Efeito do Nano-SiO2 na expressão e metilação aberrante de genes impressos no pulmão e testículo

Resumo

A nanotecnologia tem se desenvolvido rapidamente e agora é usada em muitas terapias médicas de ponta. No entanto, existe uma preocupação crescente de que a exposição a nanopartículas (NPs) pode induzir diferentes doenças sistêmicas, pois os mecanismos epigenéticos estão associados a cada vez mais doenças. O papel da modificação epigenômica do NP é importante para a etiologia da doença. Nosso estudo teve como objetivo determinar os mecanismos epigenéticos de danos nas células do pulmão e testículo, expondo as células a SiO ₂ NPs. Usamos camundongos machos C57BL / 6 para caracterizar o efeito prejudicial de SiO ₂ NPs em células de pulmão e testículo, bem como o estado de metilação resultante na região de domínio Dlk1 / Dio3 impressa. As células A549 expostas a SiO ₂ NPs tiveram apoptose celular e camundongos machos expostos a SiO ₂ NPs tinham tecidos alterados de pulmão e testículo. Os genes nos domínios impressos na região Dlk1 / Dio3 mudaram em ambos os tecidos; Dlk1 , Rtl1 e Dio3 são regulados positivamente no testículo enquanto Dlk1 e Dio3 também são regulados positivamente nos tecidos pulmonares. A PCR de sequenciamento de bissulfito do pulmão e testículo de adultos masculinos estava em sua maioria hipometilada, com alguns CpGs hipermetilados. Essas descobertas indicam que as nanopartículas desempenham um papel importante na metilação do DNA de genes impressos.

Histórico

O dióxido de silício é um óxido de silício com a fórmula química SiO ₂ , mais comumente encontrado na natureza como quartzo e em vários ambientes orgânicos [1]. Nanopartículas projetadas têm sido amplamente difundidas no rápido crescimento e aplicação da nanotecnologia em indústrias de alta tecnologia. Esta nanopartícula em particular é amplamente utilizada em uma variedade de produtos de consumo, incluindo eletrônicos, produtos plásticos, médicos, cosméticos e materiais de revestimento devido às suas propriedades físicas e científicas, como grande área de superfície específica, locais reativos abundantes, alta energia de superfície, ligações químicas insaturadas, forte capacidade de adsorção e forte tendência a interagir com metais e matéria orgânica, alterando os contaminantes e seu transporte no meio ambiente [2]. A presença de SiO ₂ nanopartículas (NPs) em uma ampla gama de consumíveis aumentam sua probabilidade de serem liberadas no meio ambiente e entrarem em contato com a população humana.

Estudos experimentais anteriores demonstraram que uma instilação intratraqueal de dose única ou múltiplas injeções intraperitoneais de uma espécie de nanopartícula de metal e óxido de metal causam efeitos tóxicos de níveis celulares a sistêmicos e organísmicos [3]. Tratamento de SiO ₂ NPs reprime o crescimento de linhas de células de câncer de mama, aumentando a apoptose e reduzindo a motilidade celular. Além disso, a exposição ao SiO ₂ NPs perturbam significativamente o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) [4]. Quando os modelos de ratos foram tratados com três tamanhos diferentes de TiO ₂ NPs e em comparação com os controles, o tratamento com fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) com aerossóis de grande aglomerado (> 100 nm) induziu uma resposta inflamatória aguda, enquanto aerossóis de pequeno aglomerado (<100 nm) produziram dano de estresse oxidativo significativo e citotoxicidade [5].

O estudo da toxicidade das nanopartículas na reprodução é um campo crescente. Um estudo demonstrou que sob a mesma dose de tratamento, Ni NPs induziram maior toxicidade reprodutiva em C. elegans do que Ni MPs (micropartículas). Estas toxicidades reprodutivas observadas em C. elegans incluiu tamanho reduzido da ninhada, ovo fertilizado e ativação de espermatídeos [6]. Há evidências crescentes de que certos efeitos ambientais podem ser transmitidos aos descendentes por meio de vias paternas, sem alterações no genoma do esperma [7, 8]. A informação paterna existe não apenas no genoma, mas também em marcadores epigenéticos específicos relacionados, conteúdo de mRNA e RNA não codificador.

O estresse oxidativo é um mecanismo importante na toxicidade das nanopartículas, que pode desencadear danos ao DNA, inflamação, desnaturação de proteínas e peroxidação lipídica [9]. Esses efeitos biológicos são influenciados pelas propriedades físico-químicas das nanopartículas, incluindo seu tamanho, área de superfície, forma, química de superfície, funcionalização e solubilidade [10, 11]. Há evidências crescentes que demonstram claramente que a exposição a nanopartículas pode desencadear alterações epigenéticas em tecidos e células, mesmo em baixas doses não citotóxicas [12, 13]. Epigenética é o estudo de mudanças hereditárias na função do gene que não envolvem mudanças na sequência do DNA, incluindo metilação do DNA, impressão do gene, modificações de histonas e regulação por RNAs não codificantes [14]. Essas alterações epigenéticas estão associadas ao desenvolvimento e progressão de numerosos estados patológicos e doenças [15]. Portanto, os efeitos epigenéticos são uma parte crucial da triagem de avaliação de risco do paciente no nível celular.

O domínio impresso Dlk1 / Dio3 contém três regiões diferencialmente metiladas conhecidas (DMRs) que são paternalmente metiladas:DMR intergênica (IG-DMR), 3-DMR expresso maternalmente (Gtl2-DMR) e Dlk1-DMR [16]. Estudos anteriores sugerem que o IG-DMR dita o status de metilação alélica do Gtl2 promotor DMR, que então controla a expressão gênica em todo o cluster [17]. O genoma do camundongo tem um grande número de genes impressos no domínio Dlk1 / Dio3 na região distal do cromossomo 12. O IG-DMR localizado entre o gene impresso Dlk1 e Gtl2 é especificamente metilado na linha germinal masculina e regula a expressão específica do alelo parental da região do gene impresso [18]. O status de metilação IG-DMR é estabelecido antes do nascimento e, portanto, é mantido ao longo da vida de um homem na linha germinativa masculina durante a diferenciação de células germinativas masculinas, o que significa que a metilação IG-DMR é mantida em espermatogônias e espermatócitos de testículos maduros.

Nosso objetivo foi encontrar as mudanças na expressão gênica da linha germinativa masculina durante a espermatogênese antes do silenciamento transcricional e translacional, a fim de explicar a influência paterna na prole por meio das mudanças ambientais. Fatores ambientais podem modificar as modificações transcricionais dos espermatozoides, o que pode levar a alterações no desenvolvimento da progênie. Para realizar esta investigação em nosso trabalho, usamos linhagens celulares e camundongos como modelos para a triagem dos efeitos tóxicos do SiO ₂ NPs. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo que demonstra os mecanismos epigenéticos das regiões impressas de Dlk1 / Dio3 que as nanopartículas causam danos nos tecidos do pulmão e testículo.

Métodos

Animal Experimental

O manejo dos animais foi realizado de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório sob o protocolo de uso de animais correspondente na Universidade Médica de Nanjing. Os ratinhos foram obtidos de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Todos os animais foram alojados a 23 ° C com um ciclo de luz de 12 horas. Água esterilizada e ração para roedores foram consumidos pelos camundongos à vontade. A atividade e o comportamento dos camundongos foram monitorados diariamente. Após 2 semanas, os camundongos foram injetados com SiO de tamanho nanométrico ₂ 12,5 mg / kg.

Químicos

SiO nanodimensionado ₂ (99,5% de traços de base de metal, tamanho de partícula de 10–20 nm) foram obtidos da Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). As nanopartículas foram suspensas em meio RPMI 1640 para criar uma solução estoque, dispersas por vibração ultrassônica por 20 min, diluídas em concentrações adequadas e dispersas por mais 20 min.

Características do SiO ₂ NPs

O tamanho e o potencial zeta foram registrados usando um Malvern Zetasizer Nano ZSP.

Extração de RNA e qRT-PCR

As amostras de pulmão e testículos foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e então armazenadas a 80 ° C após cerca de 4 h. Nós descongelamos as amostras antes de extraí-las.

O RNA total foi isolado das amostras utilizando 1 mL de TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies Co, EUA). A mistura foi submetida a ultra-sons a 80% de potência durante 5 min, adicionou-se 0,2 mL de clorofórmio e, em seguida, foi centrifugada a 12.000 g / min a 4 ° C durante 15 min. Em seguida, três etapas de purificação de fenol / clorofórmio foram adicionadas para se livrar das proteínas. Em seguida, usamos a absorbância de UV para medir o conteúdo de RNA e a qualidade de cada amostra em 260 e 280 nm. As sequências de primer de mRNAs são mostradas no arquivo adicional 1:Tabela S1 e S2. qRT-PCR foi realizado usando as instruções do fabricante, conforme descrito anteriormente [19]. A PCR em tempo real foi realizada usando SYBR Green (Vazyme). O ciclo de PCR foi o seguinte:desnaturação inicial a 95 ° C por 30 s, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 15 s, anelamento a 60 ° C por 15 s e extensão a 72 ° C por 30 s. A quantidade de genes alvo foi analisada usando o método 2 ^ -ΔCt após normalização com β-actina.

Extração de DNA, tratamento com bissulfito e PCR de sequenciamento com bissulfito

O DNA foi isolado de tecidos testiculares e pulmonares usando um kit de DNA (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. No.51304; EUA) seguindo as recomendações do fabricante. A conversão bissulfito de 500 ng de todo o DNA genômico foi obtida usando um kit (kit EpiTect® Bisulfite; Qiagen. No. 59104; EUA) seguindo as recomendações do fabricante. Diferentes oligonucleotídeos de metilação CpG foram projetados usando software Methyl Primer Express v1.0 e as sequências são P1-F 5′-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3 ′, P1-R 5′-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3 ′; P2-F 5′-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3 ′, P2-R 5′-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3 ′; P3-F 5′- TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTTT-3 ′, P3-R 5′- ACCCATAACAAACCACAACA-3 ′; P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3 ′, P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3 ′.

Cada amostra de DNA foi amplificada por PCR da seguinte forma:2,5 μl 10 × PCR de tampão de PCR, mistura de reação com 500 ng de DNA tratado com bissulfito, 0,5 μl de cada um dos primers diretos e reversos, 0,5 μl dNTP Mix, 0,5 μl rTaq (500 U, dNTP , Mg ²⁺ ) (Takara Bio, Tóquio, Japão), adição de ddH ₂ O até um volume de 25 μl. Após ativação da polimerase a 94 ° C por 10 min, foi seguido por 40 ciclos da seguinte sequência:30 s a 94 ° C, 30 s a 58 ° C, 1 min a 72 ° C e extensão final a 72 ° C por 10 min.

Cultura de células e tratamento

As células A549 foram adquiridas da ATCC (Manassas, VA, EUA) e foram cultivadas em 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C e 5% de CO ₂ em uma incubadora umidificada. As células foram semeadas em placas de 96 poços, incubadas com diferentes concentrações de SiO ₂ NPs:62,5, 125, 250, 500, 1000 e 2000 μg / ml por 24 h.

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de proliferação de CCK8. As células foram plaqueadas a uma densidade de 1,5 × 10 ⁴ por poço em uma placa de 96 poços e incubado durante a noite. Após a exposição ao SiO ₂ NPs em diferentes concentrações, 100 μl de CCK8 foram adicionados a cada poço e as células foram incubadas por 30 min a 37 ° C para permitir o metabolismo de CCK8. Por fim, a absorbância foi determinada a 450 nm. As taxas de inibição de células foram calculadas e transformadas em IC ₅₀ usando SPSS 15.0.

Análise estatística

Todos os cálculos foram realizados com o software SPSS 15.0. As comparações entre os grupos foram feitas usando t não relacionados testes e um teste do qui-quadrado de Pearson para BSP. Os dados são apresentados como média ± DP. Em todos os casos, um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Caracterização de SiO ₂ NPs

Nós caracterizamos SiO ₂ NPs em condições experimentais. O raio hidrodinâmico médio e o potencial zeta de SiO ₂ NPs em meio de cultura foram 371,77 ± 18,46 nm e 18,83 ± 2,12 mV, respectivamente (Fig. 1).

Caracterização de SiO ₂ NPs em suspensão. As partículas foram suspensas em meio de cultura de células com FBS a 10%. a, b Tamanho e potencial zeta de SiO ₂ Os NPs foram avaliados pelo Zetasizer Nano ZSP. c A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio CCK8 após exposição a várias concentrações de SiO ₂ NPs por 24 h. Médias ± DP de experimentos duplicados, cada um consistindo em três repetições técnicas. *** p <0,001

Efeito de SiO ₂ NPs na linha celular A549

Para determinar a toxicidade de SiO ₂ NPs, realizamos um teste de proliferação com células A549, para determinar o IC ₅₀ de SiO ₂ NPs em células A549. Conforme ilustrado na Fig. 1c, SiO ₂ NPs diminuem a viabilidade das células A549 de uma maneira dependente da concentração. A redução na viabilidade celular é significativa em SiO ₂ Concentração de NP superior a 62,5 μg / ml ( p <0,001). O IC ₅₀ 24 h de um produto químico é definido como uma concentração que afeta 50% da célula após 24 h de exposição. O IC ₅₀ 24 h determinado para SiO ₂ NPs foi de 4942 μg / ml.

Efeitos do SiO ₂ NPs em pulmão e testículo de murino

Determinamos se a exposição ao SiO ₂ NPs na dose de 12,5 mg / kg de peso corporal levariam a danos à membrana pulmonar e até mesmo a danos aos testículos em nosso modelo de camundongo. Conforme mostrado nas figuras, SiO ₂ A exposição a NP levou à ruptura do corpo lamelar em cortes histológicos do pulmão (Fig. 2a, b) e lesão das cristas mitocondriais em comparação com o grupo de controle no testículo (Fig. 2c, d). Em seguida, investigamos os efeitos do SiO nos pulmões e testículos ₂ NPs na ativação de imprinting na região impressa Dlk1 / Dio3.

Imagens TEM de tecidos de pulmão e testículo de ratos expostos a SiO ₂ NPs. a A morfologia foi avaliada em tecidos pulmonares por MEV em controles. b A morfologia foi avaliada em tecidos pulmonares por SEM no grupo tratado. c A morfologia foi avaliada em tecidos testiculares por MEV em controles. d A morfologia foi avaliada em tecidos testiculares por MEV no grupo tratado. Barras de escala representam 2,0 μm

Expressão dos genes impressos no pulmão e testículo de murino

Para ilustrar as mudanças no pulmão e testículos, detectamos os genes impressos nesses tecidos. Nós escolhemos os 24 genes impressos; eles eram Dio3 , Ddc , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , H19 , Igf2, Igf2as , Igf2r , Inpp5f , Magel2 , Magi2 , Mest , Mir296 , Mir298 , Ndn , Nnat , Peg10 , Plagl1 , Pwcr1 , Rasgrf1 , Rtl1 , Snrpn e Snurf. Treze desses genes são expressos em ambos os pulmões e testículos: Dio3 , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , Igf2r , Igf2 , Inpp5f , Peg10, Ndn , Nnat , Rasgrf1 , Rtl1 e Snrpn (Fig. 3a, b). Os genes diferencialmente expressos de foco primário estavam na região impressa Dlk1 / Dio3, que contém Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 e Dio3 .

Expressão de genes impressos no pulmão e testículos. a A expressão de genes impressos no pulmão. b A expressão de genes impressos no testículo. * P <0,05. ** P <0,01. t do aluno teste

Expressão da região impressa Dlk1 / Dio3

A região Dlk1 / Dio3 impressa contém três genes codificadores de proteínas ( Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 e Dio3 ) no alelo herdado [20] (Fig. 4c). Para elucidar o papel da região Dlk1 / Dio3 na resposta do tecido do pulmão e testículo ao SiO ₂ No tratamento NP, analisamos o padrão de metilação do DMR em comparação com os controles. Diferentes genes são direcionados pela metilação no pulmão e nos testículos. A expressão do Dlk1 e Dio3 foram regulados positivamente nos pulmões e testículos, enquanto Rtl1 foi regulado positivamente apenas no testículo (Fig. 4a, b).

A expressão da região impressa Dlk1 / Dio3. a Os genes da região Dlk1 / Dio3 expressos no pulmão. b Os genes da região Dlk1 / Dio3 expressos nos testículos. c Esquema da região Dlk1 / Dio3. * P <0,05. ** P <0,01. t do aluno teste

A Metilação das Regiões DMR Dlk1 / Dio3

Para investigar se a expressão dos genes muda em resposta à metilação do DNA, abordamos o estado de metilação dessa região no pulmão e testículo de camundongo. Na análise de metilação do DNA, determinamos as sequências das três seções das ilhas CpG. No testículo, eles são hipometilados; entretanto, na ilha CpG 1, eles são significativamente hipermetilados (Fig. 5). No pulmão, toda a metilação é a mesma que no testículo, enquanto a ilha CpG 2 apresentou hipermetilação (Fig. 6).

A metilação das regiões Dlk1 / Dio3 DMR nos testículos. a A metilação da ilha CpG 1 nos tecidos controle e tratados. b A metilação da ilha 2 de CpG nos tecidos controle e tratados. c A metilação da ilha CpG 3 nos tecidos controle e tratados

A metilação das regiões Dlk1 / Dio3 DMR no pulmão. a A metilação da ilha CpG 1 nos tecidos controle e tratados. b A metilação da ilha 2 de CpG nos tecidos controle e tratados. c A metilação da ilha CpG 3 nos tecidos controle e tratados

Discussão

O uso crescente de nanomateriais tem levantado preocupações sobre os impactos potenciais sobre a saúde humana e os impactos ambientais. Estudos anteriores demonstraram que SiO ₂ NPs podem causar dano pulmonar e cardiovascular, como inflamação pulmonar e dano isquêmico do miocárdio em ratos idosos [21]. Além disso, as nanopartículas podem ter um efeito sobre as linhas germinativas, uma vez que tais células pareceram ser mais sensíveis aos efeitos tóxicos de Ag NPs e demonstraram efeitos adversos após a exposição a doses mais baixas. A exposição a Ag NP aumentou o número de anormalidades observadas nas células espermáticas de ratos e reduziu a integridade tanto do acrossoma quanto da membrana plasmática, além de reduzir a atividade mitocondrial [22]. Nossa investigação faz parte de uma série de estudos utilizando uma plataforma experimental para avaliar o potencial das nanopartículas em atingir organismos machos e até mesmo seus descendentes não expostos.

Em nosso estudo in vitro anterior, relatamos que a exposição de curto prazo a algumas nanopartículas resulta em apoptose celular e expressão aberrante de genes impressos em células TM-4 Sertoli. Esses achados demonstram que a expressão anormal de genes impressos pode ser um mecanismo subjacente para que as nanopartículas induzam a toxicidade na reprodução [23]. Além disso, em nosso estudo in vivo anterior, alguns fatores ambientais, como desreguladores endócrinos, também promovem um fenótipo ou estado de doença não apenas no indivíduo exposto, mas também em gerações sucessivas de progênie. Epimutações na linha germinativa que se tornam permanentemente programadas podem permitir a transmissão de fenótipos transgeracionais epigenéticos [19]. O objetivo deste estudo foi investigar as alterações feitas no estado epigenético por SiO ₂ Tratamento de NP em um modelo murino para estabelecer as bases mecanicistas dos efeitos transgeracionais masculinos.

Estado epigenético é um termo usado para definir modificações químicas que ocorrem dentro de um genoma sem alterar a sequência de DNA [24]. Mecanismos epigenéticos, incluindo metilação de DNA, genes impressos, modificações de histonas e expressão de RNA não codificante, podem afetar a função genômica em um ambiente exógeno [25]. Até onde sabemos, nosso estudo é o primeiro a investigar SiO ₂ NPs que induzem toxicidade pulmonar e testicular em nível epigenético.

Examinamos primeiro a toxicidade aguda do SiO ₂ NPs em células A549, uma linha de células epiteliais de pulmão humano. No entanto, nossos resultados em camundongos experimentais revelaram lesão em células epiteliais do pulmão laminar tipo II e lesão da crista mitocondrial testicular após contato com SiO ₂ NPs em concentrações ambientais [26]. Para entender melhor o mecanismo da patologia do pulmão e testículo, expressamos genes impressos. Impressão genômica refere-se ao silenciamento de um alelo parental em zigotos de gametas, dependendo do pai de origem; esse silenciamento ocorre por meio de processos epigenéticos, como metilação do DNA e / ou modificação da histona [27]. Estudos anteriores demonstraram que a expressão gênica impressa no domínio Dlk1 / Dio3 é importante para o crescimento fetal [28], o momento da puberdade humana [29] e a suscetibilidade a doenças metabólicas [30]. Estudos sugeriram que o IG-DMR dita o estado de metilação alélica do promotor Gtl2 DMR, que então controla a expressão do gene em toda a região Dlk1 / Dio3 [17]. A principal função desta região de controle impressa é herdar a metilação do DNA conduzida pelas células germinativas como um sinal gamético e, posteriormente, manter os padrões de metilação do DNA específicos de alelo subsequentes dentro das células somáticas [31]. Nosso estudo demonstrou que SiO ₂ NPs induzem alterações na expressão da região Dlk1 / Dio3 tanto nos tecidos do pulmão quanto nos testículos. Na região Dlk1 / Dio3, os genes paternos expressos ( Dlk1 , Rtl1 e Dio3 ) são particularmente anormais em comparação com os controles após o tratamento com NP. Os resultados do sequenciamento do bissulfito exibem diferentes níveis de hipometilação no pulmão e testículo. O estado de metilação do IG-DMR é geralmente menor nos tecidos tratados, e essa hipometilação pode representar o mecanismo de expressão diferencial de genes impressos.

Conclusões

Em conclusão, nossos resultados indicam que SiO ₂ A exposição a NP pode induzir mudanças importantes na metilação do DNA que desencadeiam danos celulares e que essas mudanças são altamente importantes para a expressão do agrupamento de genes impressos Dlk1 / Dio3. É importante ressaltar que as mudanças na metilação do DNA afetam os tecidos do pulmão e do testículo. Esses resultados desempenham um papel importante em nossas pesquisas futuras, examinando os efeitos epigenômicos das nanopartículas herdadas por descendentes de modelos expostos e no esclarecimento dos mecanismos moleculares que medeiam tais alterações epigenéticas.