Nanopartículas como bomba de efluxo e inibidor de biofilme para rejuvenescer o efeito bactericida de antibióticos convencionais

Resumo

O problema universal da resistência bacteriana aos antibióticos reflete uma séria ameaça para os médicos no controle de infecções. A evolução nas bactérias resulta no desenvolvimento de vários mecanismos complexos de resistência para neutralizar o efeito bactericida dos antibióticos, como melhora do medicamento, modificação do alvo, redução da permeabilidade da membrana e extrusão do medicamento através de bombas de efluxo. As bombas de efluxo adquirem uma ampla gama de especificidade de substrato e também uma tremenda eficácia para a extrusão de moléculas de drogas fora das células bacterianas. Os obstáculos ao funcionamento das bombas de efluxo podem rejuvenescer o efeito bactericida dos antibióticos convencionais. As bombas de efluxo também desempenham um papel importante na exclusão ou inclusão de biomoléculas quorum-sensing responsáveis ​​pela formação de biofilme em células bacterianas. Este movimento de trânsito de biomoléculas com detecção de quorum dentro ou fora das células bacterianas pode ser interrompido impedindo o funcionamento das bombas de efluxo. Nanopartículas metálicas representam um candidato potencial para bloquear bombas de efluxo de células bacterianas. A aplicação de nanopartículas como inibidores da bomba de efluxo não só ajudará a reviver o efeito bactericida dos antibióticos convencionais, mas também ajudará a reduzir a capacidade de formação de biofilme dos micróbios. Esta revisão se concentra em uma aplicação nova e fascinante de nanopartículas metálicas em sinergia com antibióticos convencionais para a inibição da bomba de efluxo.

Revisão

As infecções crônicas identificadas com biofilmes são difíceis de erradicar, pois são capazes de resistir tanto aos antibióticos quanto ao sistema imunológico do hospedeiro [1]. A barreira do biofilme é uma das principais razões para a conversão de infecções agudas em crônicas [2]. Conforme indicado pelo relatório do instituto nacional de saúde e centro de controle de doenças, aproximadamente 65-80% das doenças são causadas por bactérias indutoras de biofilme, predominantemente por bactérias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli e bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus [3]. Os antibióticos têm se mostrado ineficazes no tratamento de infecções com biofilme, devido à sua capacidade limitada de atravessar a barreira do biofilme e extirpar as células bacterianas-alvo [4]. Além disso, as bactérias desenvolveram um sistema de efluxo exclusivo para drenar substâncias tóxicas e produtos residuais fora da célula bacteriana [5]. As bombas de efluxo são proteínas transportadoras ligadas à membrana, tendo um amplo espectro de especificidade de substrato e imensa capacidade de exclusão de drogas [6].

Todas essas doenças associadas a problemas pertinentes ao biofilme e às bombas de efluxo levam ao surgimento de bactérias resistentes a múltiplas drogas (MDR) ou bactérias resistentes a drogas extensas (EDR); devido a isso, nanopartículas em conjunto com antibióticos convencionais foram propostas como uma abordagem alternativa para erradicar ou danificar o biofilme, bem como para tratar infecções MDR ou EDR.

Esses novos antimicrobianos, nanopartículas metálicas, não apenas aumentam a atividade antimicrobiana dos antibióticos existentes, mas também revivem sua atividade bactericida. A aplicação sinérgica de antibióticos e nanopartículas metálicas exibiu mais seu potencial efeito antimicrobiano do que sua aplicação individual [7, 8]. A utilização de nanopartículas com antibióticos como anti-biofilme ou inibidor da bomba de efluxo tem sido bem examinada e explorada [1, 9,10,11]. Nanopartículas metálicas têm sido amplamente utilizadas para tratar infecções em linhas de células humanas devido à sua baixa citotoxicidade (dependente da concentração), alta área de superfície e atividade antibacteriana de amplo espectro [12,13,14]. Além disso, a aplicação combinada de nanopartículas metálicas com um antibiótico reduz sua concentração como dosagem do fármaco e, portanto, diminui a toxicidade de ambos os agentes para linhagens celulares humanas [15]. Esta revisão enfatiza a aplicação sinérgica de nanopartículas com antibióticos como anti-biofilme e inibidor da bomba de efluxo em que extensas pesquisas foram realizadas para combater infecções causadas por patógenos MDR ou EDR.

Nanopartículas como inibidores da bomba de efluxo

Vários estudos têm sido realizados para determinar o modo de ação das nanopartículas como agente bactericida. No entanto, os diversos pontos sobre o mecanismo de ação inibitória das nanopartículas sobre os microrganismos ainda precisam ser resolvidos. Um dos possíveis mecanismos para a atividade bactericida das nanopartículas é atribuído à inibição das bombas de efluxo. Banoee et al. em 2010 apresentou um novo papel inibidor da bomba de efluxo de nanopartículas de óxido de zinco nas bombas de efluxo NorA de S. aureus . Eles descobriram um aumento de 27 e 22% na zona de inibição para ciprofloxacina na presença de nanopartículas de óxido de zinco em S. aureus e E. coli , respectivamente [16]. Posteriormente, Padwal et al. em 2014 propôs o conceito de uso sinérgico de nanopartículas de óxido de ferro revestido com ácido poliacrílico (magnetita) (PAA-MNP) com rifampicina contra Mycobacterium smegmatis com ênfase no papel inibidor de efluxo do PAA-MNP. Eles usaram uma fusão de PAA-MNP e rifampicina em M. smegmatis o que resultou em uma inibição do crescimento quatro vezes maior em contraste com a rifampicina sozinha. Isso pode ser explicado pelo aumento de três vezes no acúmulo de antibiótico dentro das células bacterianas, conforme comprovado por estudos de transporte em tempo real em um substrato de bomba de efluxo comum, o brometo de etídio [17].

Existem dois mecanismos possíveis através dos quais nanopartículas de metal podem impedir o funcionamento das bombas de efluxo. Um possível mecanismo é a ligação direta das nanopartículas metálicas ao sítio ativo das bombas de efluxo, bloqueando a extrusão dos antibióticos para fora das células. Nanopartículas de metal podem aqui atuar como um inibidor competitivo de antibióticos para o local de ligação das bombas de efluxo [18]. Outro mecanismo possível é por meio da interrupção da cinética de efluxo. O efeito das nanopartículas de prata para a interrupção da cinética de efluxo da bomba de efluxo MDR, MexAM-OPrM, já foi examinado em P. aeruginosa [19]. Pode ser sugerido que as nanopartículas de metal podem levar ao término do gradiente de prótons seguido pela ruptura do potencial da membrana ou perda da força motriz do próton (PMF), resultando na deterioração da força motriz essencial para a atividade da bomba de efluxo [18, 20, 21]. No entanto, o principal constrangimento na ligação direta de nanopartículas com bombas de efluxo é seu pequeno tamanho e reatividade. Além disso, as nanopartículas também podem se ligar a outras proteínas de membrana, em vez de interagir simplesmente com as bombas de efluxo e, por causa disso, a chance de as nanopartículas se associarem a um transportador de efluxo cada vez em meio à exposição é restrita.

Christena et al. mostrou anteriormente em seus estudos sobre o papel inibidor de efluxo de nanopartículas de cobre na bomba de efluxo NorA, em parte devido à geração de íons Cu (II) a partir de nanopartículas de cobre. Este efeito parcial diretamente das nanopartículas de cobre pode implicar na interação direta das nanopartículas com as bombas de efluxo, apoiando a primeira hipótese, enquanto o efeito parcial devido à liberação de íons Cu (II) pode indicar a interrupção do potencial de membrana e perturbar o funcionamento das bombas de efluxo, apoiando a segunda hipótese [9]. Chatterjee et al. também revelaram a perda de potencial de membrana de E. coli células de −185 a −105 e −75 mV após o crescimento de células bacterianas na presença de 3,0 e 7,5 μg / ml de concentração de nanopartículas de cobre, respectivamente, por 1 h [22]. O mecanismo explícito para o papel inibidor de efluxo das nanopartículas ainda permanece intrigante e requer mais pesquisas.

Nanopartículas como Agente Anti-Biofilme

O biofilme oferece resistência a bactérias, mas esse desafio é intensificado se o biofilme for produzido por bactérias resistentes a medicamentos [23]. Numerosos estudos têm mostrado tremendas capacidades de nanopartículas de metal para desintegrar barreira de biofilme espesso através de vários modos de ação [24,25,26,27]. O poder de penetração das nanopartículas metálicas sempre permanece uma característica útil para empregá-las contra infecções de biofilme [28,29,30]. Este amálgama único de duas modalidades diversas, nanopartículas e antibióticos, abriu uma nova maneira de combater bactérias MDR ou EDR produtoras de biofilme.

Um dos estudos mais eloqüentes foi conduzido por Gurunathan et al. para elucidar o efeito bactericida e anti-biofilme aumentado de diferentes antibióticos com nanopartículas de prata. O uso simbiótico de ampicilina e nanopartículas de prata aumentou muito a inibição do biofilme em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas em 70 e 55%, respectivamente, em contraste com aproximadamente 20% de inibição do biofilme após o tratamento apenas com nanopartículas de prata. Da mesma forma, a aplicação combinada de nanopartículas de prata e vancomicina resulta em 55 e 75% de inibição do biofilme em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, respectivamente [10]. Esses resultados sugerem o uso alternativo de nanopartículas com antibióticos para induzir a inibição do biofilme, abrindo possibilidades clínicas de novas terapias.

Um efeito semelhante também foi observado para nanopartículas de cobre e nanopartículas de óxido de zinco usando sinergicamente com antibióticos. De acordo com este estudo, a unificação de nanopartículas de cobre e antibióticos mostrou atividade anti-biofilme mais eficaz em contraste com a combinação de nanopartículas de óxido de zinco e antibióticos em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Este aumento da inibição com nanopartículas de cobre pode ser devido à extrusão de íons Cu (II) gerados a partir das nanopartículas. Nanopartículas de cobre e nanopartículas de óxido de zinco acopladas com antibiótico específico exibiram efeito anti-biofilme aprimorado na presença de glicose a 2%, revelando interações de ligação aumentadas entre nanopartículas metálicas e antibiótico na presença de glicose [9]. O revestimento de nanopartículas metálicas com carboidratos pode transmogrificar a interação nanopartícula-célula, absorção celular e citotoxicidade [31].

A aliança entre sistemas de efluxo e detecção de quorum

As bombas de efluxo desempenham um papel importante na sinalização célula a célula de biomoléculas para auxiliar a formação de biofilme. Um provável mecanismo para combater a resistência aos medicamentos é empregar os inibidores da bomba de efluxo para bloquear o mecanismo de detecção de quorum, dificultando a formação de biofilme. Vários estudos já foram realizados para mostrar o papel das bombas de efluxo no quorum sensing [23, 32,33,34,35,36,37,38,39]. A relação mecanística explícita entre as bombas de efluxo e a formação de biofilme ainda não é totalmente compreendida. Uma justificativa viável poderia ser o papel das bombas de efluxo para extrudar componentes críticos necessários no sensor de quorum. Esse aspecto funcional já foi proposto em estudos anteriores [40,41,42,43,44,45,46]. O comprometimento na extrusão da molécula de sinalização por meio da aplicação de inibidores da bomba de efluxo pode afetar o processo de detecção de quorum ou sinalização célula a célula [47, 48] (Fig. 1).

Uso de nanopartículas de metal como um inibidor da bomba de efluxo para impedir a extrusão de moléculas de sinalização de detecção de quorum ( círculo preenchido em vermelho ) fora das células bacterianas com a ajuda de nanopartículas de metal ( círculo preenchido em amarelo ) para bloquear a bomba de efluxo ( cilindro cheio ) resultando na redução da ligação da molécula de sinalização ao seu receptor ( cilindro vazio ) e impedimento na formação de biofilme

Outra justificativa viável poderia ser o papel das bombas de efluxo para exportar subprodutos tóxicos e resíduos para fora das células. As células que metabolizam rapidamente no biofilme podem depender do sistema condutor para expulsar o subproduto nocivo e residual resultante de várias atividades bioquímicas que ocorrem dentro das células bacterianas [49]. Esse aspecto funcional também foi proposto no estudo de Kvist et al. em 2008 [50]. O emprego de inibidores da bomba de efluxo para bloquear este sistema condutor pode resultar em maior acúmulo de subproduto tóxico dentro das células bacterianas, reduzindo a formação de biofilme (Fig. 2).

Uso de nanopartículas de metal como um inibidor da bomba de efluxo para impedir a extrusão de subproduto tóxico de reações bioquímicas ( círculo preenchido em vermelho ) fora das células bacterianas com a ajuda de nanopartículas de metal ( círculo preenchido em amarelo ) para bloquear a bomba de efluxo ( cilindro cheio ) resultando em impedimento na formação de biofilme

Alguns estudos também sugeriram o detrimento das bombas de efluxo para afetar a agregação celular, transmutando as propriedades da membrana celular e, em última análise, afetando a formação de biofilme [47]. Numerosos estudos já foram conduzidos para deduzir o efeito das nanopartículas em combinação com antibióticos como agente antibacteriano e anti-biofilme melhorado. A Tabela 1 contém um resumo desses estudos.

Um dos estudos recentes foi conduzido por Barapatre et al., Deduzindo a atividade antibacteriana e anti-biofilme sinérgica aprimorada de nanopartículas de prata em combinação com amicacina, canamicina, oxitetraciclina e antibiótico estreptomicina contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Centralizando sobre a química verde, as nanopartículas de prata foram sintetizadas por meio da redução enzimática do nitrato de prata envolvendo dois fungos degradadores de lignina, viz., Aspergillus flavus e Emericella nidulans . Foi sugerido o uso de nanopartículas como uma sonda com antibióticos convencionais para aumentar a atividade antibacteriana e anti-biofilme contra micróbios patogênicos [51]. A interrupção da função dependente de ATP, como a inibição da bomba de efluxo, foi relatada como um dos mecanismos potenciais de efeito sinérgico de antibióticos e nanopartículas metálicas [52].

Vários relatórios demonstraram com sucesso o uso de nanopartículas contra dois mecanismos diversos de resistência bacteriana, viz., Bombas de efluxo MDR e formação de biofilme, através dos quais as bactérias evitam a ação dos antibióticos convencionais. Esta revisão representa uma abordagem nova e promissora para empregar nanopartículas metálicas em sinergia com antibióticos como inibidor da bomba de efluxo e agente anti-biofilme, ambos para combater a resistência aos antibióticos.

Conclusões

No cenário atual, existe uma necessidade de uma abordagem inovadora para controlar as infecções MDR. As bombas de efluxo desempenham duas funções, uma é expulsar antibióticos e a outra é ajudar na formação de biofilme por meio da expulsão de biomoléculas importantes para o quorum sensing, contribuindo em última análise para a virulência de patógenos bacterianos. O bloqueio das bombas de efluxo MDR através de nanopartículas será útil em ambas as direções; ele bloqueia o efluxo de antibióticos fora das células bacterianas e, portanto, aumenta o efeito dos antibióticos convencionais e, também, bloqueia o efluxo de biomoléculas sensíveis ao quorum e, portanto, diminuindo a capacidade de formação de biofilme das células bacterianas. Esta abordagem reduz a necessidade de conduzir novas pesquisas para investigar um novo inibidor da bomba de efluxo ou novo antibiótico, mas incentiva o uso de nanopartículas de metal (empregando como um inibidor da bomba de efluxo) em sinergia com os antibióticos convencionais. Também ajudará na redução do custo, do tempo e do problema de citotoxicidade das nanopartículas em linhagens de células humanas que podem suportar uma concentração menor de nanopartículas metálicas. Seria uma nova abordagem para direcionar as bombas de efluxo, reduzindo os sinais de detecção de quorum, a fim de suprimir a formação de biofilme.

Perspectivas futuras

A evolução bacteriana resultou na adoção de vários mecanismos para reverter o efeito bactericida do antibiótico e do sistema imunológico do hospedeiro. Isso leva à geração de infecções multirresistentes, refletindo uma necessidade urgente de descobrir novas abordagens para lutar contra infecções MDR ou XDR. Com o surgimento da resistência aos antibióticos, o uso simbiótico de nanopartículas metálicas com antibióticos convencionais oferece uma alternativa melhor para lutar contra a resistência aos antibióticos. A aplicação de nanopartículas como inibidores da bomba de efluxo pode ser de grande importância em duas direções diversificadas, mas terminando com um único resultado, ou seja, para lutar contra infecções bacterianas. O mecanismo exato de ação das nanopartículas para bloquear as bombas de efluxo ainda precisa ser investigado. É provável que a interrupção do PMF seja um provável mecanismo indireto pelo qual as nanopartículas podem inibir o efluxo. Um dos principais desafios dessa abordagem está aliado à reatividade das nanopartículas, que pode torná-las associadas a outras proteínas de membrana, em vez de proteínas transportadoras de efluxo. Isso pode ser superado pela preparação de nanopartículas direcionadas, ligando-as a anticorpos monoclonais anti-efluxo ou lectinas. Esta inibição apropriada irá calibrá-los para focar em um local específico. Outro desafio considerável pode ser o problema de toxicidade, usando esta abordagem devido à grande razão entre a superfície e o volume das nanopartículas de pequeno tamanho que devem ser otimizadas antes da validação final.

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