Detecção Aprimorada de Peróxido de Hidrogênio via Nanoporos de Estado Sólido Modificados na Superfície

Resumo

Existem muitas técnicas para detecção de moléculas. Mas detecção de moléculas através de nanoporo de estado sólido em solução é uma tecnologia promissora, de alta vazão e baixo custo usada atualmente. Na presente investigação, uma plataforma de nanoporo de estado sólido foi fabricada para detecção de peróxido de hidrogênio (H₂O₂), que não é apenas um produto livre de marcador mas também participante significativo em reação redox. Fabricamos com sucesso nanoporos de nitreto de silício (Si₃N₄) com diâmetros de ~50 nm usando feixe de íons Ga focalizado, a superfície interna do nanoporo foi modificada com peroxidase de raiz-forte (HRP) empregando química de acoplamento carbodiimida. As enzimas HRP imobilizadas têm capacidade de induzir reações redox em um único canal de nanoporo. Além disso, eventos de translocação molecular única de ABTS•+ agregado foram monitorados e investigados em tempo real. O biossensor de nanoporo de estado sólido projetado é reversível e pode ser aplicado para detectar H₂O₂ múltiplas vezes.

Introdução

Tecnologia de detecção por nanoporo origina-se do contador Coulter e canal iônico celular. Nanoporo detecta moléculas carregadas presentes em solução passando através dele. A aparição das moléculas no nanoporo pode mudar a condutância do poro aparentemente, consequentemente uma mudança no sinal de corrente. A mudança na corrente fornece informações sobre tamanhos e concentração das moléculas dentro do poro, revelando o processo dinâmico de comportamentos de translocação molecular. Alguns objetos nanoescala podem ser detectados usando nanoporo, como nanopartículas, vírus, moléculas de proteína e sequências de DNA. Nanoporos são de dois tipos: nanoporo biológico e nanoporo de estado sólido. O nanoporo biológico tem menor relação sinal-ruído (SNR) e maior resolução. Proteínas pequenas e desdobradas podem ser detectadas usando nanoporos biológicos. Nanoporo de estado sólido é tamanho ajustável e tem maior estabilidade. O nanoporo de estado sólido é normalmente perfurado em uma película, esta película divide a célula fluídica em duas partes. Uma tensão polarizada é aplicada através de uma membrana fina contendo um nanoporo, resultando em corrente iônica de uma célula para outra. Moléculas de proteína incluindo estruturas dobradas e desdobradas são detectadas e analisadas por nanoporo de estado sólido. A interação de proteínas também pode ser detectada usando nanoporo de estado sólido. Além disso, tem capacidade de detectar cinética de proteínas. Para resolver limites na faixa de detecção, nanoporos de estado sólido quimicamente modificados têm sido amplamente aplicados, para detectar DNA de fita simples e proteínas.

Muitos métodos quantitativos já foram aplicados para detecção de H₂O₂, a maioria baseada em espectrometria, quimioluminescência, amperometria e eletroquímica. Métodos espectrométricos e quimioluminescência convencionais são comumente demorados e custosos. O sensor de nanoporo de estado sólido tem baixo consumo e estrutura simples, e pode ser usado para detectar pequenas moléculas.

Aqui, apresentamos um tipo de nanoporo de estado sólido modificado com peroxidase de raiz-forte (HRP). As HRPs foram imobilizadas na superfície interna do nanoporo de estado sólido, as HRPs imobilizadas permaneceram ativas em reação redox que ocorreu dentro de um único canal de nanoporo na presença de H₂O₂. O ABTS•+ produzido na reação redox agregaria, então o ABTS•+ agregado passaria pelo nanoporo. Os eventos de translocação podem ser detectados. Para detecção de peróxido de hidrogênio, a estrutura de estado sólido é simples, e pode detectar o ABTS•+ agregado usando baixo consumo de reagente. Este nanoporo de estado sólido modificado com enzimas HRP pode realizar sensoriamento de H₂O₂ indiretamente, através da detecção de ABTS•+ agregado. Tem significado instrutivo para detecção de molécula única e montagem molecular dentro de nanoporo de estado sólido.

Métodos

Químicos e Materiais

A molécula de Peroxidase de Raiz-Forte (HRP) (1mg mL⁻¹, Número da Comissão de Enzimas 1.11.1.7, 44 kDa) foi comprada da Xiya Reagent (Chengdu, China). A amostra (HRP) foi dissolvida em PBS 0.1 M filtrado a 0.02 µm, armazenada a 4 °C, e empregada dentro de dois dias da preparação. Cloreto de potássio (KCl), N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS) e 2,2'-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS, 98%) foram comprados da DiBo chemical technology co., LTD (Shanghai, China). Peróxido de hidrogênio (H₂O₂, 30%) foi comprado da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (3-Aminopropil)trietoxisilano (3-APTES) foi comprado da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Experimentos foram conduzidos usando água ultrapura de sistema de purificação Milli-Q (resistividade 18.2 MΩ/cm, 25 °C, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) e filtrada através de 0.02 µm em sistema FIB FEI Strata 201 (FEI Co., Hillsboro, OR, USA), um Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS), e um Axopatch 700B (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA). As imagens dos instrumentos usados foram adicionadas ao material suplementar.

Fabricação de Nanoporo de Estado Sólido e Medidas Elétricas

Primeiro, uma membrana fina de Si₃N₄ (100 nm espessura) foi depositada em substrato Si com 300 µm espessura. Seguido por fotolitografia (tamanho da janela aberta 500 × 500 µm²). Então, a superfície da membrana foi bombardeada com íons Ga+ usando sistema FIB FEI Strata 201 a potencial de aceleração 30 kV, enquanto a corrente foi medida como 1 pA. O tempo de fresagem foi 1.5 s sob modo spot. Finalmente, os chips de nanoporo de estado sólido foram obtidos e limpos em solução piranha preparada na hora a 80 °C por 30 min, seguido por enxágue com água ultrapura. Após limpeza, o chip foi montado em célula de Teflon customizada com dois anéis Viton para separar os dois lados do chip, formando dois reservatórios para garantir o único caminho para corrente iônica através do nanoporo. Eletrodos (Ag/AgCl) foram conectados à célula fluídica e um amplificador patch clamp (Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA) que tornou a corrente iônica mensurável sob tensões constantes, com taxa de amostragem 100 kHz para sinais. O filtro Bessel passa-baixo de oito polos interno do amplificador foi definido em 10 kHz. Todo o instrumento foi colocado em uma gaiola de Faraday dupla.

Resultados e Discussão

Imobilização de Nanoporo com HRPs

O nanoporo selecionado com diâmetro ~50nm foi imerso em solução piranha a 80 °C por 30 min. Após tratamento com solução piranha, a superfície interna do nanoporo pôde adquirir grupos hidroxila de silício. Subsequentemente, todo o filme fino foi ativado com (3-Aminopropil)trietoxisilano (3-APTES). Como resultado do tratamento com 3-APTES, grupos amino (-NH₂) foram gerados na superfície do filme.

Após ativação com 3-APTES, o chip de nanoporo foi introduzido em solução PBS 0.1 M de EDC (10 mM) e NHS (20 mM). Posteriormente, o chip de nanoporo foi introduzido à peroxidase de raiz-forte (HRP) (10 ng/ml). Segundo resultados de pesquisa prévios do nosso grupo, com diferentes concentrações de sal de 0.1 a 2 M KCl, pH 7.0, HRP não agregou. Devido ao valor pI da peroxidase de raiz-forte ser 4.3 ± 0.2, também provamos que HRP não agregou em 0.1 M KCl pH 6.0 e pH 7.0. O reagente EDC ativou os grupos carboxilo (-COOH) de HRP em um intermediário o-acilisourea altamente reativo. Além disso, o intermediário foi convertido em um éster reativo a amina succinimídico mais estável na presença de NHS. Resultando em acoplamento covalente do intermediário com os (-NH₂) gerados nas superfícies internas do nanoporo para formar ligações amida estáveis (Fig. 1).

Estes processos levam à imobilização de HRPs na superfície interna de um único nanoporo. A realização do processo de funcionalização foi confirmada medindo curvas corrente-tensão (I-V) de um único nanoporo antes e depois da modificação (Fig. 2).

Caracterização de Nanoporo de Estado Sólido Modificado com HRPs

Aqui, a forma de um único canal de nanoporo Si₃N₄ é cilíndrica. A Figura 2 mostra as curvas I-V típicas do nanoporo não modificado (original) e modificado em 0.1 M KCl, tamponado a pH 7.0 com 0.1 M PBS. Após modificar a superfície interna do nanoporo com enzimas HRP, o tamanho do poro tornou-se menor.

Segundo Wanunu et al., levando em conta a condutância externa do nanoporo, o diâmetro de nanoporo de estado sólido pode ser calculado pela equação:

$$ d=\left(1+\sqrt{1+\frac{16\sigma l}{\pi G}}\right) G/2\sigma $$ (1)

Onde, d e l são diâmetro e comprimento do poro, G é condutância de poro aberto do nanoporo, σ é condutividade da solução iônica.

Considerando efeitos geométricos, após modificação do nanoporo de estado sólido com enzimas HRP, tamanho efetivo pode ser calculado. O diâmetro de um único nanoporo pode ser calculado baseado na equação (1). Onde, o valor de condutância (G_unmodified) ~15 nS pode ser obtido das curvas I-V do nanoporo de estado sólido não modificado. A condutividade (σ) da solução iônica 0.1 M KCl (25 °C), tamponada a pH 7.0 com 0.1 M PBS é ~1.28 S/m. Portanto, o diâmetro do nanoporo não modificado é ~51 nm, similar ao diâmetro medido. Usando o mesmo método, o valor obtido de condutância (G_modified) é ~7.5 nS, e o diâmetro (~34 nm) do nanoporo modificado pode ser calculado. Redução no diâmetro é possível devido a duas razões: primeiro, tratar a superfície interna do nanoporo com 3-APTES, permitindo a superfície do nanoporo adquirir grupos amino (-NH₂). A segunda razão é que o diâmetro hidrodinâmico (D_h) da enzima HRP é ~8 nm, as HRPs imobilizadas poderiam reduzir o diâmetro do poro. Aqui, o nanoporo de estado sólido modificado com HRPs com diâmetro ~34 nm é usado como canal de detecção de peróxido de hidrogênio.

Princípio da Reação Redox

A reação redox foi conduzida dentro de um único nanoporo modificado, e o seguinte processo de reação apresentado concorda bem com a reação redox proposta. Na presença de H₂O₂ (0.5 mM), enzimas HRP imobilizadas na superfície interna do nanoporo foram convertidas em composto 1 imediatamente. Então, o composto 1 aceitou um elétron da molécula substrato redutor ABTS (1.5 mM) para gerar composto 2. Subsequentemente, o composto 2 foi reduzido de volta à enzima em repouso via transferência de um elétron de outra molécula substrato ABTS.

Os produtos catiônicos (ABTS•+) das reações redox acumularam-se no único nanoporo. A translocação de moléculas acumuladas do canal do nanoporo mudaria a condutância (G), e assim a mudança de corrente (ΔI_b) pode ser encontrada.

$$ \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{3+})\mathrm{Porp} + \mathrm{H}_2\mathrm{O}_2 \to \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{4+}=\mathrm{O})\mathrm{Porp}^{\cdot+} (\text{Composto } 1) + \mathrm{H}_2\mathrm{O} $$

$$ \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{4+}=\mathrm{O})\mathrm{Porp}^{\cdot+} + \mathrm{ABTS} \to \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{4+}=\mathrm{O})\mathrm{Porp} (\text{Composto } 2) + \mathrm{ABTS}^{\cdot+} $$

$$ \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{4+}=\mathrm{O})\mathrm{Porp} + \mathrm{ABTS} \to \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{3+})\mathrm{Porp} + \mathrm{ABTS}^{\cdot+} + \mathrm{H}_2\mathrm{O} $$

Detecção de Eventos de Translocação

Experimentos foram realizados usando nanoporos modificados com HRP com diâmetros de poro modificados (~34 nm) em 0.1 M KCl, tamponado a pH 7.0 com 0.1 M PBS. ABTS (1.5 mM) e peróxido de hidrogênio (H₂O₂) (0.5 mM) foram adicionados ao compartimento trans do nanoporo. Após adicionar ABTS e H₂O₂, experimentos usando tensões polarizadas de -100 a -800 mV foram realizados, e amostrados a 100 kHz. Não houve evento de translocação até a tensão aumentar para -400 mV. A Figura 3 mostra traços representativos de corrente iônica de eventos de translocação em diferentes tensões de -400 a -800 mV em 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0.

Eventos de bloqueio de corrente de milissegundos foram observados, conduzidos em 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0. Ao adicionar reagentes H₂O₂ e ABTS no compartimento trans, enzimas HRP imobilizadas na superfície interna de um único canal de nanoporo, e reação redox ocorreu. Abundância de moléculas ABTS•+ foram produzidas, uma única molécula menor ABTS•+ pode não ser detectada usando nosso nanoporo de estado sólido, devido à resolução do sistema. No entanto, estas moléculas agregariam após sua produção. Portanto, é possível detectar moléculas ABTS•+. Aqui, tensões negativas foram mantidas, e moléculas ABTS•+ agregadas passaram pelos nanoporos. Havia fluxo eletroforético e eletroosmótico quando tensão negativa foi aplicada. HRP era negativamente carregado em 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0, como resultado, camada elétrica dupla seria produzida, e eletroosmose seria na direção do eletrodo negativo. Devido a esta razão, eletroforese e eletroosmose foram na mesma direção. O ABTS•+ agregado no canal único de nanoporo transportaria através do nanoporo de estado sólido, fluindo na direção do eletrodo negativo.

Análise Estatística de Eventos de Translocação

Como a tensão polarizada desempenhou papel chave na translocação de ABTS•+ agregado, a influência de bloqueios de corrente de ABTS•+ agregado passando através do nanoporo modificado com HRPs versus tensões aplicadas foi discutida. A frequência de ocorrência de eventos de translocação foi grandemente melhorada com aumento de tensão (Fig. 3f). À medida que a tensão aumentava, a amplitude da corrente também aumentava. No entanto, eventos de translocação desapareceram gradualmente quando a tensão polarizada foi mantida abaixo de -300 mV, sugerindo que ABTS•+ agregado através de nanoporos modificados com HRPs precisava de tensão limiar de -300 mV. A Figura 4 mostra histogramas da amplitude média de corrente de eventos de translocação medidos para ABTS•+ agregado em diferentes tensões. Baseado nas curvas de ajuste, os valores de pico do bloqueio de corrente (ΔI_b) são 308.4 ± 27.795 pA, 419.1 ± 20.354 pA, 478.8 ± 32.857 pA, 528.1 ± 36.98 pA, 606.9 ± 40.916 pA em -400, -500, -600, -700 e -800 mV, respectivamente, é provável que a redução de corrente seja induzida por molécula ABTS•+ agregada passando pelo nanoporo em diferentes tensões. Os valores de amplitude de corrente foram ajustados com função polinomial de primeira ordem, que produz inclinação de -0.706 e intercepto de 49.262. No entanto, baseados nas curvas de ajuste, os valores de tempo de permanência são 54.5 ± 21.374 ms, 42.8 ± 20.181 ms, 10.3 ± 3.05 ms, 6.0 ± 1.744 ms, 4.0 ± 1.441 ms, em -400, -500, -600, -700 e -800 mV. A Figura 3h mostra uma função de decaimento exponencial (t_d ~ e^{-v/v0}) foi empregada para ajustar o tempo de permanência dependente das tensões aplicadas.

Os gráficos de dispersão bidimensionais de bloqueio de corrente versus tempo de permanência de eventos para cada ABTS•+ agregado em diferentes tensões foram ajustados (Fig. 5). Todos os ABTS•+ agregados mostram um agrupamento de eventos de -400 a -800 mV, os principais agrupamentos de eventos são devidos a ABTS•+ agregado passando pelo nanoporo de estado sólido modificado com HRPs.

Além disso, o evento de translocação única em cada tensão foi analisado, e o bloqueio de corrente foi induzido pela mesma substância de tamanho e carga. Então, considera-se que cada evento de translocação foi induzido pelo único ABTS•+ agregado. Para analisar o tempo de translocação de ABTS•+ agregado em nossos experimentos. A duração do bloqueio de corrente t_d é considerada como o tempo de permanência de um único ABTS•+ agregado desde o local onde foi produzido até a saída do nanoporo. Aqui, outra condição foi considerada, pode haver algumas enzimas HRP imobilizadas na entrada do nanoporo, e pode catalisar a reação redox. Portanto, outros experimentos foram conduzidos para verificar que a reação redox ocorreu na superfície interna de um único nanoporo em vez da entrada. Para verificação, nanoporos não modificados por HRPs foram aplicados e analisados. Estes nanoporos foram ativados com 3-APTES. E a mesma concentração de HRPs (10 ng/ml), ABTS (1.5 mM) e H₂O₂ (0.5 mM) foram adicionados ao compartimento trans do nanoporo, tensão polarizada negativa foi aplicada em 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0, devido à força eletroforética, HRPs foram incapazes de passar pelo nanoporo. Devido à reação redox, ABTS•+ agregado produziu, mas não foram encontrados eventos de translocação. É possível que o ABTS•+ agregado cause efeito eletrostático com HRPs e impeça o ABTS•+ agregado de passar pelo nanoporo.

A Figura 6 mostra os gráficos de dispersão bidimensionais da mudança de condutância (ΔG) versus tempo de permanência de eventos para cada ABTS•+ agregado em diferentes tensões. Pode-se encontrar que a mudança de condutância (ΔG) concentra-se principalmente em 0.8 nS. A forma dos eventos de translocação são quase os mesmos. O valor médio de ΔG é ~0.8 nS em diferentes tensões. Pode-se especular que a exclusão de volume de cada molécula ABTS•+ agregada é quase a mesma. É possível que efeitos eletrostáticos e estéricos de moléculas ABTS•+ agregadas possam mudar a corrente iônica. Após análise, duas formas típicas de traços de corrente com translocação de ABTS•+ agregado carregado positivamente foram observadas (Fig. 7). Os eventos de translocação a -700 mV como representativo. A porcentagem de dois tipos de eventos foi analisada, e pode-se observar que a porcentagem de eventos tipo 1 aumentou com aumento de tensão, por outro lado, a porcentagem de eventos tipo 2 diminuiu. Considerou-se que tensão mais alta torna a translocação mais rápida que tensão mais baixa.

Os sinais de bloqueio de corrente revelaram tamanho, conformação e interação de ABTS•+ agregado passando pelo canal único de nanoporo. Para a mudança na forma da corrente, o processo das mudanças foi especulado. Para evento 1, sinais de corrente têm parte de flutuação típica com intensidade profunda e curto tempo de permanência. É possível que o ABTS•+ agregado passou pelo nanoporo do local onde é produzido. Quando o ABTS•+ agregado passou pelo nanoporo, a corrente iônica do nanoporo restaurou ao nível original (Baseline) (I_0). Para evento 2, sinais de corrente têm parte de flutuação com intensidade profunda e então têm um estágio horizontal. Esta forma de sinais pode ser atribuída à interação eletrostática de ABTS•+ agregado com HRPs na saída do nanoporo, e a corrente recuperou lentamente ao baseline. Para melhor entendimento da mudança de corrente, precisamos começar com a mudança de condutância de poro aberto (G_pore) na concentração de sal (0.1 M KCl). Como discutido em estudos anteriores, uma equação da condutância de poro aberto de um nanoporo carregado negativamente com diâmetro d e comprimento l em baixa concentração de sal pode ser descrita como

$$ G_{pore}=\frac{\pi d^2_{pore}}{4 l_{pore}}\left[\left(\mu_{K^+}+\mu_{Cl^-}\right)n_{KCl}\cdot e+\mu_K\frac{4\sigma_p}{d_{pore}}\right] $$ (2)

onde μ_K+ e μ_Cl- são mobilidades eletroforéticas de K+ e Cl-, n_KCl é densidade numérica de K+ e Cl-, carga elementar é e, σ_p é densidade de carga superficial das superfícies do nanoporo. Neste experimento, o nanoporo de estado sólido foi quimicamente modificado, e diâmetro do nanoporo foi alterado. A densidade de carga superficial da superfície do nanoporo (σ_p) não pode ser obtida exatamente. Portanto, a condutância de poro aberto (G_pore) foi calculada baseada na equação (1). Devido à equação (1), a condutância de poro aberto (G_pore) é ~7.5 nS. Especula-se que a mudança de condutância pode ser atribuída a duas razões. A primeira razão é que, a exclusão de volume de íons no nanoporo foi ocupada pelas moléculas ABTS•+ agregadas. Como resultado, a condutância do nanoporo de estado sólido diminuiu (ΔG^-). A segunda razão é que, alguns íons foram trazidos do nanoporo pelas moléculas ABTS•+ agregadas, o que aumentou a condutância do nanoporo de estado sólido. Nestes experimentos, ABTS•+ produziu-se dentro do nanoporo, e nenhum íon foi trazido. Portanto, a mudança na condutância do nanoporo de estado sólido (ΔG) foi induzida apenas pela exclusão de volume. Assim, a mudança total de condutância pode ser descrita como

$$ \Delta G=\Delta G^{-} $$ (3)

A diminuição na condutância do nanoporo de estado sólido é induzida pela exclusão de volume e pode ser calculada pela equação

$$ \Delta G^{-}=\sigma \frac{\gamma \Lambda}{(l+0.8 d)^2} $$ (4)

onde γ é fator de forma da partícula que é razão de áreas de superfície da mesma esfera de volume e a partícula. Neste trabalho, a molécula ABTS•+ agregada foi simplificada a um objeto globular, portanto o valor de γ é 1 e Λ é a exclusão de volume. A condutividade da solução bulk σ é 1.28 S/m, 0.1 M KCl (25 °C).

Para a exclusão de volume (Λ), podemos deduzir dos eventos de translocação de algumas outras moléculas. Para conectar a mudança de condutância (ΔG) à propriedade física das moléculas, a Lei de Ohm pode ser aplicada à mudança de volume de solução eletrolítica baseada no nanoporo de estado sólido. Quando um evento de translocação de uma molécula em um nanoporo de estado sólido cilíndrico, a corrente diminui instantaneamente. Quando a resistência do nanoporo de estado sólido é a resistência do circuito total, a mudança de condutância (ΔG) pode ser descrita pela equação

$$ \Delta G(t)=-G_{pore}\frac{\Lambda(t)}{H_{eff}A_p}\left[1+f\left(d_m/D_p,l_m/H_{eff}\right)\right] $$ (5)

Nesta equação, A_p H_eff = V_p é o volume do nanoporo de estado sólido, f(d_m/D_p, l_m/H_eff) é fator de correção (ignorou efeito de carga superficial), em nossos experimentos, simplificamos a molécula ABTS•+ agregada a um objeto globular; portanto, o fator de correção é 1. A razão d_m/D_p é razão de diâmetro molecular e diâmetro do nanoporo, A razão l_m/H_eff é razão de comprimento efetivo molecular e comprimento efetivo do nanoporo. A expressão (5) pode ser simplificada como

$$ \Delta G/G_{pore}\approx \Lambda/V_p $$ (6)

O valor médio de condutância (G_pore) foi analisado dos eventos de translocação. Da equação (5), o valor médio de exclusão de volume (Λ) em diferentes tensões (-400, -500, -600, -700, -800 mV) pode ser obtido. Enquanto isso, o tamanho do nanoporo usado é conhecido, o volume do nanoporo (V_p) é ~90746 nm³. Devido à equação (4), o valor de mudança de condutância (ΔG^-) pode ser calculado como ~0.6 nS. O valor médio de mudança de condutância obtido dos experimentos de eventos de translocação em diferentes tensões (-400, -500, -600, -700, -800 mV) é ~0.784 nS. Pode-se encontrar que o valor calculado é próximo ao valor experimental.

Em investigações anteriores, moléculas de peróxido de hidrogênio foram detectadas com diferentes tecnologias. Mas, detectar peróxido de hidrogênio por nanocanal é raro. Tan et al. diferenciaram sinais de eventos díspares quando HRPs passaram pelo nanoporo, havia ABTS e H₂O₂ em solução KCl. Os diferentes sinais de tipo com translocação de HRPs foram considerados como ABTS•+ passando pelo nanoporo. Seis eventos típicos de translocação do produto de catálise enzimática de substratos foram analisados. Eles especularam o processo provável de cada tipo. No entanto, não há evidências suficientes para testificar. Mubarak Ali et al. realizaram detecção de produtos de reação redox dentro de nano-canais cônicos únicos. Eles encontraram que o radical catiônico ABTS•+ reduziu a corrente iônica no nano-canal HRP de maneira dependente de tensão, consistente com concentrações dependentes de tensão de íons em nano-canais cônicos. A magnitude do bloqueio de corrente correlacionou-se com a concentração de H₂O₂ na solução.

Conclusões

Em conclusão, fabricamos um nanoporo Si₃N₄ empregando FIB com sucesso, um sistema de nano-poro único cuja superfície foi modificada com enzimas HRP ligadas covalentemente. O efeito das enzimas HRP imobilizadas em um único nanoporo de estado sólido como sensor de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) foi afirmado investigando produtos (ABTS•+) das reações redox ocorrendo na presença dos substratos H₂O₂ e ABTS. O radical catiônico ABTS•+ agregado produzido dentro do nanoporo de estado sólido e reduziu a corrente iônica no nanoporo de estado sólido modificado com HRPs, são consistentes com dependência de tensão. As tendências de bloqueio de corrente mostraram dependência linear para tensões polarizadas aplicadas. A relação entre tempo de permanência versus tensão polarizada aplicada foi decaimento exponencial (t_d ~ e^{-v/v0}). Enquanto isso, o ABTS•+ agregado passou pelos nanoporos modificados com HRPs precisou de tensão limiar de -300 mV. A mudança de condutância (ΔG) foi calculada analiticamente e comparada aos valores experimentais medidos. Os eventos de translocação foram produzidos pelo ABTS•+ agregado catiônico de tamanho certo. Esperamos que usando nanoporos de estado sólido permitirá baixar o limite de detecção e melhorar a sensibilidade do sistema. Para nosso sistema de nanoporo de estado sólido, a estrutura é simples; não é suscetível a contaminação e pode ser usado múltiplas vezes.

Abreviações

3-APTES:

(3-Aminopropil)trietoxisilano

ABTS:

3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico

EDC:

N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida

FIB:

Feixe de íons focalizado

HRP:

Peroxidase de raiz-forte

KCl:

Cloreto de potássio

NHS:

N-hidroxisuccinimida

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

SNR:

Relação sinal-ruído