Nanopartículas de FePO4 biocompatíveis:entrega de drogas, estabilização de RNA e atividade funcional

Resumo

FePO ₄ NPs são de interesse especial na fortificação de alimentos e imagens biomédicas por causa de sua biocompatibilidade, alta biodisponibilidade, propriedade magnética e desempenho sensorial superior que não causam efeitos organolépticos adversos. Estas características também são desejáveis na administração de drogas. Aqui, exploramos o FePO ₄ nanopartículas como um veículo de entrega para a droga anticâncer, doxorrubicina, com uma carga ideal de droga de 26,81% ± 1,0%. Este carregamento reforça ainda mais a formação de Fe ³⁺ Complexo de doxorrubicina resultando na formação de FePO ₄ Nanopartículas -DOX. FePO ₄ As nanopartículas -DOX mostraram uma boa homogeneidade de tamanho e biocompatibilidade dependente da concentração, com biocompatibilidade acima de 70% até a concentração de 80 µg / mL. É importante ressaltar que a análise de citotoxicidade mostrou que Fe ³⁺ complexação com DOX em FePO ₄ -DOX NPs aumentaram a citotoxicidade em cerca de 10 vezes do que DOX livre e melhoraram a seletividade em relação às células cancerosas. Além disso, FePO ₄ Os NPs estabilizam a temperatura do RNA e apóiam a atividade de tradução do mRNA, mostrando promessas para os agentes estabilizadores de RNA. Os resultados mostram a biocompatibilidade de nanopartículas inorgânicas à base de ferro, sua carga de drogas e RNA, estabilização e atividade de entrega com ramificações potenciais para fortificação de alimentos e entrega de drogas / RNA.

Introdução

Entre várias nanopartículas inorgânicas, como ouro, sílica e pontos quânticos, as nanopartículas à base de ferro (Fe-NPs) são amplamente exploradas para aplicações biomédicas, como agentes de contraste, veículos de entrega de drogas e terapêuticas com base térmica [1,2,3]. Devido à propriedade magnética, alta bio-adaptabilidade e conhecido metabolismo endógeno do ferro, Fe-NPs são candidatos desejáveis para aplicações biomédicas. Como tal, Fe-NPs constituem a maioria da nanomedicina inorgânica aprovada pela FDA [1, 2]. Estes incluem INFeD, DexFerrum, Ferrlecit, Venofer, Feraheme e Injectafer que estão comercialmente disponíveis para sua aplicação na anemia por deficiência de ferro e deficiência de ferro na doença renal crônica [1]. Da mesma forma, a administração intravenosa de gluconato de ferro quelato é uma intervenção bem tolerada para anemia [4]. A anemia é uma das deficiências nutricionais mais prevalentes no mundo e nanopartículas à base de Fe como FePO ₄ e FeSO ₄ tem sido usado na fortificação de alimentos para prevenir a anemia. A fortificação de alimentos é o processo de adição de micronutrientes aos alimentos com o objetivo de superar a deficiência nutricional de uma população [5]. FePO ₄ NPs são de interesse especial na fortificação de alimentos por causa de sua biocompatibilidade, alta biodisponibilidade e desempenho sensorial superior que não causa efeitos organolépticos adversos [6,7,8,9]. Perfecto et al. demonstraram o FePO ₄ A internalização de NPs em células intestinais humanas ocorre principalmente através do transportador de metal divalente-1 (DMT-1) e, portanto, pode ser prontamente absorvido [9, 10]. Feridex® e Revosit® à base de ferro são agentes de contraste de imagem por ressonância magnética (MRI) amplamente usados para ressonância magnética com contraste [11,12,13,14,15,16]. À luz desses excelentes relatórios, FePO ₄ NPs se apresentam como um bom veículo de entrega. Aqui, exploramos o FePO ₄ como um veículo de entrega de drogas carregando uma droga anticâncer, doxorrubicina (DOX). Íon férrico (Fe ³⁺ ) pode formar complexo com a molécula DOX facilitada pela interação eletrostática entre Fe deficiente em elétrons em FePO ₄ e grupo –OH rico em elétrons em DOX para formar FePO ₄ carregado com DOX NPs:FePO ₄ -DOX NPs. Avaliamos as propriedades físico-químicas do FePO ₄ e FePO ₄ -DOX NPs e avaliaram sua biocompatibilidade e perfil de citotoxicidade, respectivamente, em osteossarcoma de camundongo K7M2 e linha de células de fibroblastos NIH / 3T3.

Junto com isso, a nanopartícula inorgânica tem mostrado promessas na estabilização e entrega de ácido nucleico [17,18,19]. Nesse sentido, a nanopartícula de ouro tem sido amplamente estudada devido à sua capacidade de imobilizar oligonucleotídeos em sua superfície resultando na prevenção da agregação e degradação molecular [17, 20]. No entanto, o ouro não é um elemento endógeno e, portanto, pode limitar sua aplicação translacional. Aqui, nanopartículas à base de Fe como FePO ₄ nanopartículas podem ser de interesse primordial para o estudo de estabilização de RNA por causa de sua natureza endógena e perfil de biocompatibilidade estabelecido. Há dois mecanismos propostos de interação de ácido nucleico (RNA / DNA) com Fe-NPs para a estabilização - (1) formação de ligações de hidrogênio e interação eletrostática entre o grupo fosfato da estrutura do ácido nucleico e Fe-NPs resultando na adsorção de nucleicos ácido em Fe-NPs, e (2) ácido nucléico pode adsorver à superfície Fe-NPs via interação de pares de bases de nucleotídeos [19, 21, 22]. Um estudo mostrou o potencial das nanopartículas de fosfato de cálcio para a estabilização e entrega de vacinas de DNA [23]. A este respeito, exploramos aqui a estabilização de RNA e a atividade funcional de outra nanopartícula à base de fosfato, FePO ₄ , para investigar o potencial multifuncional do FePO ₄ nanopartículas baseadas na entrega e estabilização de cargas.

Com a rápida aprovação da vacina de mRNA contra COVID19, as nanopartículas de vacina de mRNA são de grande interesse, estando o RNA sujeito a rápida hidrólise e perda de expressão funcional, cabe à nanopartícula melhorar essas características críticas. Aqui, mostramos FePO ₄ NPs estabilizam o RNA e suportam a tradução funcional do mRNA. Dadas essas características excelentes, FePO ₄ NPs podem merecer consideração para fortificação de alimentos, drogas e entrega de RNA, abrindo aplicações biomédicas interessantes.

Resultados e discussão

FePO ₄ Síntese, caracterização e análise de biocompatibilidade de NPs

Uma reação química simples de uma etapa entre (NH ₄ ) ₃ PO ₄ e Fe (NÃO ₃ ) ₃ dá FePO ₄ como precipitado que é disperso em surfactante biocompatível lipídio-PEG que ajuda a estabilizar FePO ₄ nanopartículas e prevenir a agregação. FePO ₄ NPs mostraram um tamanho hidrodinâmico de 175 ± 5 nm com um índice de polidispersidade (PDI) de 0,150 ± 0,01 sugerindo boa homogeneidade de partícula e estreita distribuição de tamanho. A análise do potencial Zeta mostrou uma carga superficial negativa de FePO ₄ NPs com potencial zeta de - 19,1 ± 8 mV. A carga de superfície negativa ainda ajuda a estabilizar as partículas em coloides, evitando assim a opsonização da proteína, um mecanismo que impede o direcionamento celular e altera a farmacocinética [24,25,26]. FePO ₄ foi ainda caracterizado por FTIR. A Figura 1c mostra a característica espectral de FePO ₄ nanopartículas e seu precursor — Fe (NO ₃ ) ₃ e (NH ₄ ) ₃ PO ₄ . FePO ₄ espectros mostram um pico nítido distinto em 1030 cm ⁻¹ que pode ser atribuído à banda de alongamento P – O, um pequeno pico a 520 cm ⁻¹ corresponde à curvatura antissimétrica O – P – O e uma ampla faixa de 3.000 a 3.500 cm ⁻¹ representa as vibrações de flexão e alongamento da água das moléculas de água adsorvidas [27, 28]. O FePO ₄ espectros mostraram a presença de PO ₄ ³⁻ grupo e são semelhantes ao pico de FTIR relatado por outros estudos, confirmando assim a formação de FePO ₄ nanopartículas [27,28,29]. Fe (NÃO ₃ ) ₃ espectros mostraram picos característicos para bandas de alongamento N – O em 1326 e 813 cm ⁻¹ [30]. O pico em 1625 pode ser atribuído a vibração de flexão –OH e um pico amplo em torno de 3000 cm ⁻¹ pode ser atribuído a vibrações de flexão e alongamento da água [30]. Da mesma forma, (NH ₄ ) ₃ PO ₄ mostrou picos característicos para o grupo de amônio em torno de 1500 cm ⁻¹ e grupo fosfato em torno de 1000 cm ⁻¹ [31]. A ausência de picos de nitrato e amônio em FePO ₄ nanopartículas sugerem que o produto está livre de possíveis subprodutos e confirmam a pureza da síntese.

Caracterização e biocompatibilidade do FePO ₄ nanopartículas. a Distribuição hidrodinâmica do tamanho de FePO ₄ NPs, b medição do potencial zeta de FePO ₄ NPs mostrando a carga superficial, c FTIR de FePO ₄ NPs e seu precursor-Fe (NO ₃ ) ₃ e (NH ₄ ) ₃ PO ₄ , e d biocompatibilidade de FePO ₄ NPs em osteossarcoma K7M2 de camundongo e linha de células NIH / 3T3 de fibroblastos de camundongo. NPs foram tratados em várias concentrações por 48 h ( a, b os dados representam a média ± dp .; n =3 repetições. d representa a média ± dp, n =6 réplicas).

Com a garantia de síntese bem-sucedida, pureza, homogeneidade de bom tamanho e carga de superfície estável de FePO ₄ NPs, passamos a analisar a biocompatibilidade do FePO ₄ NPs. Para tanto, usamos células cancerosas e não cancerosas:osteossarcoma K7M2 de camundongo e fibroblastos de camundongo NIH / 3T3 e analisamos a biocompatibilidade de NPs em uma concentração variável em termos de viabilidade celular usando o ensaio de MTT. FePO ₄ NPs mostraram biocompatibilidade dependente da concentração em ambas as linhas celulares-K7M2 e NIH / 3T3, na faixa de concentração de 20 a 600 µg / mL (Fig. 1d). FePO ₄ NPs mostraram boa biocompatibilidade até concentração de 80 µg / mL com viabilidade celular maior que 70%. A biocompatibilidade foi relativamente maior nas células não cancerosas NIH / 3T3 em comparação com as células cancerosas K7M2.

Carregamento de doxorrubicina em FePO ₄ e citotoxicidade de FePO ₄ -DOX

A doxorrubicina é carregada em FePO ₄ através do método de co-incubação-precipitação em que a solução de doxorrubicina é misturada com o precursor de FePO ₄ que resulta na formação de FePO carregado com DOX ₄ . Três formulações diferentes para carregar DOX são empregadas conforme discutido nos métodos. A formulação 1 mostrou a melhor eficiência de carregamento de 26,81% ± 1, enquanto a formulação 2 mostrou uma eficiência de carregamento de 8,83% ± 2 e a formulação 3 não mostrou qualquer carregamento (Fig. 2a). Para o carregamento, adicionamos solução DOX ao precursor Fe (NO ₃ ) ₃ na formulação 1 e para (NH ₄ ) ₃ PO ₄ na formulação 2, enquanto na formulação 3, adicionamos solução DOX ao FePO ₄ NPs diretamente. Os dados de carregamento mostraram claramente que adicionar DOX ao FePO ₄ NPs não retém o DOX enquanto adicionar DOX a qualquer um dos precursores:Fe (NO ₃ ) ₃ e (NH ₄ ) ₃ PO ₄ solução ajuda no carregamento e retenção de DOX. Isso pode ser explicado pelo fato de Fe ³⁺ de Fe (NÃO ₃ ) ₃ pode formar um complexo com o grupo de oxigênio rico em elétrons presente na doxorrubicina [32, 33]. The Fe ³⁺ O complexo -DOX é então precipitado pela adição de (NH ₄ ) ₃ PO ₄ resultando em FePO ₄ -DOX, que é caracterizado por uma mudança de cor de amarelo claro para marrom claro (Fig. 2b). Apesar da mudança de cor, não houve mudança nos espectros de emissão de FePO ₄ -DOX que apresentou máximos de emissão em 590 nm semelhante ao de DOX livre, quando excitado em 480 nm (Fig. 2c). FePO ₄ -DOX NPs mostraram um tamanho hidrodinâmico de 187 ± 7 nm e PDI de 0,143 ± 0,02, semelhante ao de FePO ₄ (Fig. 2d). No entanto, houve uma diferença significativa na carga superficial de FePO ₄ -DOX NPs (-8,89 ± 5 mV), em comparação com FePO ₄ NP (-19,1 ± 8 mV) (Fig. 2e). Mudança no potencial zeta sugere mudanças funcionais nas propriedades de superfície das nanopartículas. Aqui, a redução do potencial zeta de - 19,1 para - 8,89 mV pode ser atribuída à complexação DOX que adiciona propriedade catiônica no complexo.

Carregamento de doxorrubicina (DOX) em FePO ₄ NPs e caracterização de FePO ₄ -DOX. a Eficiência de carregamento de DOX em três formulações diferentes de FePO ₄ NPs e DOX, b representação pictórica da mudança de cor de amarelo para marrom após o carregamento DOX no FePO ₄ para formular FePO ₄ -DOX, c caracterização de espectros de emissão de FePO carregado com DOX ₄ NPs (FePO ₄ -DOX) após excitação a 480 nm, d distribuição hidrodinâmica do tamanho de FePO ₄ -DOX NPs e e caracterização de potencial zeta de FePO ₄ -DOX NPs mostrando a carga superficial (os dados representam a média ± desvio padrão; n =3 repetições)

Seguindo a caracterização físico-química, a citotoxicidade do FePO ₄ -DOX foi analisado em células K7M2 e NIH / 3T3 e comparado com DOX livre (Fig. 3). FePO ₄ -DOX mostrou maior citotoxicidade em comparação com DOX livre em concentração de DOX equivalente em ambas as linhas celulares. O valor de IC50 mostrou redução de cerca de 10 vezes com FePO ₄ Tratamento -DOX, de 2,61 a 0,248 µM em NIH / 3T3 e 1,01 a 0,107 µM em células K7M2. Esta redução drástica no valor de IC50 em ambas as linhas celulares sugere um perfil de citotoxicidade aprimorado de FePO ₄ -DOX NPs. O equivalente FePO ₄ concentração na faixa de concentração IC50 de FePO ₄ -DOX é 40 µg / mL (0,107 µM em células K7M2) e 100 µg / mL (0,248 µM em células NIH / 3T3), que estão ambos dentro da faixa biocompatível de FePO ₄ concentração, com mais de 70% de viabilidade celular. Conseqüentemente, a elevação de FePO ₄ -A citotoxicidade DOX pode ser atribuída ao Fe ³⁺ -Formação do complexo DOX e não para a contribuição individual de FePO ₄ e DOX. A literatura tem mostrado o elevado efeito citotóxico de antraciclinas como a doxorrubicina na presença de ferro [34,35,36,37]. Esses relatórios são ainda apoiados pelo alívio da citotoxicidade do Fe-DOX pelo uso de quelantes de ferro [35,36,37]. Um mecanismo proposto é o complexo Fe-DOX que potencializa a toxicidade de espécies reativas de oxigênio derivadas de DOX (ROS) transformando ROS relativamente seguras (O ^{2 ·} - e H ₂ O ₂ ) em ROS muito mais tóxicos, levando a elevados danos ao DNA e morte celular [34, 36]. Outro mecanismo proposto é a interação de DOX com a função de proteínas reguladoras de ferro e ferritina na presença de excesso de Fe, afetando assim a homeostase do ferro, levando a danos independentes e dependentes de ROS e morte celular apoptótica [36, 38].

Citotoxicidade de FePO ₄ -DOX NPs. a, b Citotoxicidade de doxorrubicina livre (DOX) e FePO ₄ -DOX NPs em fibroblastos de camundongo NIH / 3T3 e linha celular de osteossarcoma K7M2, respectivamente, em várias concentrações equivalentes de DOX. A citotoxicidade foi analisada em porcentagem de viabilidade celular após o tratamento das partículas por 48 h. c, d Uma comparação na porcentagem de viabilidade celular de FePO ₄ -DOX NPs e DOX livre em linhas celulares NIH / 3T3 e K7M2, respectivamente, em concentração de DOX equivalente. A inserção no meio representa os valores IC-50 de Free DOX e FePO ₄ -DOX NPs em células NIH / 3T3 e K7M2 (os dados representam a média ± s.d .; n =6 réplicas)

Junto com a citotoxicidade elevada, FePO ₄ -DOX mostrou seletividade para células cancerosas com comportamento de maior citotoxicidade semelhante ao de DOX livre. A Figura 3c mostra 0,1 µM DOX equivalente FePO ₄ -DOX mostrou 53% de viabilidade celular para células cancerosas K7M2 em comparação com 72% de viabilidade celular para células não cancerosas NIH / 3T3. Da mesma forma, o DOX livre também apresentou maior comportamento de citotoxicidade em relação às células cancerosas, com 54% de viabilidade celular em células K7M2 em comparação com 66% em NIH / 3T3. No entanto, as diferenças aumentaram no caso de FePO ₄ -DOX, com 19% de diferenças na viabilidade celular entre células cancerosas e não cancerosas em comparação com 12% em DOX livre. A análise de citotoxicidade mostrou que a complexação de Fe com DOX em FePO ₄ -DOX NPs aumentou significativamente a citotoxicidade e melhorou a seletividade em relação às células cancerosas.

Internalização celular de FePO ₄ -DOX NPs

O comportamento de internalização do FePO ₄ -DOX NPs foi analisado usando microscopia confocal após um estudo de internalização dependente do tempo (Fig. 4). O DOX livre foi usado como controle positivo. Ambos FePO ₄ NPs -DOX e DOX livre não mostraram internalização significativa nos pontos de tempo de incubação iniciais de 0,5 e 1 h. No entanto, em 3 h de incubação, ambos mostraram internalização, conforme representado pela fluorescência DOX vermelha na imagem confocal. A cor azul vem da coloração do núcleo por DAPI. A análise mostra que dentro de 3 h, FePO ₄ -DOX NPs internalizam em células seguindo um comportamento de internalização semelhante ao de DOX livre. É importante notar que, devido à mudança de cor do FePO ₄ -DOX, que é acastanhado em comparação com a cor vermelha de DOX livre, não podemos comparar quantitativamente o perfil de internalização relativo de FePO ₄ -DOX. No entanto, o ensaio de internalização confirmou que FePO ₄ -DOX é captado pelas células em 3 h. Dado o mecanismo bem compreendido de manipulação de ferro por nosso corpo, os NPs propostos podem ser promissores no desenvolvimento de terapêuticas anticâncer à base de ferro com a capacidade de monitorar a resposta terapêutica em uma única sessão de terapia.

Estudo de internalização celular. Internalização celular de FePO ₄ -DOX NPs e DOX livre em células K7M2 após 3 h, 1 h e 0,5 h de tratamento. As células foram tratadas com 200 µL de concentração de DOX 5 µg / mL. A cor vermelha observada na linha celular tratada com nanopartículas significa internalização bem-sucedida das nanopartículas. A cor vermelha é devido à fluorescência característica do DOX. Nenhum sinal vermelho é observado na célula de controle não tratada

Estabilização de RNA e expressão de mRNA

Como pode ser visto na Fig. 5a, enquanto as nanopartículas de cobre (Cu NP) e os nanotubos de carbono (CNTs) aceleram a degradação hidrolítica do RNA (menor intensidade de banda do que o controle), o FePO ₄ e as nanopartículas de prata (Ag) de controle estabilizam o RNA, conforme mostrado por uma intensidade de banda relativamente forte na eletroforese em gel de agarose de RNA (RAGE). O FePO ₄ e as nanopartículas de óxido de zinco de controle (ZnO NP) também conferem alguma resistência à degradação no soro, conforme representado pela intensidade da banda que é ligeiramente maior do que os controles (Fig. 5b). É importante ressaltar que a atividade funcional, a expressão de mRNA é maior do que os controles não nanopartículas, enquanto o Cu NP que se degrada no RNA causa perda na expressão de mRNA medida por unidades de luz relativas (Fig. 5c). Esses resultados mostram que FePO ₄ NPs ajudam a estabilizar o RNA e podem ser usados como um agente de entrega estabilizadora para entrega de RNA terapêutico. Experimentos preliminares anteriores indicaram uma faixa normal de trabalho de tradução. Os dois experimentos independentes para as amostras de controle não tratadas com nanopartículas mostrando 2393 e 2630 RLU / poço, o que é representativo. Um aumento de duas vezes consistente com os dados acima sugere que o FePO44 NP suporta a tradução, enquanto que consistente com a desnaturação / degradação do RNA acima, o Cu NP suprime a tradução. Uma variedade de sistemas de nanopartículas inorgânicas tem sido explorada para estabilização e distribuição de RNA terapêutico, incluindo; ouro, prata, cobre, óxido de ferro, nanopartícula de sílica mesoporosa (MSN), polímeros à base de carbono, compostos e outros [39-45]. Por exemplo, nosso grupo relatou que a complexação de nanopartículas com o RNA macromolecular pode fazer com que ele resista à degradação por RNase ou nucleases presentes no soro e nos tecidos. A vacina de mRNA COVID-19 renovou o interesse em tais terapias de RNA macromolecular estendendo-se além das vacinas, onde cabe à nanopartícula não apenas proteger o RNA da hidrólise e digestão mediada por nuclease, mas a complexação com o NP deve preservar a função do RNA, por exemplo , expressão de mRNA. Anteriormente, vimos a complexação de nanopartículas de cobre com RNA macromolecular que causa desnaturação de RNA [46]. Assim, investigamos os efeitos da complexação de NP com RNA macromolecular usando RNA de levedura Torula (TY-RNA) ou um mRNA de construção repórter que expressa Luciferase.

Hidrólise de RNA. a Foi utilizado um modelo de RNA que utilizamos em várias de nossas publicações, semelhante em tamanho e composição de sequência à maioria dos mRNAs de levedura torula (TY-RNA). O RNA foi incubado em água bidestilada ao longo do tempo na presença ou ausência de nanopartículas de cobre (Cu NP), fosfato de ferro (FePO4), prata (Ag NP) ou nanotubo de carbono (CNT) a 37 graus celcius e as amostras removidas em no mesmo ponto de tempo e testado por eletroforese em gel de agarose de RNA (RAGE). A perda da intensidade da coloração da banda indica degradação do RNA, enquanto a manutenção da intensidade da coloração da banda do RNA indica estabilização. b Semelhante ao anterior, o RNA foi incubado em 10% FBS / DMEM à temperatura ambiente na presença de óxido de zinco (ZnO) NP ou FePO ₄ NP versus controle que era RNA sozinho na ausência de nanopartículas. Novamente as amostras foram removidas ao longo do tempo e testadas por RAGE, a presença da banda de RNA corada ao longo do tempo indica novamente estabilidade e resistência da nuclease ou degradação de RNase do soro. c O mRNA que codifica a luciferase foi traduzido in vitro a partir de reticulócitos de coelho padrão e a luminescência relativa padronizada para RNA na presença ou ausência de fosfato de ferro (FePO ₄ ) ou nanopartícula de cobre (Cu)

Conclusão

FePO ₄ nanopartículas foram sintetizadas com sucesso seguindo uma técnica simples de co-incubação-precipitação, resultando na formação de partículas de tamanho homogêneo de 175 ± 5 nm. A análise de FTIR confirmou a presença do grupo fosfato e a ausência de impurezas precursoras na nanopartícula. A análise de biocompatibilidade revelou biocompatibilidade dependente da concentração com mais de 70% de viabilidade celular até 80 µg / mL. Além disso, o DOX foi efetivamente carregado no FePO ₄ resultando em FePO ₄ -DOX NPs que mostraram propriedades físico-químicas semelhantes às do FePO ₄ . A análise de citotoxicidade revelou que a complexação de Fe com DOX em FePO ₄ -DOX NPs aumentou a citotoxicidade, com cerca de 10 vezes a melhoria em IC50, e melhorou a seletividade em relação às células cancerosas. Além disso, o ensaio de internalização mostrou FePO ₄ -DOX NPs foram eficientemente internalizados nas células em um ponto de tempo de incubação de 3 h. O estudo de estabilização de RNA mostrou que FePO ₄ nanopartículas estabilizam eficientemente o RNA, previnem a degradação rápida e mantêm a atividade funcional, demonstrando promessas para entrega de RNA terapêutico. Dada a boa homogeneidade de tamanho, faixa de biocompatibilidade, eficiência de carregamento de drogas, perfil de citotoxicidade aprimorado, propriedade de estabilização de RNA e absorção celular eficiente, FePO ₄ NPs mostraram características desejáveis para veículos de entrega de drogas e RNA. Além disso, os resultados mostraram perspectivas promissoras de uso do FePO ₄ - NPs de drogas em fortificações de alimentos para o desenvolvimento de uma plataforma de drogas baseada em alimentos.

Métodos

Síntese e caracterização de FePO ₄ Nanopartículas

FePO ₄ nanopartículas foram sintetizadas pelo protocolo de otimização da técnica de precipitação química por Sokolova et al. [47]. Resumidamente, Fosfato de amônio ((NH ₄ ) ₃ PO _4, 16 mg / mL) e nitrato de ferro (Fe (NO ₃ ) _3, 8 mg / mL) de solução. Para o 1 mL de Fe (NO ₃ ) ₃ , 1 mL de (NH ₄ ) ₃ PO ₄ foi adicionado gota a gota sob agitação constante, resultando na precipitação de fosfatos de ferro (FePO ₄ ) Excesso de (NH ₄ ) ₃ PO ₄ foi usado para que todo Fe de Fe (NO ₃ ) ₃ precipitar como FePO _4. A solução de fosfatos de ferro assim formada foi lavada com água 3 vezes para remover os subprodutos por centrifugação a 300 g durante 2 min. Finalmente, FePO ₄ precipitado foi disperso com solução DSPE-PEG-COOH (10% w / w) em água para formular FePO ₄ nanopartículas. FePO ₄ NPs foram caracterizados quanto ao tamanho e propriedades de superfície usando espalhamento dinâmico de luz (DLS) e características espectrais usando Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR).

Carregamento de doxorrubicina (DOX) no FePO ₄ Nanopartículas

A doxorrubicina foi carregada em FePO ₄ nanopartículas pelo método de co-incubação-precipitação. Três DOX-FePO ₄ diferentes As formulações de NPs foram exploradas para otimizar a melhor eficiência de carregamento. Na primeira formulação, DOX-FePO ₄ NPs foram formulados pela adição de 100 µg DOX em 1 mL de Fe (NO ₃ ) ₃ (8 mg / mL) seguido pela adição de 1 mL de (NH ₄ ) ₃ PO ₄ (16 mg / mL) gota a gota sob agitação constante. Nas segundas formulações, 100 µg de DOX foi adicionado primeiro a 1 mL de (NH ₄ ) ₃ PO ₄ (16 mg / mL) seguido pela adição de 1 mL de Fe (NO ₃ ) ₃ (8 mg / mL) gota a gota sob agitação constante. Nas terceiras formulações, 100 µg DOX foi adicionado ao FePO ₄ Solução NP. FePO assim formulado ₄ -DOX NPs foram lavados três vezes com água e a quantidade de doxorrubicina em FePO ₄ -DOX foi quantificado espectrofluorimetricamente medindo a excitação e emissão de DOX em 490 nm e 595 nm.

A eficiência de carregamento de DOX foi calculada pela seguinte equação:
$$ \% \; {\ text {Carregando}} \; {\ text {eficiência:}} \; \ left ({{\ text {DOX}} \; {\ text {presente}} \; {\ text {in}} \; {\ text {FePO}} _ {{4}} - {\ text {DOX}} \; {\ text {NP / Inicial}} \; {\ text {input}} \; { \ text {of}} \; {\ text {DOX}}} \ right) \ times {1} 00 $$

Biocompatibilidade do FePO ₄ NPs e citotoxicidade de FePO ₄ -DOX NPs

Biocompatibilidade de FePO ₄ NPs e citotoxicidade de FePO ₄ -DOX NPs foram ensaiados em osteossarcoma de camundongo K7M2 e fibroblastos de camundongo NIH / 3T3 usando ensaio de MTT seguindo protocolo estabelecido [48, 49]. Resumidamente, 10.000 células foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas por 24 h em um 37 ° C 5% CO ₂ incubadora. Em seguida, o meio foi removido e meio fresco com várias concentrações de nanopartículas foram tratadas com as células e deixadas para incubação por 48 h. As células de controle foram mantidas apenas com meio. FePO ₄ A concentração de NPs varia de 20 a 600 µg / mL e a concentração de DOX varia de 0,05 a 5 µM. Após a incubação de NP, o meio foi removido e as células foram incubadas com solução de MTT (0,5 mg / ml) em meio sem soro por 2 h para permitir a formação de cristal de formazan. A solução de MTT foi removida e o cristal de formazan foi dissolvido em DMSO e deixado por 15 min em temperatura ambiente para a mistura apropriada. Em seguida, a absorbância da solução de DMSO foi medida a 550 nm usando um leitor de microplaca (BioTek, Synergy H1 Hybrid Reader) e a porcentagem de viabilidade celular foi calculada.

Internalização celular via microscopia confocal

Internalização celular de FePO ₄ -DOX NPs foi analisado em células de osteossarcoma de camundongo K7M2 usando microscopia confocal [49,50,51]. Resumidamente, 12.000 células foram semeadas em placas de 8 poços e incubadas por 24 h em 37 ° C 5% CO ₂ incubadora. Em seguida, 200 µL de concentração de DOX 5 µg / mL no meio foram tratados por 3 h, e as células foram fixadas com Paraformaldeído 4% para imagens. O núcleo foi corado por DAPI e as células foram observadas em um microscópio de varredura a laser confocal (Carl Zeiss, LSM-700). Aqui, a emissão máxima de DOX em 560 nm pode ser explorada para rastrear sua internalização, que dá cor vermelha em microscopia confocal. Usando o mesmo protocolo, um ensaio de internalização dependente do tempo foi realizado incubando FePO ₄ -DOX NPs e Free DOX por 0,5, 1 e 3 h, respectivamente.

Estabilidade e expressão de RNA

O RNA de levedura Torula (Sigma-Aldrich) foi dissolvido a 1 mg / ml em água desionizada estéril e alíquotas de 2 µg expostas a nanopartículas de 20 ug / mL (CNT, Cu, Ag, ZnO NP ou FePO ₄ ) incubado a 37 ° C e testado ao longo do tempo por eletroforese em gel de agarose de RNA, como relatamos anteriormente [42, 52]. O ponto de tempo mostrado na Fig. 5 é durante a noite. Da mesma forma, o RNA com / sem nanopartículas foi exposto a 10% de FBS / DMEM e novamente testado por RAGE como acima. mRNA fLuc was obtained from Trilink Biotechnologies, 2 µl were incubated in rabbit reticuloysate supplemented with Methinine, Cysteine and Leucine (ProMega Corp) for 30 degrees for 1.5 h with or without nanoparticle at 20 μg/ml, standard Luciferin reagent added, and luminescence measurement taken on a Biotek Synergy H1 plate reader under standard conditions.

Statistical Analysis

All data represents at least three independent replicates and expressed as mean ± s.d. whenever possible. Cell viability data includes six replicates.