectrometria e quimioluminescência são comumente demorados e caros. O sensor nanopore de estado sólido tem baixo consumo e estrutura simples, podendo ser usado para detectar moléculas pequenas.

Aqui, apresentamos um tipo de nanoporo de estado sólido que foi modificado com peroxidase de rábano (HRP). Os HRPs foram imobilizados na superfície interna do nanopore de estado sólido, os HRPs imobilizados permaneceram ativos na reação redox que ocorreu dentro de um único canal de nanopore na presença de H ₂ O ₂ [58]. O ABTS ^{• +} produzido na reação redox agregaria, então o ABTS agregado ^{• +} passou por nanopore. Os eventos de translocação podem ser detectados. Para a detecção de peróxido de hidrogênio, a estrutura do estado sólido é simples e pode detectar o ABTS agregado ^{• +} usando baixo consumo de reagente. Este nanoporo de estado sólido de modificação de enzimas peroxidase de rábano (HRP) pode realizar o peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ) detectando indiretamente, por meio do ABTS ^{• +} agregado detecção. Ele tem um significado instrutivo para a detecção de moléculas únicas e nanoporos de estado sólido internos de montagem de moléculas.

Métodos

Produtos químicos e materiais

Molécula de peroxidase de rábano (HRP) (1mg mL ^-1 , Enzyme Commission No.1.11.1.7, 44 kDa) foi adquirido a Xiya Reagent (Chengdu, China). A amostra (HRP) foi dissolvida em 0,02 μm filtrado de PBS 0,1 M, armazenado a 4 ° C e utilizado dentro de dois dias de preparação. Cloreto de potássio (KCl), N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida (EDC), N-hidroxissuccinimida (NHS) e ácido 2,2'-Azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) ((ABTS ), 98%) foram adquiridos da DiBo chemical technology co., LTD (Shanghai, China). Peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ , 30%) foi adquirido da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (3-Aminopropil) trietoxissilano (3-APTES) foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Os experimentos foram conduzidos usando água não armadilhada de um sistema de purificação de água Milli-Q (resistividade de 18,2 MΩ / cm, 25 ° C, Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA) e foi filtrada através de 0,02 μm em um sistema FEI Strata 201 FIB (FEI Co., Hillsboro, OR, USA), um Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS) e um Axopatch 700B (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA). As fotos de nossos instrumentos usados foram adicionadas ao material suplementar (ver Arquivo Adicional 1:Figura S1).

Fabricação de nanoporos de estado sólido e medições elétricas

Primeiro, uma fina membrana de Si ₃ N ₄ (100 nm de espessura) foi depositado em um substrato de Si com 300 μm de espessura. Seguido por fotolitografia (o tamanho da janela aberta é 500 × 500 μm ² ) Em seguida, a superfície da membrana foi bombardeada com íons Ga + usando um sistema FEI Strata 201 FIB (FEI Co., Hillsboro, OR, EUA) a um potencial de aceleração de 30 kV, enquanto a corrente foi medida como 1 pA. O tempo de moagem foi de 1,5 s em modo spot. Finalmente, os chips de nanoporos no estado sólido foram obtidos e limpos em solução de piranha preparada na hora a 80 ° C por 30 min, seguido de enxágue com água ultrapura. Após a limpeza, o chip foi montado em uma célula de Teflon customizada com dois anéis de vedação de Viton para separar os dois lados do chip e formar dois reservatórios para garantir o único caminho para a corrente iônica através do nanopore. As fotos de nossos aparelhos usados foram adicionadas ao material suplementar (ver Arquivo Adicional 1:Figura S2). Eletrodos (Ag / AgCl) foram conectados à célula fluídica e um amplificador patch clamp (Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, EUA) que tornou a corrente iônica mensurável sob tensões constantes, com taxa de amostragem de 100 kHz para sinais . O filtro de Bessel de oito polos interno do amplificador foi ajustado para 10 kHz [3]. Todo o instrumento foi colocado em um compartimento duplo de gaiola de Faraday.

Resultados e discussão

Imobilização de Nanopore com HRPs

O nanoporo selecionado com um diâmetro de ~ 50 nm foi imerso em solução de piranha a 80 ° C por 30 min. Após o tratamento com solução de piranha, a superfície interna do nanopore foi capaz de receber grupos hidroxila de silício. Posteriormente, todo o filme fino foi ativado com (3-Aminopropil) trietoxissilano (3-APTES). Como resultado do tratamento com 3-APTES, o amino (-NH ₂ ) grupos foram gerados na superfície do filme.

Após a ativação com (3-aminopropil) trietoxissilano (3-APTES), o chip nanopore foi colocado em solução PBS 0,1 M de N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida (EDC) (10 mM) e N-hidroxissuccinimida ( NHS) (20 mM). Posteriormente, o chip nanopore foi introduzido na peroxidase de rábano (HRP) (10 ng / ml). De acordo com resultados de pesquisas anteriores de nosso grupo [3], com diferentes concentrações de sal de 0,1 a 2 M KCl, pH 7,0, o HRP não se agregou. Por conta do pI o valor da peroxidase de rábano foi de 4,3 ± 0,2, também provamos que o HRP não agregou em 0,1 M KCl pH 6,0 e pH 7,0. O reagente EDC ativou os grupos carboxila (-COOH) de HRP em um intermediário o-acilisoureia altamente reativo. Além disso, o intermediário foi posteriormente convertido em um éster reativo com succinimidilamina mais estável na presença de NHS [58]. Resultando, no acoplamento covalente do intermediário com o (-NH ₂ ) gerado nas superfícies internas do nanopore para formar ligações de amida estáveis (Fig. 1).

Execução do processo de modificação em um único canal de nanoporos de estado sólido. a Representação esquemática da ligação covalente de peroxidase de rábano (HRP) a um único canal de nanopore via química de acoplamento de carbodiimida. Os grupos carboxil (-COOH) de HRP foram ativados por solução de EDC, permitindo que o HRP reaja com (-NH ₂ ) gerado na superfície de um chip nanopore. b Esquema do sensor de peróxido de hidrogênio HRPs imobilizado, a superfície interna do sensor foi modificada com HRPs. Quando H ₂ O ₂ e ABTS ocorreu, o ABTS ^{• +} produzido. A estrutura cristalina do HRP foi usada com a permissão do autor [3]

Esses processos nos levam à imobilização de HRPs na superfície interna de um único nanoporo. A realização do processo de funcionalização foi confirmada pela medição da corrente-tensão ( I-V ) de um único nanoporo antes e depois da modificação (Fig. 2).

Executando uma tensão de corrente típica ( I-V ) curvas do nanopore não modificado (original) e modificado em KCl 0,1 M, tamponado a pH 7,0 com PBS 0,1 M. A linha preta é o I-V curvas de nanoporos não modificados e linha vermelha é o I-V curvas de nanopore modificado com HRPs. As inserções são a microscopia eletrônica de varredura (SEM) de um único nanopore (diâmetro de ~ 50 nm cis) e o sensor de nanopore. 100 nm é a escala

Caracterização de Nanopore de estado sólido modificado por HRPs

Aqui, a forma de um único Si ₃ N ₄ o canal nanopore é cilíndrico. A Figura 2 mostra a corrente-tensão típica ( I-V ) curvas do nanopore não modificado (original) e modificado em KCl 0,1 M, tamponado a pH 7,0 com PBS 0,1 M. Depois de modificar a superfície interna do nanopore com enzimas HRP, o tamanho dos poros tornou-se menor.

De acordo com Wanunu et al, levando em consideração a condutância externa do nanoporo, o diâmetro do nanoporo de estado sólido pode ser calculado pela seguinte equação,
$$ d =\ left (1+ \ sqrt {1+ \ frac {16 \ sigma l} {\ pi G}} \ right) G / 2 \ sigma $$ (1)
Onde, d e l são o diâmetro e o comprimento do poro, G é a condutância de poro aberto do nanoporo, σ é a condutividade da solução de íons.

Considerando os efeitos geométricos, após a modificação do nanoporo de estado sólido com enzimas HRP, o tamanho efetivo pode ser calculado. O diâmetro de um único nanoporo pode ser calculado com base na equação (1). Onde, o valor da condutância ( G _{não modificado} ) é ~ 15 nS pode ser obtido em I-V curvas do nanoporo de estado sólido não modificado. A condutividade ( σ ) de solução iônica 0,1 M KCl (25 ° C), tamponada a pH 7,0 com 0,1 M PBS é ~ 1,28 S / m. Portanto, o diâmetro do nanoporo não modificado é de ~ 51 nm, é semelhante ao diâmetro medido. Usando o mesmo método, o valor obtido da condutância ( G _modificado ) é ~ 7,5 nS, e o diâmetro (~ 34 nm) do nanoporo modificado pode ser calculado. A redução no diâmetro é possível devido aos dois motivos a seguir, primeiro é o tratamento da superfície interna do nanoporo com (3-aminopropil) trietoxissilano (3-APTES), permitindo que a superfície do nanoporo assuma (-NH ₂ ) grupos amino. A segunda razão é que o diâmetro hidrodinâmico ( D _h ) da enzima HRP é ~ 8 nm [3], os HRPs imobilizados podem reduzir o diâmetro do poro. Aqui, o nanoporo de estado sólido modificado com HRPs com diâmetro de ~ 34 nm é usado como o canal de detecção de peróxido de hidrogênio.

O princípio da reação redox

A reação redox foi conduzida dentro de um único nanopore modificado, e o seguinte processo de reação apresentado concorda bem com a reação redox proposta [58]. Na presença de H ₂ O ₂ (0,5 mM), as enzimas HRP imobilizadas na superfície interna do nanoporo foram convertidas no composto 1 imediatamente. Em seguida, o composto 1 aceitou um elétron da molécula de substrato redutor ABTS (1,5 mM) para gerar o composto 2. Subseqüentemente, o composto 2 foi reduzido de volta à enzima em repouso por meio de uma transferência de elétrons de outra molécula de substrato ABTS.

Os produtos catiônicos (ABTS ^{• +} ) das reações redox foram acumuladas em nanopore único. A translocação de moléculas acumuladas do canal nanopore mudaria a condutância ( G ), e, portanto, a mudança de corrente ( ΔI _b ) pode ser encontrado.
$$ \ mathrm {H} \ mathrm {R} \ mathrm {P} \ left ({\ mathrm {Fe}} ^ {3 +} \ right) \ mathrm {Porp} + {\ mathrm {H}} _ 2 { \ mathrm {O}} _ 2 \ to \ mathrm {H} \ mathrm {R} \ mathrm {P} \ left ({\ mathrm {Fe}} ^ {4 +} =\ mathrm {O} \ right) {\ mathrm {Porp}} ^ {\ cdotp +} \ left (\ mathrm {Composto} \ 1 \ right) + {\ mathrm {H}} _ 2 \ mathrm {O} $$ $$ \ mathrm {H} \ mathrm { R} \ mathrm {P} \ left ({\ mathrm {Fe}} ^ {4 +} =\ mathrm {O} \ right) {\ mathrm {Porp}} ^ {\ cdotp +} + \ mathrm {ABTS} \ to \ mathrm {H} \ mathrm {R} \ mathrm {P} \ left ({\ mathrm {Fe}} ^ {4 +} =\ mathrm {O} \ right) \ mathrm {Porp} \ left (\ mathrm {Composto} \ 2 \ direita) + {\ mathrm {ABTS}} ^ {\ cdotp +} $$ $$ \ mathrm {H} \ mathrm {R} \ mathrm {P} \ left ({\ mathrm {Fe }} ^ {4 +} =\ mathrm {O} \ right) \ mathrm {Porp} + \ mathrm {ABTS} \ to \ mathrm {H} \ mathrm {R} \ mathrm {P} \ left ({\ mathrm {Fe}} ^ {3 +} \ right) \ mathrm {Porp} + {\ mathrm {ABTS}} ^ {\ cdotp +} + {\ mathrm {H}} _ 2 \ mathrm {O} $$

Detecção de eventos de translocação

Os experimentos foram realizados usando nanoporos modificados com peroxidase de rábano (HRP) com diâmetros de poros modificados (~ 34 nm) em KCl 0,1 M, tamponado a pH 7,0 com PBS 0,1 M. 2, 2'-Azinobis- (3-etilbenztiazolina-6-sulfonato (ABTS) (1,5 mM) e peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ) (0,5 mM) foram adicionados ao compartimento trans do nanoporo. Depois de adicionar ABTS e H ₂ O ₂ , os experimentos usando tensões polarizadas de −100 a −800 mV foram realizados e foram amostrados em 100 kHz. Não houve evento de translocação até que a tensão aumentou para −400 mV. A Figura 3 mostra traços de corrente iônica representativos do evento de translocação em diferentes tensões de -400 a -800 mV em 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Os dados dos experimentos de eventos de translocação de longa duração de diferentes tensões foram adicionados ao material suplementar (ver arquivo adicional 1:Figura S3).

a - e Representação esquemática dos eventos de translocação em diferentes tensões de −400 a −800 mV. A frequência dos eventos de translocação aumentou quando a tensão aplicada aumentou de −400 mV para −800 mV. f A amplitude da corrente aumenta linearmente com a tensão. h Uma função com declínio exponencial ( t _d ~ e ^{−v / v0} ) foi empregado para ajustar o tempo de espera dependente das tensões aplicadas

Os eventos de bloqueio de corrente de milissegundos foram observados, conduzidos em 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Adicionando o reagente H ₂ O ₂ e ABTS no transcompartimento, enzimas HRP imobilizadas na superfície interna de um único canal de nanopore e ocorreu a reação redox. Abundância de ABTS ^{• +} moléculas foram produzidas, uma única molécula menor ABTS ^{• +} pode não ser detectado usando nosso nanoporo de estado sólido, devido à resolução do sistema [3]. No entanto, essas moléculas se agregariam após sua produção. Portanto, é possível detectar o ABTS ^{• +} moléculas. Aqui, as tensões negativas foram mantidas e ABTS agregadas ^{• +} moléculas passaram pelos nanoporos. Houve um fluxo eletroforético e eletroosmótico quando a voltagem negativa foi aplicada. HRP foi carregado negativamente em 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0 [3], como resultado, dupla camada elétrica seria produzida, e a eletroosmose seria na direção negativa do eletrodo. Por esse motivo, a eletroforese e a eletroosmose foram na mesma direção. O ABTS agregado ^{• +} no canal nanopore único iria transportar através do nanopore de estado sólido, o fluxo em direção à direção do eletrodo negativo.

Análise estatística de eventos de translocação

Uma vez que a tensão polarizada desempenhou um papel fundamental na translocação de ABTS agregado ^{• +} , a influência dos bloqueios atuais de ABTS agregado ^{• +} passando pelos nanoporos modificados HRPs versus tensões aplicadas foi discutido. A frequência de ocorrência de eventos de translocação melhorou muito com o aumento da voltagem (Fig. 3f). À medida que a tensão aumenta, também aumenta a amplitude da corrente. No entanto, os eventos de translocação desapareceram gradualmente quando a tensão polarizada foi mantida abaixo de −300 mV, o que sugeriu que ABTS agregado ^{• +} através de HRPs, os nanoporos modificados precisavam de uma tensão de limiar de −300 mV. A Figura 4 mostra histogramas da amplitude média atual de eventos de translocação medidos para ABTS agregado ^{• +} em tensões diferentes. Com base nas curvas de ajuste, os valores de pico do bloqueio atual ( ΔI _b ) são 308,4 ± 27,795 pA, 419,1 ± 20,354 pA, 478,8 ± 32,857 pA, 528,1 ± 36,98 pA, 606,9 ± 40,916 pA em −400, −500, -600, −700 e −800 mV, respectivamente, é provável que a redução da corrente é induzida por ABTS agregado ^{• +} molécula que passa através do nanopore em diferentes voltagens. Os valores da amplitude da corrente foram ajustados com uma função polinomial de primeira ordem, que produz uma inclinação de -0,706 e interceptação de 49,262. No entanto, com base nas curvas de ajuste, os valores de tempo de permanência são 54,5 ± 21,374 ms, 42,8 ± 20,181 ms, 10,3 ± 3,05 ms, 6,0 ± 1,744 ms, 4,0 ± 1,441 ms, em −400, −500, −600, - 700 e −800 mV. A Figura 3h mostra uma função em declínio exponencial ( t _d ~ e ^{−v / v0} ) foi empregado para ajustar o tempo de espera dependente das tensões aplicadas. Os histogramas do tempo de permanência dos eventos de translocação foram adicionados ao material suplementar (consulte o arquivo adicional 1:Figura S4).

Os histogramas da amplitude média atual de eventos de translocação medidos para ABTS agregado ^{• +} em tensões diferentes (−400, −500, −600, −700, −800 mV) em 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Todos os histogramas foram ajustados com distribuição gaussiana

O bloqueio atual versus tempo de permanência de eventos para cada ABTS agregado ^{• +} em tensões diferentes foram ajustados em gráficos de dispersão bidimensionais (Fig. 5). Todo o ABTS agregado ^{• +} mostram um cluster de eventos de −400 a −800 mV, os clusters de eventos principais são devido ao ABTS agregado ^{• +} passando pelo nanoporo de estado sólido modificado com HRPs.

Gráficos de dispersão bidimensionais de bloqueio atual versus tempo de permanência de eventos para cada ABTS agregado ^{• +} em tensões diferentes. Seus histogramas correspondentes são colocados à direita e acima. Todos os histogramas foram ajustados com distribuição gaussiana

Além disso, o evento de translocação única em cada voltagem foi analisado, e o bloqueio de corrente foi induzido pelo mesmo tamanho e substância carregada. Assim, considera-se que todo evento de translocação foi induzido pelo único ABTS agregado ^{• +} . Para analisar o tempo de translocação de ABTS agregado ^{• +} em nossos experimentos. A duração do bloqueio atual t _d é considerado como o tempo de permanência de um único ABTS agregado ^{• +} do local onde foi produzido até a saída do nanopore. Aqui, outra condição foi considerada, pode haver algumas enzimas HRP imobilizadas na entrada do nanopore, e isso pode catalisar a reação redox. Portanto, outros experimentos foram realizados para verificar se a reação redox ocorreu na superfície interna de um único nanopore, em vez de na entrada. Para a verificação, os não modificados pelos HRPs foram aplicados e analisados. Esses nanoporos foram ativados com 3-APTES. E a mesma concentração de HRPs (10 ng / ml), ABTS (1,5 mM) e H ₂ O ₂ (0,5 mM) foram adicionados ao compartimento trans do nanopore, a voltagem polarizada negativa foi aplicada em 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0, devido à força da eletroforese, os HRPs foram incapazes de passar pelo nanopore. Devido à reação redox, o ABTS agregado ^{• +} produzidos, mas não foram encontrados eventos de translocação. É possível que o ABTS agregado ^{• +} causa efeito eletrostático com HRPs e evita o ABTS agregado ^{• +} passando pelo nanopore.

A Figura 6 mostra os gráficos de dispersão bidimensionais da mudança de condutância ( ΔG ) versus tempo de permanência de eventos para cada ABTS ^{• +} agregado em tensões diferentes. Pode ser verificado que a mudança de condutância ( ΔG ) concentrado principalmente em 0,8 nS. A forma dos eventos de translocação é quase a mesma. O valor médio de ΔG é ~ 0,8 nS em tensões diferentes. Pode-se especular que a exclusão de volume de cada ABTS agregado ^{• +} molécula é quase a mesma. É possível que os efeitos eletrostáticos e estéricos do ABTS agregado ^{• +} as moléculas podem alterar a corrente iônica. Após a análise, duas formas típicas de traços atuais com o ABTS agregado de carga positiva ^{• +} translocação foram observadas (Fig. 7). Os eventos de translocação em -700 mV como um representante. Foi analisada a porcentagem de eventos do tipo dois, podendo-se observar que a porcentagem de eventos do tipo 1 aumentou com o aumento da tensão, por outro lado, a porcentagem de eventos do tipo 2 diminuiu. Foi considerado que a tensão mais alta torna a translocação mais rápida do que a tensão mais baixa.

Representação esquemática de gráficos de dispersão bidimensionais de ΔG versus tempo de permanência de eventos para cada ABTS ^{• +} agregado em tensões diferentes. As curvas de ajuste correspondentes foram posicionadas acima. O insert são os eventos de translocação de diferentes tensões (de −400 a −800 mV)

a Esquema de dois tipos de eventos de translocação em tensão de -700 mV. b A porcentagem de dois tipos de eventos em tensões diferentes (−400, −500, −600, −700, −800 mV)

Os sinais de bloqueio atuais revelaram o tamanho, conformação e interação do ABTS agregado ^{• +} passando através do único canal nanopore. Para a mudança na forma atual, o processo das mudanças foi especulado. Para o evento 1, os sinais de corrente têm uma parte de flutuação típica com uma intensidade profunda e um tempo de espera curto. É possível que o ABTS agregado ^{• +} passou pelo nanopore do local onde é produzido. Quando o ABTS agregado ^{• +} passou pelo nanopore, a corrente iônica do nanopore restaurada ao nível original (linha de base) ( I ₀ ) Para o evento 2, os sinais de corrente têm uma parte de flutuação de intensidade profunda e depois um estágio horizontal. Esta forma de sinais pode ser atribuída à interação eletrostática de ABTS agregado ^{• +} com os HRPs na saída do nanopore, e a corrente foi lentamente recuperada para a linha de base. Para uma melhor compreensão da mudança atual, precisamos começar com a mudança de condutância de poro aberto ( G _poro ) na concentração de sal (0,1 M KCl). Conforme discutido nos estudos anteriores, uma equação da condutância de poro aberto de um nanoporo carregado negativamente com um diâmetro de d e um comprimento de l em baixa concentração de sal pode ser descrito como
$$ {G} _ {p ore} =\ frac {\ pi {d ^ 2} _ {p ore}} {4 {l} _ {p ore}} \ left [\ left ({\ mu} _ { K ^ {+}} + {\ mu} _ {C {l} ^ {-}} \ direita) {n} _ {K Cl} \ cdot e + {\ mu} _K \ frac {4 {\ sigma} _p } {d_ {p ore}} \ right] $$ (2)
onde μ _K e μ _Cl são as motilidades eletroforéticas de K ⁺ e Cl ^- , n _KCl é a densidade numérica de K ⁺ e Cl ^- , a carga elementar é e, σ _p é a densidade de carga superficial das superfícies dos nanoporos. Neste experimento, o nanoporo de estado sólido foi modificado quimicamente e o diâmetro do nanoporo foi alterado. A densidade de carga superficial da superfície do nanoporo ( σ _p ) não pode ser obtido exatamente. Portanto, a condutância de poro aberto ( G _poro ) foi calculado com base na equação (1). Por conta da equação (1), a condutância do poro aberto ( G _poro ) é ~ 7,5 nS. Especula-se que a mudança de condutância pode ser atribuída a dois motivos [15]. A primeira razão é que, a exclusão de volume de íons em nanopore foi ocupada pelo ABTS agregado ^{• +} moléculas. Como resultado, a condutância do nanoporo de estado sólido foi diminuída ( ΔG ^- ) A segunda razão é que alguns íons foram trazidos do nanopore pelo ABTS agregado ^{• +} moléculas que aumentaram a condutância do nanopore de estado sólido. Nestes experimentos, o ABTS ^{• +} produzido dentro do nanopore, e nenhum íon foi trazido. Portanto, a mudança na condutância do nanoporo de estado sólido ( ΔG ) foi apenas induzida pela exclusão de volume. Portanto, a mudança total da condutância pode ser descrita como
$$ \ varDelta G =\ varDelta {G} ^ {-} $$ (3)
A diminuição na condutância do nanoporo de estado sólido é induzida pela exclusão de volume e pode ser calculada pela seguinte equação
$$ \ varDelta {G} ^ {-} =\ sigma \ frac {\ gamma \ varLambda} {{\ left (l + 0.8 d \ right)} ^ 2} $$ (4)
onde γ é o fator de forma da partícula que é a proporção das áreas de superfície do mesmo volume esférico e da partícula. Neste trabalho, o ABTS agregado ^{• +} molécula foi simplificada para um objeto global, portanto, o valor de γ é 1 e Λ é a exclusão de volume. A condutividade da solução a granel σ é 1,28 S / m, KCl 0,1 M (25 ° C).

Para a exclusão de volume ( Λ ), podemos deduzir a partir dos eventos de translocação de algumas outras moléculas. Para conectar a mudança de condutância ( ΔG ) à propriedade física das moléculas, a Lei de Ohm pode ser aplicada à mudança de volume da solução eletrolítica com base no nanoporo de estado sólido [59]. Quando ocorre um evento de translocação de uma molécula em um nanoporo de estado sólido cilíndrico, a corrente diminui instantaneamente. Quando a resistência do nanoporo de estado sólido é a resistência do circuito inteiro, a condutância muda ( ΔG ) pode ser descrito pela seguinte equação
$$ \ varDelta G (t) =- {G} _ {p ore} \ frac {\ varLambda (t)} {H_ {eff} {A} _p} \ left [1+ f \ left ({d} _m / {D} _p, {l} _m / {H} _ {ef} \ direita) \ direita] $$ (5)
Nesta equação, A _p H _eff =V _p é o volume do nanoporo de estado sólido, f ( d _m / D _p , lm / H _eff ) é o fator de correção (ele ignorou o efeito da carga superficial), em nossos experimentos, simplificamos o ABTS agregado ^{• +} molécula a um objeto global; portanto, o fator de correção é 1. O d _m / D _p é a razão entre o diâmetro da molécula e o diâmetro do nanoporo, o lm / H _eff é a razão entre o comprimento efetivo da molécula e o comprimento efetivo do naopore. A expressão (5) pode ser simplificada como
$$ \ varDelta G / {G} _ {p ore} \ approx \ varLambda / {V} _p $$ (6)
O valor médio da condutância ( G _poro ) foi analisado de eventos de translocação. A partir da equação (5), o valor médio de exclusão de volume ( Λ ) em diferentes tensões (-400, -500, -600, -700, -800 mV) podem ser obtidos. Enquanto isso, o tamanho do nanopore usado é conhecido, o volume do nanopore ( V _p ) é ~ 90746 nm ³ . Por conta da equação (4), o valor da condutância muda ( ΔG ^- ) pode ser calculado como ~ 0,6 nS. O valor médio da mudança de condutância obtido a partir dos experimentos de eventos de translocação em diferentes tensões (−400, −500, −600, −700, −800 mV) é ~ 0,784 nS. Pode-se verificar que o valor calculado está próximo do valor experimental.

Em algumas investigações anteriores, moléculas de peróxido de hidrogênio foram detectadas com diferentes tecnologias. Porém, detectar o peróxido de hidrogênio por nanocanal é raro. Tan et al. [3] diferenciaram sinais de eventos díspares quando HRPs encadeados em nanopore, havia ABTS e H ₂ O ₂ em solução de KCl. Os diferentes tipos de sinais com translocação HRPs foram considerados como ABTS ^{• +} passando por nanopore. Seis eventos típicos da translocação do produto de substratos de catálise enzimática foram analisados. Eles especularam o processo provável de cada tipo. No entanto, não há evidências suficientes para testemunhar. Mubarak Ali et al. conseguiram detectar os produtos da reação redox em nanocanais cônicos únicos [58]. Eles descobriram que o radical catiônico ABTS ^{• +} reduced the ion current in the HRP-nanochannel in a voltage-dependent fashion, consistent with voltage-dependent concentrations of ions in conical nanochannels. The magnitude of the current blockage was correlated with the H₂ O ₂ concentration in the solution.

Conclusions

In conclusion, we fabricated a Si₃ N ₄ nanopore employing a FIB successfully, a single naonopore system whose surface was modified with covalently linked HRP enzymes. The effect of the immobilized HRPs enzymes in a single solid-state nanopore as a hydrogen peroxide (H₂ O ₂ ) sensor was affirmed by investigating products (ABTS^•+ ) of the redox reactions occurring in presence of the substrates H₂ O ₂ and ABTS. The aggregated cationic radical ABTS^•+ produced inside the solid-state nanopore and reduced the ionic current in the HRPs modified solid-state nanopore, are consistent with voltage-dependence. The current blockade trends showed linear dependence for applied biased voltages. The relationship between the dwell time versus applied biased voltage was the exponentially decaying (t _d ~ e ^−v/v0 ) Meanwhile, the aggregated ABTS^•+ passed through the HRPs modified nanopores needed a −300 mV threshold voltage. The change of conductance (ΔG) has been calculated analytically and compared to the measured experimental values. The translocation events were produced by the certain size aggregated cationic radical ABTS^•+ . We expect that using solid-state nanopores will allow lowering the detection limit and improve the system sensitivity. For our solid-state nanopore system, the structure is simple; it is not susceptible to fouling and can be used multiple times.

Abreviações

3-APTES:: (3-Aminopropyl)triethoxysilane
ABTS:: 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid
EDC:: N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide
FIB:: Focused ion beam
HRP:: Horseradish peroxidase
KCl:: Potassium chloride
NHS:: N-hydroxysuccinimide
SEM:: Microscopia eletrônica de varredura
SNR:: Signal to noise ratio

Peculiaridades estruturais de compósitos poliméricos orgânicos-inorgânicos condutores de íons baseados em resina epóxi alifática e sal de perclorato de lítio As Nanofibras Hierárquicas de Poliamida 6-ZnO Antibacteriana Fabricadas por Deposição de Camada Atômica e Crescimento Hidrotérmico

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