Sensores de Pontos Quânticos de Carbono de Duplo Modo para Detecção Rápida e Seletiva de Peróxido de Hidrogênio

Resumo

Peróxido de hidrogênio (H₂O₂) é um produto importante de reações enzimáticas baseadas em oxidase, como a reação glicose/oxidase de glicose (GOD). Portanto, a detecção do H₂O₂ gerado para alcançar a detecção de vários carboidratos e suas oxidases é muito significativa. Aqui, relatamos um tipo de pontos nanométricos de carbono (CDs) de dupla emissão que podem servir como novos nanosensores de duplo modo com saídas fluorométrica e colorimétrica para a detecção seletiva de H₂O₂. Os nanosensores de duplo modo são estabelecidos apenas pelos CDs de dupla emissão não decorados, onde mudanças fluorométricas e colorimétricas significativas são observadas com a adição de diferentes concentrações de H₂O₂ na solução de CDs, o que beneficia a detecção a olho nu de H₂O₂. O mecanismo dos nanosensores pode ser atribuído ao fato de que estímulos químicos externos como radicais hidroxila do H₂O₂ provocam a mudança de propriedades de superfície e a agregação de CDs, que dominam a emissão e absorção dos CDs. Os nanosensores de duplo modo construídos exibem boa biocompatibilidade e alta seletividade para H₂O₂ com uma faixa de detecção linear variando de 0.05 a 0.5 M e permitem a detecção de H₂O₂ tão baixa quanto 14 mM.

Introdução

Pontos nanométricos de carbono fluorescentes (CDs) têm despertado extensa atenção de pesquisa por suas propriedades físico-químicas únicas como boa biocompatibilidade, baixa toxicidade, fotoluminescência (PL) ajustável, e alto rendimento quântico. Devido aos caracteres acima, CDs encontraram aplicações potenciais em uma variedade de campos incluindo, mas não limitados a, bioimagem, biossensores e dispositivos emissores de luz. Além disso, devido à sua capacidade de conversão ascendente e descendente, ausência de piscamento óptico, e alta fotostabilidade comparada a corantes orgânicos ou pontos quânticos semicondutores (QDs), CDs são mais adequados para aplicações em nanosensores fluorescentes por aumento ouquenching de fluorescência.

Peróxido de hidrogênio (H₂O₂) é um tipo de oxidante comum, que é sempre usado como desinfetante médico pela capacidade de esterilização. Além disso, H₂O₂ é também um produto importante de reações enzimáticas baseadas em oxidase, como a reação glicose/oxidase de glicose (GOD). Portanto, a estratégia de detecção através da sondagem de H₂O₂ pode ser empregada como uma abordagem promissora para a detecção de carboidratos e suas oxidases. Por esta razão, a detecção de H₂O₂ pode ser usada para monitorar doenças sobre metabolismo de carboidratos, como diabetes. Atualmente, embora vários sensores de glicose baseados na determinação de H₂O₂ tenham sido desenvolvidos usando uma variedade de métodos analíticos, sistemas de sensores previamente relatados são principalmente baseados em um único sinal como mudança condutométrica, fluorométrica ou colorimétrica. Recentemente, avanços em nanotecnologia, especialmente em nanopartículas fluorescentes como QDs semicondutores e nanopartículas baseadas em carbono emergentes trouxeram novos nanosensores de H₂O₂. Lu et al. desenvolveram um tipo de micro-híbridos de dupla emissão (DEMBs) combinando QDs de CdTe e rodamina para detecção fluorométrica ratiométrica de glicose através do monitoramento da geração de H₂O₂. Zhang et al. relataram um nanosensor fluorescente que mostrou resposta seletiva e sensível a H₂O₂ através do quenching de fluorescência de CDs. No entanto, estes trabalhos inevitavelmente trouxeram os defeitos intrínsecos de QDs baseados em semicondutores com constituintes químicos caros e poluição por metais pesados. Além disso, os nanosensores baseados em leitura de sinal único, seja quenching de fluorescência ou mudança de cor, podem ter pouca estabilidade de ensaio devido às flutuações de fatores ambientais e erros de operação experimental. Em vista das considerações acima, desejamos desenvolver uma nova classe de CDs fluorescentes, cuja fluorescência e cor da solução são muito sensíveis à mudança das concentrações de H₂O₂. Assim, um nanosensor de duplo modo baseado nestes CDs pode ser alcançado para detectar distintamente e sensivelmente o H₂O₂ inspecionando simultaneamente as mudanças fluorométricas e colorimétricas da solução de CDs, o que é benéfico para a realização de detecção a olho nu do H₂O₂.

Neste estudo, desenvolvemos um método fácil e conveniente para sintetizar um novo tipo de CDs, que exibe uma cor de solução vermelho escuro sob luz visível e dupla emissão fluorescente sob uma lâmpada UV de 365 nm (emissão de fluorescência azul e verde). Os CDs são simplesmente sintetizados através do método solvotérmico com ácido cítrico, ureia, e N,N-dimetilformamida (DMF) como fonte de carbono, fonte de nitrogênio, e solvente de reação, respectivamente. A fluorescência e a cor da solução são muito sensíveis às mudanças nas concentrações de H₂O₂. Assim, um nanosensor de duplo modo baseado nestes CDs pode ser alcançado para detectar distintamente e sensivelmente o H₂O₂ inspecionando simultaneamente as mudanças fluorométricas e colorimétricas da solução de CDs, o que é benéfico para a realização de detecção a olho nu do H₂O₂. Sem a introdução de qualquer instrumento caro, um nanosensor de duplo modo baseado nestes CDs foi estabelecido. Este sistema de detecção pode efetivamente evitar erros potenciais de operação e melhorar marcadamente a confiabilidade da medição. Além disso, os nanosensores baseados em CDs são promissores na aplicação de detecção de glicose no sangue tanto in vivo quanto in vitro devido à sua boa biocompatibilidade e alta solubilidade em água.

Métodos

Síntese dos CDs

Os CDs foram preparados usando um método solvotérmico com ácido cítrico como fonte de carbono, ureia como fonte de nitrogênio, e DMF como co-reagente. Em um experimento típico, ácido cítrico (1 g) e ureia (2 g) foram dissolvidos em 10 mL de DMF. A solução foi então transferida para um autoclave revestido de poli(tetrafluoretileno) de 25 mL e aquecido a 160 °C por 4 h. Após a reação, o autoclave foi resfriado naturalmente até a temperatura ambiente. Uma solução vermelho escuro foi obtida. Os CDs foram precipitados adicionando 5 mL de solução de reação em 25 mL de etanol abundante e centrifugados a 7500 rpm por 30 min. Então, o precipitado foi dialisado para obter CDs puros. Os CDs preparados foram coletados e secos em um forno de secagem a vácuo a 60 °C e sob <1 Pa por 12 h. Então, os CDs foram redissolvidos em água deionizada para formar solução de CD de 0.75 mg mL⁻¹ para pesquisa adicional. E os CDs subsequentemente tratados com H₂O₂ foram coletados e secos com o mesmo método para caracterização da morfologia de superfície e propriedades estruturais.

Medições

A morfologia de superfície dos CDs foi caracterizada por microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução (HRTEM, JEOL JSM-IT100). As propriedades estruturais dos CDs foram realizadas por um difratômetro de raios X (XRD, PA National X'Pert Pro) e um espectrômetro micro-Raman (Renishaw RM 2000). Os espectros de absorção dos CDs foram medidos em um espectrofotômetro UV-Vis-NIR Hitachi U-3900. Os espectros de fluorescência dos CDs foram medidos por um espectrofotômetro (Hitachi F-7000). O rendimento quântico de fluorescência dos CDs foi obtido pelo espectrômetro Horiba FL-322 com uma esfera integradora calibrada. As curvas de decaimento de fluorescência dos CDs também foram medidas por Horiba FL-322 usando um NanoLED de 405 nm monitorando a emissão a 450 e 500 nm, respectivamente. O espectro de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) dos CDs foi gravado em um espectrômetro Bio-Rad Excalibur (Bruker Vector 22). Espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) foi gravada em um espectrômetro de fotoelétrons de raios X ESCALAB MK II usando Mg como fonte excitante.

Estabelecimento dos Nanosensores de CD

Para a detecção de H₂O₂, os espectros de fluorescência e absorção dos CDs na presença de H₂O₂ foram examinados em tampão PBS (pH = 7.4, a 25 °C). Em um experimento típico, uma quantidade diferente de H₂O₂ foi misturada com água destilada primeiro e então 20 μL de solução de CD 0.75 mg mL⁻¹ foi injetada em 4 mL de solução de H₂O₂ com diferentes concentrações (0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 1.0 e 2.0 M). Então, fotografias, fluorescência e espectros de absorção foram obtidos após os CDs serem adicionados na solução de H₂O₂.

A seletividade dos nanosensores baseados em CD também foi avaliada. A solução de CD (20 μL, 3.75 μg mL⁻¹) foi misturada com diferentes tipos de cátions e oxidantes (4 mL, 0.1 M) e então a solução foi agitada por 1 min. Por fim, os espectros de absorção UV-Vis e fluorescência da solução foram registrados após os CDs serem adicionados na solução de H₂O₂.

Resultados e Discussão

Caracterização dos CDs

A morfologia dos CDs preparados foi medida por microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Como mostrado na Fig. 1a, os CDs estão bem dispersos com uma faixa de tamanho uniforme de 2.5–6.5 nm e um diâmetro médio de cerca de 5 nm (Arquivo Adicional 1: Figura S1b). Além disso, a imagem de HRTEM (inseto da Fig. 1a) mostra franjas de difração em torno de 0.21 nm que concorda com o (100) de grafite. Os padrões de XRD dos CDs mostrados na Fig. 1b exibem um pico largo em torno de 23.4°, que corresponde aos átomos de carbono altamente desordenados com uma estrutura de carbono tipo grafite. Os espectros de Raman dos CDs (Fig. 1c) revelam duas bandas: banda D (em torno de 1347 cm⁻¹, devida às vibrações de carbono sp³-hibridizado com imperfeição e desordem) e banda G (em torno de 1577 cm⁻¹, associada aos modos de vibração E_2g de carbono sp²-hibridizado em uma estrutura cristalina hexagonal bidimensional). Os espectros de FTIR dos CDs (Fig. 1d) apresentam bandas largas de absorção de vibração de O–H/N–H a 3100–3600 cm⁻¹, vibrações de estiramento de C=O/C=C em torno de 1690–1610 cm⁻¹ e vibrações de estiramento de N–O em torno de 1350–1390 cm⁻¹. Os dados acima indicam que pode haver alguns grupos funcionais na superfície dos CDs, e estes grupos funcionais podem desempenhar um papel importante na alta hidrofilicidade e estabilidade dos CDs em solução aquosa.

O comportamento fluorescente dos nanosensores baseados em CD para H₂O₂ foi medido em soluções aquosas de CD mostradas na Fig. 1e. Sob excitação de comprimento de onda único a 365 nm, as soluções de CD ilustram espectros de emissão assimétricos, que poderiam ser ajustados por bandas fluorescentes duplas centradas em 450 e 500 nm, correspondentes a bandas fluorescentes azul e verde, respectivamente. Quando as soluções de CD são misturadas com H₂O₂, a intensidade da banda azul demonstra uma diminuição maior que a da verde. Consequentemente, as emissões mais fortes dos CDs mudam de 450 para 500 nm a partir dos resultados das matrizes de excitação-emissão dos CDs após a adição de H₂O₂ (Arquivo Adicional 1: Figura S2). Como resultado, a cor de fluorescência das soluções de CD muda de azul para verde sob iluminação de lâmpada UV de 365 nm (inseto da Fig. 1e). Além disso, as soluções de CD experimentam simultaneamente uma mudança colorimétrica de vermelho escuro para verde após a adição de H₂O₂ (inseto da Fig. 1f). Esta mudança de cor pode ser atribuída à evolução da intensidade das bandas de absorção em torno de 555 e 595 nm causada pela adição de H₂O₂ na solução de CD (Fig. 1f). Juntos, estes resultados confirmam que os CDs poderiam ser usados como nanosensor de duplo modo para a detecção de H₂O₂.

Mecanismo de Detecção

Para investigar o mecanismo de detecção, a morfologia e propriedades de fluorescência dos CDs após adição de H₂O₂ também foram caracterizadas. Como ilustrado no Arquivo Adicional 1: Figuras S1a e S1c, a adição de H₂O₂ na solução de CD pode levar à agregação de CDs, cujos tamanhos variam de 30 a 60 nm. A agregação de CDs induzida por H₂O₂ também foi revelada nos espectros de absorção normalizados (Arquivo Adicional 1: Figura S3); ou seja, a banda de absorção dos CDs deslocou-se para o vermelho de 555 para 595 nm na região visível. Correspondentemente, a cor da solução de CD varia de vermelho escuro para verde, junto com o estado de dispersão dos CDs tornando-se um estado de agregação. Os espectros de XRD (Fig. 1b e Arquivo Adicional 1: Figura S4) dos CDs antes e depois da adição de H₂O₂ alteram pouco, indicando que não há mudanças na estrutura cristalina dos CDs.

A evolução de fluorescência dos CDs preparados com a adição de H₂O₂ foi investigada por espectros de fluorescência. As matrizes de excitação-emissão mostram que a adição de H₂O₂ faz os centros de emissão dos CDs mudarem de 450 para 500 nm (Arquivo Adicional 1: Figura S2). As curvas de decaimento de fluorescência mostradas na Fig. 2a para os CDs com emissão a 450 e 500 nm podem ser bem ajustadas por uma função de decaimento mono-exponencial com um tempo de vida médio de 7.96 e 7.12 ns, respectivamente (sob excitação de 365 nm). Em contraste, o tempo de vida de decaimento de fluorescência dos CDs após o tratamento com H₂O₂ tornou-se 4.53 e 4.83 ns (Fig. 2b e Tabela 1). Enquanto isso, o rendimento quântico de PL (η _int) dos CDs mudou de 5.5 para 4.6% quando H₂O₂ foi adicionado na solução de CD. Considerando a mudança de tempo de vida de fluorescência e rendimento quântico de PL, pode-se concluir que transferência de carga (CT) pode ocorrer entre CDs e H₂O₂, que poderia ser um gatilho para fazer a mudança de espectros de PL dos CDs.

Os espectros de FTIR e XPS dos CDs foram medidos para dar insight na composição química e mudanças ambientais causadas pelo H₂O₂. Os espectros de FTIR dos CDs antes e depois da adição de H₂O₂ mostrados no Arquivo Adicional 1: Figura S7 ilustram que as vibrações de estiramento de N–O em torno de 1350–1390 cm⁻¹ aumentam com a adição de H₂O₂, o que também é confirmado pelo resultado dos espectros de XPS. Observa-se nos espectros de XPS de varredura completa (Arquivo Adicional 1: Figura S8) que a razão O para N dos CDs antes e depois do tratamento com H₂O₂ foi 1.57 e 3.85, respectivamente. O aumento da razão O/N revela que os estados de ligação de N nos CDs podem mudar com a adição de H₂O₂, o que está em linha com os espectros de XPS N1s de alta resolução mostrados na Fig. 2c, d. A partir do resultado dos espectros de XPS N1s, o conteúdo de N grafítico nos CDs foi aumentado com a adição de H₂O₂. Além disso, há um pico adicional de estado N–O a 407.3 eV nos espectros N1s após a adição de H₂O₂, que demonstra obviamente que a importação de H₂O₂ traz a variação dos estados de superfície nos CDs. Todas as pesquisas manifestam que a estrutura de N na superfície poderia ser mudada pela adição de H₂O₂.

Relatórios anteriores sugerem que as bandas de emissão dos CDs estão relacionadas aos estados de superfície como radicais dopados com N e grupos de ureia. Enquanto isso, estes estados de superfície são sensíveis a estímulos físicos ou químicos externos. Com base na análise foto-física e ambiental de superfície, propomos o mecanismo da evolução de fluorescência com a introdução de H₂O₂ (Fig. 3). O estado de borda dos CDs preparados consiste em grupos N pirrólicos conjugados. Este tipo de estado de N pode ser principalmente localizado em nível de alta energia. Assim, o elétron excitado pode relaxar não radiativamente para o estado de superfície de N de alto nível e então transferir radiativamente para o estado fundamental acompanhado com bandas de emissão de fluorescência em torno de 450 nm. Em contraste, a intensidade de fluorescência da solução de CD diminui ligeiramente devido ao quenching dinâmico entre H₂O₂ e CDs, onde a CT surge entre CDs e H₂O₂ similar a relatórios anteriores. Caso contrário, poderia-se deduzir que os radicais fluorescentes de alta energia (estado de N relacionado) são transformados em estado de N–O de menor energia em virtude do impacto de radical hidroxila do H₂O₂. Então, o elétron excitado pode relaxar principalmente com uma transição radiativa do estado de N–O de menor energia para o estado fundamental com uma banda de emissão verde a 500 nm, o que também resulta no quenching estático de fluorescência a 450 nm. Portanto, as principais bandas de emissão dos CDs poderiam apresentar uma mudança da emissão azul para a emissão verde.

Avaliação dos Nanosensores de CD

Com base no comportamento fluorescente e colorimétrico acima dos CDs, desenvolvemos um nanosensor para detectar H₂O₂ pelos CDs. O sistema de nanosensoriamento proposto consiste em CDs com concentração adequada em solução aquosa (3.75 μg mL⁻¹, Arquivo Adicional 1: Figura S9), onde os CDs servem função dupla como repórteres colorimétricos e fluorométricos neste sistema.

O sistema de nanosensoriamento proposto baseado na solução de CD é ilustrado na Fig. 4. As mudanças fluorométricas e colorimétricas causadas por H₂O₂ poderiam ser distintamente visualizadas a olho nu (Fig. 4c, f), onde uma série de mudança de cor notável de azul para verde e de vermelho escuro para verde pode ser observada sob iluminação UV e luz do dia. Além disso, a adição de H₂O₂ na solução de CD também pode ser expressa quantitativamente com os espectros de fluorescência e absorção (Fig. 4a, d). Como mostrado na Fig. 4a, a banda de fluorescência centrada em 450 e 500 nm diminui gradualmente com o aumento da concentração de H₂O₂ de 0 a 2 M. No entanto, o aumento da concentração de H₂O₂ leva à diminuição diferente da intensidade de fluorescência a 450 nm (I ₄₅₀) e 500 nm (I ₅₀₀), o que concorda bem com a mudança de cor de fluorescência na solução de CD (Fig. 4c). Portanto, a razão da intensidade de fluorescência a 500 nm para a de 450 nm é selecionada para monitorar a concentração de H₂O₂ (Fig. 4a, b). A razão menor está relacionada à emissão azul, enquanto a fluorescência verde pode ser observada a olho nu em uma razão maior de I ₅₀₀ para I ₄₅₀. A faixa de detecção linear por estes meios varia de 0.05 a 0.5 M com uma correlação linear R ² = 0.987. Similarmente, a mudança colorimétrica ocorre na solução de CD por causa da diminuição inhomogênea da banda de absorção a 555 e 595 nm. Como mostrado na Fig. 4d, a intensidade de absorção diminui na região visível, mas o aumento da concentração de H₂O₂ resulta em que a absorção em torno de 595 nm diminui mais lentamente que em torno de 555 nm. Portanto, a razão da absorção a 595 nm (A ₅₉₅) para a de 555 nm (A ₅₅₅) também poderia ser usada para medir a concentração de H₂O₂. A razão de A ₅₉₅ para A ₅₅₅ aumenta exponencialmente de 0.05 a 2 M com uma correlação exponencial R ² = 0.999, e a mudança colorimétrica correlaciona bem à faixa de concentração de H₂O₂ de 0.05 a 0.25 M com limite de detecção linear (LOD) de 14 mM (Arquivo Adicional 1: Figura S11 e Tabela S1). Os nanosensores de duplo modo têm uma sensibilidade adequada deste método satisfazendo os requisitos clínicos e medicinais devido à concentração de H₂O₂ através da reação GOD variando em torno de milimolar (~10 mM) no plasma. Além disso, os nanosensores de duplo modo têm uma referência de calibração embutida intrínseca, então flutuação de intensidade e outros fatores causados externamente podem ser eliminados, o que contribui para a promoção da precisão do teste.

Para avaliar a seletividade dos nanosensores para H₂O₂, ensaios de interferência foram realizados sob condições idênticas usando alguns cátions comuns, como Na⁺, K⁺, NH₄⁺, Ca²⁺, Zn²⁺ e Fe²⁺. Como mostrado na Fig. 5a, b, as mudanças fluorométricas e colorimétricas dos CDs foram pesquisadas na presença de diferentes cátions. Na presença de Na⁺, K⁺, NH₄⁺, Ca²⁺, Zn²⁺ e Fe²⁺, a razão de fluorescência de I ₅₀₀ para I ₄₅₀ e a razão de absorção de A ₅₉₅ para A ₅₅₅ aparecem apenas como uma leve variação comparada com a amostra em branco, o que significa que estes cátions têm pouca interferência na detecção de H₂O₂. Além disso, também comparamos o impacto nos CDs com outros oxidantes, como HNO₃, KClO₃, FeCl₃, NaClO, K₂Cr₂O₇ e KMnO₄ (Fig. 5c, d e Arquivo Adicional 1: Figuras S12 e S13), e descobrimos que a cor de fluorescência muda de azul para verde com a adição destes oxidantes exceto K₂Cr₂O₇ e KMnO₄. Então, podemos excluir a interferência de K₂Cr₂O₇ e KMnO₄ através da mudança de fluorescência. Além disso, podemos facilmente excluir o impacto de outros oxidantes como HNO₃, KClO₃, FeCl₃ e NaClO do resultado da razão de absorção de A ₅₉₅ para A ₅₅₅. Portanto, os nanosensores de duplo modo demonstrados neste artigo podem ser muito promissores na alta seletividade da determinação devido ao efeito sinérgico dos dois métodos de detecção independentes. Além disso, medimos o tempo de resposta da mudança fluorométrica após a adição de H₂O₂ e descobrimos que a fluorescência diminui após injetar H₂O₂ e é mantida estável em cerca de 3.3 s (Arquivo Adicional 1: Figura S14).

A viabilidade de células A549 foi examinada usando ensaio padrão CCK-8 para avaliar a citotoxicidade dos CDs. Como mostrado na Fig. 6, descobrimos que viabilidade próxima a 80% é obtida incubando células A549 com CDs por 48 h mesmo em alta concentração de CDs como 500 μg mL⁻¹. Calcula-se que a concentração inibitória 50% (IC50) dos CDs é de cerca de 1106 μg mL⁻¹ pelo GraphPad Prism 5.0, o que deduz que os CDs têm boa biocompatibilidade e citotoxicidade muito baixa em alta concentração. Além disso, comparamos o desempenho analítico de nanosensores previamente relatados para a determinação de H₂O₂ mostrado no Arquivo Adicional 1: Tabela S2. A biocompatibilidade, simplicidade e visualização da detecção são comparáveis ou até melhores que a maioria destes ensaios de H₂O₂ relatados. Considerando que os nanosensores de duplo modo baseados em CD têm boa seletividade para detecção de H₂O₂, limite de detecção adequado (LOD = 14 mM) na mesma ordem da glicose no sangue, e citotoxicidade muito baixa em alta concentração de CDs, os nanosensores são promissores para serem usados no teste de glicose no sangue e outros requisitos clínicos.

Conclusões

Em conclusão, propomos um nanosensor de duplo modo baseado em CDs com saídas colorimétrica e fluorométrica para a detecção quantitativa de H₂O₂ baseada na mudança fluorométrica e colorimétrica da solução de CD após a introdução de H₂O₂. Os nanosensores são simples e fáceis de alcançar detecção a olho nu para H₂O₂. O mecanismo dos nanosensores pode ser atribuído ao fato de que estímulos químicos externos como radicais hidroxila do H₂O₂ provocam a mudança de propriedades de superfície e a agregação de CDs, que dominam a emissão e absorção dos CDs. Os nanosensores propostos exibem boa biocompatibilidade, alta seletividade para H₂O₂ com uma faixa de detecção linear variando de 0.05 a 0.5 M, e um limite de detecção de cerca de 14 mM, que é comparável ao nível de H₂O₂ produzido pelas reações GOD. Acredita-se que a estratégia relatada neste artigo pode fornecer uma abordagem promissora para desenvolver um novo sensor em glicose no sangue, que poderia ser valioso no diagnóstico de doenças e testes ambientais.