Impacto de Nanopartículas de Sílica na Expressão Gênica e Metilação de DNA em Tecidos Pulmonar e Testicular

Resumo

A nanotecnologia tem se desenvolvido rapidamente e agora é usada em muitas terapêuticas médicas de ponta. No entanto, há preocupação crescente de que a exposição a nanopartículas (NPs) possa induzir diferentes doenças sistêmicas, pois mecanismos epigenéticos estão associados a cada vez mais doenças. O papel da modificação epigenômica por NPs é importante para a etiologia das doenças. Nosso estudo visou determinar os mecanismos epigenéticos de dano em células pulmonares e testiculares expondo células a NPs de SiO₂. Usamos camundongos machos C57BL/6 para caracterizar o efeito danoso de NPs de SiO₂ em células pulmonares e testiculares, bem como o estado de metilação resultante na região do domínio imprimido Dlk1/Dio3. Células A549 expostas a NPs de SiO₂ tiveram apoptose celular, e camundongos machos expostos a NPs de SiO₂ tiveram tecidos pulmonares e testiculares alterados. Os genes nos domínios imprimidos Dlk1/Dio3 mudaram em ambos os tecidos; Dlk1, Rtl1 e Dio3 são upregulados no testículo enquanto Dlk1 e Dio3 também são upregulados no tecido pulmonar. Sequenciamento de PCR com bisulfito de pulmão e testículo de camundongos machos adultos foram majoritariamente hipometilados, com alguns CpGs hipermetilados. Estes achados indicam que nanopartículas desempenham papel importante na metilação de DNA de genes imprimidos.

Introdução

Dióxido de silício é um óxido de silício com fórmula química SiO₂, mais comumente encontrado na natureza como quartzo e em vários ambientes orgânicos [1]. Nanopartículas projetadas têm sido amplamente disseminadas no rápido crescimento e aplicação da nanotecnologia em indústrias de alta tecnologia. Esta nanopartícula em particular é amplamente usada em uma gama de produtos de consumo incluindo eletrônicos, produtos plásticos, médicos, cosméticos e materiais de revestimento devido às suas propriedades físico-científicas como grande área de superfície específica, sítios reativos abundantes, alta energia de superfície, ligações químicas insaturadas, forte capacidade de adsorção e forte tendência a interagir com metais e matéria orgânica, alterando contaminantes e seu transporte no ambiente [2]. A presença de NPs de SiO₂ em uma ampla gama de consumíveis aumenta sua probabilidade de serem liberadas no ambiente e entrarem em contato com a população humana.

Estudos experimentais prévios mostraram que uma única instilação intratraqueal ou injeções intraperitoneais múltiplas de uma espécie de nanopartícula de metal e óxido metálico causam efeitos tóxicos de níveis celulares a sistêmicos e organismicos [3]. Tratamento com NPs de SiO₂ reprime o crescimento de linhagens de células de câncer de mama aumentando apoptose e reduzindo motilidade celular. Além disso, a exposição a NPs de SiO₂ perturba significativamente o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) [4]. Quando modelos de ratos foram tratados com três tamanhos diferentes de NPs de TiO₂ e comparados com controles, fluido de lavado broncoalveolar (BALF) tratado com aglomerados grandes (> 100 nm) induziu resposta inflamatória aguda, enquanto aglomerados pequenos (< 100 nm) produziram estresse oxidativo significativo e citotoxicidade [5].

O estudo da toxicidade de nanopartículas na reprodução é um campo em crescimento. Um estudo demonstrou que sob a mesma dose de tratamento, NPs de Ni induziram maior toxicidade reprodutiva em C. elegans que MPs (micropartículas) de Ni. Estas toxicidades reprodutivas observadas em C. elegans incluíram tamanho de ninhada reduzido, ovo fertilizado e ativação de espermátides [6]. Há evidências crescentes de que certos efeitos ambientais podem ser passados à prole via vias paternas sem mudanças no genoma do esperma [7, 8]. A informação paterna existe não apenas no genoma, mas também em marcadores epigenéticos específicos, conteúdo de mRNA e RNA não codificante.

Estresse oxidativo é um mecanismo importante na toxicidade de nanopartículas, que pode desencadear danos no DNA, inflamação, desnaturalização de proteínas e peroxidação lipídica [9]. Estes efeitos biológicos são influenciados pelas propriedades físico-químicas das nanopartículas, incluindo seu tamanho, área de superfície, forma, química de superfície, funcionalização e solubilidade [10, 11]. Há evidências crescentes que demonstram claramente que a exposição a nanopartículas pode desencadear alterações epigenéticas em tecidos e células mesmo em doses baixas, não citotóxicas [12, 13]. Epigenética é o estudo de mudanças hereditárias na função gênica que não envolvem mudanças na sequência de DNA incluindo metilação de DNA, imprinting gênico, modificações de histonas e regulação por RNAs não codificantes [14]. Tais alterações epigenéticas estão associadas ao desenvolvimento e progressão de numerosos estados patológicos e doenças [15]. Portanto, efeitos epigenéticos são uma parte crucial da triagem de risco do paciente a nível celular.

O domínio imprimido Dlk1/Dio3 contém três regiões diferencialmente metiladas (DMRs) conhecidas que são metiladas paternamente: DMR intergênico (IG-DMR), DMR 3 expresso maternamente (Gtl2-DMR) e DMR Dlk1 [16]. Estudos prévios sugerem que o IG-DMR dita o status de metilação alélica do promotor DMR Gtl2, que então controla a expressão gênica em todo o cluster [17]. O genoma do camundongo tem um grande número de genes imprimidos no domínio Dlk1/Dio3 na região distal do cromossomo 12. O IG-DMR localizado entre o gene imprimido Dlk1 e Gtl2 é especificamente metilado na linhagem germinativa masculina e regula a expressão alélica específica dos pais da região do gene imprimido [18]. O status de metilação do IG-DMR é estabelecido antes do nascimento e é assim mantido durante a vida de um macho na linhagem germinativa masculina durante a diferenciação de células germinativas masculinas, significando que a metilação IG-DMR é mantida em espermatogônias e espermatócitos de testículo maduro.

Nosso objetivo foi encontrar as mudanças na expressão gênica da linhagem germinativa masculina durante a espermatogênese antes do silenciamento transcripcional e translacional para explicar a influência paterna na prole através das mudanças ambientais. Fatores ambientais podem modificar modificações transcripcionais do esperma, que podem levar a alterações no desenvolvimento da prole. Para realizar esta investigação em nosso trabalho, usamos linhagens celulares e camundongos como modelos para triagem dos efeitos tóxicos de NPs de SiO₂. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo demonstrando os mecanismos epigenéticos das regiões imprimidas Dlk1/Dio3 que nanopartículas causam dano em ambos os tecidos pulmonar e testicular.

Métodos

Animal Experimental

O manejo animal foi realizado de acordo com o Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório sob o protocolo de uso animal correspondente na Universidade Médica de Nanjing. Camundongos foram obtidos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Todos os animais foram mantidos a 23 °C com ciclo de luz de 12 h. Água esterilizada e ração para roedores foram consumidas pelos camundongos à vontade. Atividade e comportamento dos camundongos foram monitorados diariamente. Após 2 semanas, camundongos foram injetados com SiO₂ nano-dimensionado 12,5 mg/kg.

Químicos

SiO₂ nano-dimensionado (99,5% base traço metálico, tamanho de partícula 10–20 nm) foi obtido da Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). Nanopartículas foram suspensas em Meio RPMI 1640 para criar uma solução estoque, dispersas por vibração ultrassônica por 20 min, diluídas para concentrações apropriadas e dispersas por mais 20 min.

Características de NPs de SiO₂

O tamanho e potencial zeta foram registrados usando um Malvern Zetasizer Nano ZSP.

Extração de RNA e qRT-PCR

Amostras de pulmão e testículo foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e então armazenadas a -80 °C após cerca de 4 h. Descongelamos as amostras antes de extrair as amostras.

O RNA total foi isolado das amostras usando 1 mL de Reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies Co, EUA). A mistura foi ultrassonificada a 80% de potência por 5 min, adicionou-se 0,2 mL de clorofórmio, e em seguida foi centrifugada a 12.000g/min a 4 °C por 15 min. Então, três etapas de purificação fenol/clorofórmio foram adicionadas para se livrar de proteínas. Então, usamos absorbância UV para medir conteúdo e qualidade de RNA de cada amostra a 260 e 280 nm. As sequências de primers de mRNAs são mostradas no Arquivo Adicional 1: Tabela S1 e S2. qRT-PCR foi realizada usando as instruções do fabricante, como descrito anteriormente [19]. PCR em tempo real foi realizado usando SYBR Green (Vazyme). O ciclo de PCR foi o seguinte: desnaturalização inicial a 95 °C por 30 s, seguido por 40 ciclos de desnaturalização a 95 °C por 15 s, anelamento a 60 °C por 15 s e extensão a 72 °C por 30 s. A quantidade de genes alvo foi analisada usando o método 2^-ΔCt após normalização com β-actina.

Extração de DNA, Tratamento com Bisulfito e Sequenciamento PCR com Bisulfito

DNA foi isolado de tecidos testiculares e pulmonares usando um kit de DNA (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. No.51304; EUA) seguindo as recomendações do fabricante. Conversão com bisulfito de 500 ng de todo DNA genômico foi alcançada usando um kit (EpiTect® Bisulfite kit; Qiagen. No. 59104; EUA) seguindo as recomendações do fabricante. Diferentes oligonucleotídeos de metilação CpG foram projetados usando software Methyl Primer Express v1.0 e as sequências são P1-F 5′-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3′, P1-R 5′-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3′; P2-F 5′-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3′, P2-R 5′-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3′; P3-F 5′- TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3′, P3-R 5′- ACCCATAACAAACCACAACA-3′; P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3′, P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3′.

Cada amostra de DNA foi amplificada por PCR da seguinte forma: 2,5 μl 10 × buffer PCR mistura de reação PCR com 500 ng DNA tratado com bisulfito, 0,5 μl cada de primers forward e reverse, 0,5 μl dNTP Mix, 0,5 μl rTaq (500 U, dNTP, Mg²⁺) (Takara Bio, Tokyo, Japão), adição de ddH₂O até volume de 25 μl. Após ativação da polimerase a 94 °C por 10 min, foi seguido por 40 ciclos da seguinte sequência: 30 s a 94 °C, 30 s a 58 °C, 1 min a 72 °C, e extensão final a 72 °C por 10 min.

Cultura Celular e Tratamento

Células A549 foram compradas da ATCC (Manassas, VA, EUA) e foram cultivadas em 1640 suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) a 37 °C e 5% CO₂ em incubadora umidificada. As células foram semeadas em placas de 96 poços, incubadas com diferentes concentrações de NPs de SiO₂: 62,5, 125, 250, 500, 1000 e 2000 μg/ml por 24 h.

Ensaio de Viabilidade Celular

Viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de proliferação CCK8. As células foram semeadas a densidade de 1,5 × 10⁴ por poço em placa de 96 poços e incubadas durante a noite. Após exposição a NPs de SiO₂ em diferentes concentrações, 100 μl de CCK8 foram adicionados a cada poço, e as células foram incubadas por 30 min a 37 °C para permitir metabolismo do CCK8. Por fim, absorbância foi determinada a 450 nm. As taxas de inibição celular foram calculadas e transformadas em IC₅₀ usando SPSS 15.0.

Análise Estatística

Todos os cálculos foram realizados usando o software SPSS 15.0. Comparações entre grupos foram feitas usando testes t não relacionados e teste qui-quadrado de Pearson para BSP. Os dados são apresentados como média ± DP. Em todos os casos, valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Caracterização de NPs de SiO₂

Caracterizamos NPs de SiO₂ sob condições experimentais. O raio hidrodinâmico médio e potencial zeta de NPs de SiO₂ em meio de cultura foram 371,77 ± 18,46 nm e 18,83 ± 2,12 mV, respectivamente (Fig. 1).

Caracterização de NPs de SiO₂ em suspensão. Partículas foram suspensas em meio de cultura celular com 10% FBS. a, b Tamanho e potencial zeta de NPs de SiO₂ foi avaliado por Zetasizer Nano ZSP. c Viabilidade celular foi determinada por ensaio CCK8 após exposição a várias concentrações de NPs de SiO₂ por 24 h. Médias ± DP de experimentos duplicados, cada um consistindo de três replicatas técnicas. *** p < 0,001

Efeito de NPs de SiO₂ na Linhagem Celular A549

Para determinar a toxicidade de NPs de SiO₂, realizamos um teste de proliferação com células A549, para determinar o IC₅₀ de NPs de SiO₂ em células A549. Como ilustrado na Fig. 1c, NPs de SiO₂ diminuem a viabilidade de células A549 de maneira dependente da concentração. A redução na viabilidade celular é significativa em concentração de NPs de SiO₂ superior a 62,5 μg/ml (p < 0,001). O IC₅₀ 24 h de um químico é definido como concentração que afeta 50% das células após 24 h de exposição. O IC₅₀ 24 h determinado para NPs de SiO₂ foi 4942 μg/ml.

Efeitos de NPs de SiO₂ em Pulmão e Testículo Murinos

Determinamos se a exposição a NPs de SiO₂ na dose de 12,5 mg/kg peso corporal levaria a dano de membrana pulmonar e até dano testicular em nosso modelo de camundongo. Como mostrado nas figuras, a exposição a NPs de SiO₂ levou a corpo lamelar desorganizado em seções histológicas do pulmão (Fig. 2a, b) e dano de cristas mitocondriais em comparação ao grupo controle no testículo (Fig. 2c, d). Então investigamos os efeitos de NPs de SiO₂ no pulmão e testículo na ativação do imprinting na região imprimida Dlk1/Dio3.

Imagens MET de tecidos pulmonar e testicular de ratos expostos a NPs de SiO₂. a Morfologia foi avaliada em tecidos pulmonares por MEV em controles. b Morfologia foi avaliada em tecidos pulmonares por MEV em grupo tratado. c Morfologia foi avaliada em tecidos testiculares por MEV em controles. d Morfologia foi avaliada em tecidos testiculares por MEV em grupo tratado. Barras de escala representam 2,0 µm

Expressão dos Genes Imprimidos no Pulmão e Testículo Murinos

Para ilustrar as mudanças no pulmão e testículo, detectamos os genes imprimidos nestes tecidos. Escolhemos 24 genes imprimidos; eles foram Dio3, Ddc, Dlk1, Gpr1, Gtl2, H19, Igf2, Igf2as, Igf2r, Inpp5f, Magel2, Magi2, Mest, Mir296, Mir298, Ndn, Nnat, Peg10, Plagl1, Pwcr1, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn e Snurf. Treze destes genes são expressos em ambos pulmão e testículo: Dio3, Dlk1, Gpr1, Gtl2, Igf2r, Igf2, Inpp5f, Peg10, Ndn, Nnat, Rasgrf1, Rtl1 e Snrpn (Fig. 3a, b). Os genes diferencialmente expressos de foco primário estavam na região imprimida Dlk1/Dio3, que contém Dlk1, Gtl2, Rtl1 e Dio3.

Expressão de genes imprimidos no pulmão e testículo. a A expressão de genes imprimidos no pulmão. b A expressão de genes imprimidos no testículo. *P < 0,05. **P < 0,01. Teste t de Student

Expressão da Região Imprimida Dlk1/Dio3

A região imprimida Dlk1/Dio3 contém quatro genes codificadores de proteínas (Dlk1, Gtl2, Rtl1 e Dio3) no alelo herdado [20] (Fig. 4c). Para elucidar o papel da região Dlk1/Dio3 na resposta do tecido pulmonar e testicular ao tratamento com NPs de SiO₂, analisamos o padrão de metilação de DMR comparado com os controles. Diferentes genes são alvos de metilação no pulmão e no testículo. A expressão de Dlk1 e Dio3 foram upreguladas em ambos pulmão e testículo, enquanto Rtl1 foi upregulada apenas no testículo (Fig. 4a, b).

A expressão da região imprimida Dlk1/Dio3. a Os genes da região Dlk1/Dio3 expressos no pulmão. b Os genes da região Dlk1/Dio3 expressos no testículo. c Esquema da região Dlk1/Dio3. *P < 0,05. **P < 0,01. Teste t de Student

A Metilação das Regiões DMR Dlk1/Dio3

Para investigar ainda se a expressão dos genes muda em resposta à metilação de DNA, abordamos o status de metilação desta região no pulmão e testículo do camundongo. Na análise de metilação de DNA, determinamos as sequências das três seções de ilhas CpG. No testículo, elas são hipometiladas; no entanto, na ilha CpG 1, elas são significativamente hipermetiladas (Fig. 5). No pulmão, a metilação total é a mesma que no testículo, enquanto a ilha CpG 2 mostrou hipermetilação (Fig. 6).

A metilação das regiões DMR Dlk1/Dio3 no testículo. a A metilação da ilha CpG 1 nos tecidos controle e tratados. b A metilação da ilha CpG 2 nos tecidos controle e tratados. c A metilação da ilha CpG 3 nos tecidos controle e tratados

A metilação das regiões DMR Dlk1/Dio3 no pulmão. a A metilação da ilha CpG 1 nos tecidos controle e tratados. b A metilação da ilha CpG 2 nos tecidos controle e tratados. c A metilação da ilha CpG 3 nos tecidos controle e tratados

Discussão

O uso crescente de nanomateriais levantou preocupações sobre impactos potenciais na saúde humana e impactos ambientais. Estudos prévios demonstraram que NPs de SiO₂ podem causar danos pulmonares e cardiovasculares, como inflamação pulmonar e dano isquêmico miocárdico em ratos velhos [21]. Além disso, nanopartículas podem ter efeito em linhagens germinativas, pois tais células pareciam ser mais sensíveis aos efeitos tóxicos de NPs de Ag e demonstraram efeitos adversos após exposição a doses menores. Exposição a NPs de Ag aumentou o número de anomalias observadas em células espermáticas de ratos e reduziu a integridade do acrossomo e membrana plasmática além de reduzir atividade mitocondrial [22]. Nossa investigação é parte de uma série de estudos usando uma plataforma experimental para avaliar o potencial de nanopartículas de atingir organismos machos e até sua prole não exposta.

Em nosso estudo in vitro prévio, relatamos que exposição de curto prazo a algumas nanopartículas resulta em apoptose celular e expressão aberrante de genes imprimidos em células de Sertoli TM-4. Estes achados demonstram que expressão anormal de genes imprimidos pode ser um mecanismo subjacente para nanopartículas induzirem toxicidade reprodutiva [23]. Além disso, em nosso estudo in vivo prévio, alguns fatores ambientais, como desreguladores endócrinos, também promovem um fenótipo ou estado de doença não apenas no indivíduo exposto mas também em gerações sucessivas de prole. Epimutações na linhagem germinativa que se tornam permanentemente programadas podem permitir transmissão de fenótipos epigenéticos transgeracionais [19]. O objetivo deste estudo foi investigar mudanças feitas no estado epigenético por tratamento com NPs de SiO₂ em modelo murino para estabelecer a base mecanística dos efeitos transgeracionais masculinos.

Estado epigenético é um termo usado para definir modificações químicas que ocorrem dentro de um genoma sem alterar a sequência de DNA [24]. Mecanismos epigenéticos, incluindo metilação de DNA, genes imprimidos, modificações de histonas e expressão de RNA não codificante, podem afetar a função genômica em um ambiente exógeno [25]. Para nosso conhecimento, nosso estudo é o primeiro a investigar NPs de SiO₂ induzindo toxicidade pulmonar e testicular a nível epigenético.

Primeiro examinamos a toxicidade aguda de NPs de SiO₂ em células A549, uma linhagem de células epiteliais pulmonares humanas. No entanto, nossos achados em camundongos experimentais revelaram lesão em células epiteliais laminares tipo II do pulmão e lesão de crista mitocondrial testicular após contato com NPs de SiO₂ em concentrações ambientais [26]. Para melhor entender o mecanismo da patologia pulmonar e testicular, expressamos genes imprimidos. Imprinting genômico refere-se a silenciamento de um alelo parental em zigotos de gametas dependendo da origem parental; este silenciamento ocorre via processos epigenéticos como metilação de DNA e/ou modificação de histonas [27]. Estudos prévios mostraram que expressão de genes imprimidos no domínio Dlk1/Dio3 é importante para crescimento fetal [28], tempo da puberdade humana [29] e suscetibilidade a doenças metabólicas [30]. Estudos sugeriram que o IG-DMR dita o status de metilação alélica do promotor DMR Gtl2, que então controla a expressão gênica em toda a região Dlk1/Dio3 [17]. A principal função desta região de controle imprimida é herdar metilação de DNA impulsionada por células germinativas como sinal gamético, e depois manter subsequentes padrões de metilação de DNA alélico-específicos dentro de células somáticas [31]. Nosso estudo demonstrou que NPs de SiO₂ induzem mudanças na expressão da região Dlk1/Dio3 tanto em tecidos pulmonar quanto testicular. Na região Dlk1/Dio3, os genes expressos paternamente (Dlk1, Rtl1 e Dio3) são particularmente anormais comparados com os controles após tratamento com NPs. Resultados de sequenciamento com bisulfito exibem diferentes níveis de hipometilação no pulmão e testículo. O estado de metilação do IG-DMR é geralmente menor em tecidos tratados, e esta hipometilação pode representar o mecanismo de expressão diferencial de genes imprimidos.

Conclusões

Em conclusão, nossos resultados indicam que a exposição a NPs de SiO₂ pode induzir importantes mudanças de metilação de DNA que desencadeiam danos celulares e que estas mudanças são altamente importantes para a expressão do cluster de genes imprimidos Dlk1/Dio3. Importante, as mudanças na metilação de DNA afetam tanto os tecidos pulmonar quanto testicular. Estes resultados desempenham papel importante em nossa pesquisa futura examinando os efeitos epigenômicos das nanopartículas herdados pela prole de modelos expostos e o esclarecimento dos mecanismos moleculares que medeiam tais alterações epigenéticas.

Abreviações

BALF:

Fluidos de lavado broncoalveolar

CCK-8:

Kit de contagem celular-8

DMRs:

Regiões diferencialmente metiladas

EGFR:

Receptor do fator de crescimento epidérmico

IG-DMR:

DMR intergênico

MPs:

Micropartículas

NPs:

Nanopartículas