Nanoestruturas de ouro em crescimento para absorção celular seletiva de forma

Resumo

Com o desenvolvimento da síntese de nanoestruturas (NSs) de ouro dependentes de forma e tamanho (Au) e suas aplicações na nanomedicina, um dos maiores desafios é entender a interação dessas formas com as células cancerígenas. Aqui, estudamos a interação de Au NSs de cinco formas diferentes com células de glioblastoma-astrocitoma. Três formas diferentes (nanobastões, tetrahexahedra e bipiramidas), possuindo propriedades ópticas ajustáveis, foram sintetizadas por uma abordagem de crescimento mediado por sementes de etapa única empregando misturas de surfactantes binários de CTAB e um surfactante secundário. Com o uso da abordagem mediada por sementes em duas etapas, obtivemos novos NSs, denominados nano makura ( Makura é uma palavra japonesa usada para travesseiro), que é relatada pela primeira vez aqui. Nanopartículas esféricas de Au foram preparadas pelo método de Turkevich. Para estudar as interações das células NS, funcionalizamos os NSs usando PEG tiolado seguido por ácido 11-mercaptoundecanóico. A influência da forma e concentração de NSs na citotoxicidade foi avaliada com um ensaio LIVE / DEAD em células de glioblastoma-astrocitoma. Além disso, a captação dependente do tempo de nano makura foi estudado com TEM. Nossos resultados indicam que, ao contrário das outras formas estudadas aqui, a nano makura foram absorvidos por endocitose mediada por receptor e macropinocitose. Assim, a partir de nossa biblioteca de diferentes NSs com funcionalidade de superfície semelhante, a forma é considerada um parâmetro importante para a absorção celular.

Histórico

As nanoestruturas de ouro (NSs) têm sido utilizadas em diversas aplicações biomédicas devido às suas propriedades óticas e eletrônicas dependentes de forma e tamanho [1]. Os Au NSs exibem ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) modificável e ambientalmente sensível [2]. Au LSPR dentro da faixa visível os torna candidatos adequados para biossensores e bons agentes de contraste para tomografia computadorizada (TC) [3, 4], bem como imagens fotoacústicas [5]. Os NSs com razões de aspecto ainda mais altas (ARs, definidos como a razão das dimensões longitudinais às transversais) espalham a luz de forma mais eficiente no comprimento de onda do plasmon longitudinal e podem, portanto, ter um desempenho melhor em aplicações de imagem óptica do que NPs esféricos. SNs menores aumentaram a eficiência de absorção, resultando em maior eficiência na terapia fototérmica [6,7,8,9]. Além disso, estruturas anisotrópicas foram recentemente usadas para formar estruturas automontadas com propriedades plasmônicas superiores que resultam de têmpera eficiente, absortividades molares extremamente altas para o desenvolvimento de campos eletromagnéticos intensos e altamente localizados [10,11,12,13]. Sendo capaz de ajustar a proporção de aspecto e tamanho de Au NSs, diferentes estruturas podem ser sintetizadas para atender a diversas aplicações, incluindo aquecimento localizado, detecção, encapsulamento e liberação de moléculas alvo, entre outros [14,15,16].

Au NSs são tipicamente sintetizados usando eletrotemplante [17], técnica de redução fotoquímica [18] ou crescimento semeado - com ou sem Ag [19, 20]. Nos últimos anos, a síntese do crescimento semeado tornou-se sujeito a modificações adicionais, usando aditivos orgânicos ou misturas de surfactantes binários para permitir o controle sobre o crescimento NS [21,22,23,24,25]. As condições de síntese empregadas permitem ajustar as propriedades dos Au NSs ajustando seu tamanho e forma, alterando as seções transversais de espalhamento e absorção dos NSs. Quando os NSs são introduzidos em um ambiente biológico, as propriedades físico-químicas desses Au NSs (tamanho, forma e química da superfície) desempenham um papel vital na absorção celular, ou seja, na interação nanopartícula-célula. A compreensão de tal interação é essencial para explorar novas aplicações biomédicas explorando Au NSs de diferentes formatos [26,27,28,29,30]. Por exemplo, nanobastões de Au podem ser empregados para induzir hipertermia celular em células cancerosas com a possibilidade de interferir nas funções celulares e, em alguns casos, alterá-las por meio de modificação da superfície dos bastonetes [30,31,32,33,34]. Chen et al. relataram que nanocages de Au podem ser usados ​​para destruição fototérmica direcionada de células de câncer de mama [35]. Além disso, relatórios recentes demonstraram que a forma das nanopartículas pode ser tão ou mais determinante para a absorção celular do que o tamanho [36, 37]. Isso requer a triagem de várias formas (isto é, a interação de Au NSs de várias formas com a célula) sob outras condições idênticas importantes para descrever in vitro . Até onde sabemos, não existe um estudo abrangente que investigue a interação de Au NSs de diferentes formas além de esferas e nanobastões com a célula [38, 39].

Aqui, investigamos as interações de cinco Au NSs de formas diferentes com células de glioblastoma-astrocitoma e sua captação celular. O glioblastoma multiforme (GBM) é classificado como um dos tumores cerebrais malignos humanos mais agressivos. Os pacientes que sofrem de GBM têm um prognóstico sombrio, com um tempo médio de sobrevivência de menos de 15 meses com quimioterapia e tratamento padrão [40, 41]. O glioblastoma-astrocitoma é especialmente interessante para estudos de captação, não apenas do ponto de vista médico, mas também por causa de seu rápido crescimento. As culturas de células de glioblastoma-astrocitoma têm um tempo de duplicação da população de 32 he precisam continuamente de nutrientes extracelulares. Devido a isso, eles são altamente propensos a engolfar rapidamente objetos estranhos, como Au NSs, que se abrem, por exemplo, para ablação de tumor hipertérmico [42], marcação de células ou distribuição de drogas.

No presente trabalho, cinco formas diferentes de Au NSs foram sintetizadas:quatro NSs anisotrópicos (nanorods –– NRs, nano makura–– NM, tetrahexahedra –– THH, bipiramidas –– BPs) por uma abordagem de crescimento mediado por sementes usando misturas de surfactantes binários e partículas esféricas (SP) usando um método de Turkevich modificado [43]. A forma dos NSs pode ser ajustada variando a proporção de dois surfactantes diferentes. Quando um protocolo de crescimento mediado por sementes em duas etapas foi seguido, Au nano makura ( Makura é japonês para travesseiro ) foi sintetizado. Uma modificação de superfície em duas etapas foi realizada para substituir o ligante passivador por ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA) antes que os Au NSs fossem co-incubados com células de glioblastoma-astrocitoma. Os efeitos da forma e concentração na citotoxicidade e absorção de NSs em células de glioblastoma-astrocitoma foram avaliados.

Experimental

Materiais

O ácido oleico (OA, 90%) foi adquirido na Alfa Aesar. Nitrato de prata (AgNO ₃ ), brometo de didecildimetilamônio (DDAB, 98%), ácido cloroáurico (HAuCl ₄ .3H ₂ O, 99,999%), ácido D - (-) - isoascórbico (AsA, 98%), boro-hidreto de sódio (NaBH _4, ≥ 96%), ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA, 98%) e O- [2- (3-mercaptopropionilamino) etil] -O-etilpolietilenoglicol (PEG-SH) de peso molecular 5000 Da foram adquiridos da Sigma-Aldrich . O brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB, 99% +) foi adquirido da Acros Organics e o citrato de sódio di-hidratado (Na-citrato, grau ACS) da Merck. Todos os produtos químicos foram utilizados como recebidos sem purificação adicional. Todas as soluções foram preparadas usando água destilada desionizada (resistividade ~ 18,2 μΩ-cm) purificada pelo sistema de purificação de água Simplicity® Millipore.

Síntese de Au anisotrópico

Au NSs anisotrópicos foram sintetizados usando um método de crescimento semeado assistido por Ag, empregando surfactantes binários (Tabela 1). A Figura 1a mostra um esquema do método de síntese empregado para o crescimento de NRs, THH e BPs.

Esquemas de síntese de Au NSs. a Esquema mostrando o mecanismo de crescimento semeado assistido por Ag usado para a síntese de diferentes formas de Au NSs. b Esquema mostrando um mecanismo de crescimento de duas sementes para nano makura

Em resumo, 5 mL de 0,5 mM HAuCl ₄ .3H ₂ 0 foi primeiro misturado com 5 mL de solução 0,2 M de CTAB e deixado em agitação. Depois disso, 1,6 mL de 3,75 mM NaBH ₄ foi adicionado à mistura e deixou-se reagir durante 2 min com agitação a fim de permitir o escape do gás formado durante a reação. A solução de sementes foi usada para crescimento posterior, após esperar 30 min.

Em uma reação de crescimento típica, 15 mL de uma mistura aquosa de CTAB e co-surfactante em várias proporções foi feito a 80 ° C, conforme relatado na Tabela 1. Após o resfriamento da solução surfactante à temperatura ambiente, 750 μL de solução 4 mM de AgNO ₃ foi adicionado e deixado a agitar durante 15 min a 35 ° C. Seguiu-se a adição de 15 mL de HAuCl 1 mM ₄ .3H ₂ O e deixou-se misturar sob agitação por mais 15 min. Depois disso, 135 μL de 0,063 M de AsA e 96 μL de sementes de Au foram adicionados, e a reação funcionou por 24 h a 35 ° C. Os produtos foram separados por centrifugação. É importante notar que, no caso de OA, a cor amarela inicial da solução de crescimento descarrega em 15 minutos (antes da adição da semente), indicando a redução de Au ³⁺ para Au ⁺ . A Figura 1b mostra o esquema para a síntese do NM, que se baseia em uma abordagem de crescimento de duas sementes. O protocolo seguido é semelhante ao relatado acima, exceto para a adição de solução de crescimento intermediário (300 μL) (obtido quase imediatamente após a adição de sementes de Au à primeira solução de crescimento), em vez das sementes regulares, a uma solução de crescimento fresco e permitindo a reação para continuar por 24 h a 35 ° C.

Síntese de Au NSs esféricos

Os Au NSs esféricos foram sintetizados usando um método de Turkevich modificado [44]. Em uma síntese típica, 10 mL de solução de citrato de sódio 10 mM foram adicionados a um frasco de reação de 25 mL, mantido a 70 ° C. Dez mililitros de ácido cloroáurico 1,5 mM (HAuCl ₄ . 3H ₂ O) foi adicionado gota a gota e deixou-se reagir durante 20 min sob agitação vigorosa a 70 ° C. A solução tornou-se vermelho púrpura cerca de 8 minutos após a reação. Em seguida, a solução foi resfriada até a temperatura ambiente e os Au NSs esféricos foram separados da solução que não reagiu, usando centrifugação a 14.500 rpm por 10 min.

Funcionalização de superfície de Au NSs

Para trocar os ligantes na superfície dos Au NSs, um procedimento de duas etapas adaptado e modificado de Thierry et al. [45] foi seguido. As concentrações dos NSs sintetizados foram ajustadas para 1 mg mL ⁻¹ antes do início das etapas de funcionalização. A primeira etapa depende da introdução de uma camada de PEG-SH para substituir parcialmente a bicamada CTAB ligada, uma vez que o tiol tem uma afinidade maior pela superfície de Au [46]. Além disso, uma camada de PEG-SH fornece estabilização estérica ao NS. Na segunda etapa, o CTAB residual é substituído e a camada de PEG-SH é posteriormente trocada por alcanotiol, MUA. O MUA permite a remoção completa de CTAB da superfície de Au revestida com PEG-SH estericamente obstruída.

Em um procedimento de funcionalização típico, 1 mL de 1 mg mL ⁻¹ solução do Au NS foi misturada com 1 mL de 1 mg mL ⁻¹ solução da solução PEG-SH. A solução misturada foi mantida sob agitação vigorosa permitindo a substituição parcial de CTAB por PEG-SH por 2 h. Depois disso, os NSs PEGuilados foram removidos por centrifugação a 14.500 rpm por 20 min e redispersos em 1 mL de água MQ. Para funcionalizar os Au NSs com grupos de ácido carboxílico, 500 μL da solução NS PEGuilada foram misturados com 250 μL de uma solução 10 mM de MUA preparada em etanol / água e deixada reagir em um banho sônico mantido a 55 ° C por 1 h . Depois disso, os Au NSs revestidos com MUA foram separados do MUA livre usando centrifugação a 14.500 rpm por 20 min. Au NSs revestidos com MUA foram facilmente redispersos em água MQ.

Estudos in vitro

Cultura de células de glioblastoma-astrocitoma

Células de glioblastoma-astrocitoma humano (U-87 MG, ECACC, Sigma-Aldrich, Salisbury, Reino Unido) foram cultivadas em Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) com 1,25% de gentamicina (Sigma) e 10% de soro fetal bovino (Autogen Bioclear, Wiltshire, REINO UNIDO). As culturas foram suplementadas com 2 mM de L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA, Sigma) e 1 mM de piruvato de sódio (NaP, Sigma).

Ensaio LIVE / DEAD®

Um ensaio de viabilidade celular LIVE / DEAD (Invitrogen, Life Technologies) avalia a integridade da membrana das células e consiste em dois corantes diferentes:calceína AM (excitação / emissão 494/517 nm) e homodímero-1 de etídio (excitação / emissão 517/617 nm). Em células vivas, as esterases intracelulares reagem com a calceína AM e produzem uma fluorescência verde citoplasmática. O homodímero de etídio-1 (EthD-1) difunde-se sobre as membranas celulares danificadas das células mortas, onde se liga aos ácidos nucléicos e emite fluorescência vermelha. Após a marcação com NSs, a viabilidade das células LIVE / DEAD® foi realizada em células de glioblastoma-astrocitoma conforme descrito pelo fabricante. Resumidamente, uma solução LIVE / DEAD® foi preparada em 4,5 mL de PBS com 2,7 μL de calceína (Invitrogen) e 12 μL de homodímero de etídio (Invitrogen) foram adicionados a 1:1 ( v / v ) e deixada reagir por 30 min a 37 ° C antes da microscopia. Uma coloração nuclear (Hoechst 33258, excitação / emissão 356/465 nm, Sigma) foi adicionada (200 μg mL ⁻¹ ), a fim de visualizar o núcleo e elucidar qualquer captação nuclear de Au NS. As imagens foram realizadas em um microscópio fluorescente Axiovert 200 M (Zeiss, Alemanha), em ampliações de 40 ou 10 ×, usando AxioVision Rel. 4.3 software. As imagens foram posteriormente processadas com ImageJ 1.46.

Avaliação da toxicidade celular com base na concentração

As células a 70% de confluência foram marcadas com Au NS em concentrações de NS / volume de mídia de 100 μg mL ⁻¹ , 200 μg mL ⁻¹ , 500 μg mL ⁻¹ e 2 mg mL ⁻¹ e incubado a 37 ° C por 24 h em placas de 9 poços (Corning®). Três paralelos (poços) foram preparados para cada concentração. Culturas de glioblastoma-astrocitoma não marcadas, no mesmo estágio de confluência, foram utilizadas como controle. As percentagens de células mortas foram calculadas por contagem manual. A morfologia altamente desordenada das células de glioblastoma-astrocitoma torna a contagem automatizada menos confiável. Três imagens sobrepostas de células vivas e mortas foram obtidas em cada poço, e a média de células vivas e mortas foi calculada para cada forma. O mesmo foi feito para a amostra em branco, e a viabilidade foi avaliada subtraindo a média de mortos / vivos do branco.

Avaliação da captação celular em função do tempo para nano makura Au NS

As células a 70% de confluência foram marcadas com nano makura Au NS em concentrações de NS / volume de mídia de 2 mg mL ⁻¹ e incubado a 37 ° C por 2, 6, 12 e 24 h antes do ensaio LIVE / DEAD® com coloração nuclear. Culturas de glioblastoma-astrocitoma não marcadas, no mesmo estágio de confluência, foram utilizadas como controle. Os sedimentos celulares foram preparados para TEM via tripsinação e centrifugação antes da fixação primária em paraformaldeído (2% v / v ) e glutaraldeído (2,5% v / v ) em PBS (0,1 M, pH =7,4) durante a noite. Para a fixação secundária, dois fixadores diferentes foram preparados para a coloração ideal das membranas intracelulares. Ambos foram preparados em tampão cacodilato 0,1 M, um contendo 1% de tetróxido de ósmio ( v / v ) e o outro contendo 1% de tetróxido de ósmio ( v / v ) e 1,5% de ferrocianeto de potássio ( v / v ) Uma hora após a fixação secundária em temperatura ambiente, foi realizada uma desidratação gradativa com álcool, antes da desidratação com óxido de propileno, infiltração e corte em ultramicrótomo de cortes de 70 nm.

Técnicas de caracterização

Imagens STEM de campo claro (BF) foram adquiridas usando um microscópio eletrônico Hitachi S-5500 operando a uma tensão de aceleração de 30 kV. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) foram adquiridas usando JEOL 2100 operando a 200 kV. As distribuições de tamanho e potenciais zeta dos NSs foram medidos usando um instrumento Malvern Zetasizer Nano-ZS e o próprio software do fabricante. As medições de espalhamento dinâmico de luz (DLS) são baseadas na suposição de partículas esféricas e não são apropriadas para medir os tamanhos hidrodinâmicos de NSs anisotrópicos sem uma configuração de múltiplos ângulos e ajuste rigoroso dos dados resultantes. No entanto, o DLS foi usado neste estudo como um meio de rastrear qualitativamente as mudanças no tamanho que emanam do procedimento de funcionalização. Água MQ foi usada como solvente em todos os casos. Os espectros de ultravioleta-visível (UV-Vis) foram adquiridos com um espectrofotômetro UV-2401PC (Shimadzu). Os espectros foram coletados na faixa espectral de 200 a 800 nm. As análises de espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) foram realizadas usando um espectrômetro Kratos Axis Ultra DLD (Kratos Analytical, Reino Unido), equipado com uma fonte de raios-X monocromatizada de alumínio (Al, hν =1486,6 eV) operando a 10 mA e 15 kV ( 150 W). Os espectros de pesquisa foram coletados na faixa de energia de ligação de 0–1100 eV com energia de passagem do analisador de 160 eV. Um modo de lente híbrida (eletrostática e magnética) foi empregado junto com uma área de análise de aproximadamente 300 μm x 700 μm.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização de Au NSs anisotrópicos

Au NSs anisotrópicos foram sintetizados por meio de uma abordagem de crescimento mediado por sementes, empregando misturas de surfactantes binários. Quando sementes de Au cobertas por CTAB (~ 5 nm) foram adicionadas à solução de crescimento de misturas de surfactantes binários (razão molar de OA CTAB ~ 20:1), NRs de Au de baixa razão de aspecto se formaram (Fig. 2a e Tabela 2). A imagem HRTEM revelou a morfologia cristalina única e osso de cão dos NRs (inserção na Fig. 2a). OA, um ácido graxo que também atua como um agente redutor fraco, facilita a redução de Au ³⁺ para Au ⁺ . A mudança na cor da solução de crescimento de amarelo para transparente (~ 15 min) confirmou nossa observação. A adição adicional de ácido ascórbico à solução de crescimento aumenta a taxa de redução de Au ⁺ . Como resultado, os átomos de Au se difundem rapidamente nas facetas finais {111} [16] dos NRs porque o empacotamento de estruturas micelares mistas são menos densas em comparação com o lado {110} e a extremidade {100} dos NRs [25]. Portanto, o crescimento excessivo de NRs nas facetas {111} finais do que nas facetas {110} e {100} laterais leva à formação de NRs da morfologia do osso do cão. Nossos resultados também sugerem que as facetas {110} provavelmente não serão revestidas com Au devido à forte interação dessas facetas com as moléculas de surfactante em comparação com outras facetas. Também confirmamos o papel da OA e do ácido ascórbico na formação de Au NRs da morfologia do osso do cão. Quando a concentração de OA ou ácido ascórbico diminuiu na solução de crescimento, apenas Au NRs foram obtidos. Esses resultados indicam a diminuição na taxa de redução e taxa de difusão de átomos de ouro, levando à formação de Au NRs (arquivo adicional 1:Figura S1, ESI †).

Imagens STEM e espectros de UV-Vis de Au NSs de diferentes formas. a A imagem BF-STEM de Au NRs da morfologia do osso do cão e a imagem HRTEM na inserção mostra a natureza cristalina única dos NRs. b Imagem BF-STEM de Au NSs tetrahexaédricos alongados (a inserção é a imagem SEM). c Imagem SEM de Au BPs (a inserção é a imagem SEM de um único BP). d Imagem TEM de partículas esféricas de Au (a imagem HRTEM na inserção mostra a natureza policristalina das partículas de Au). e Imagem BF-STEM de Au NMs. f Espectros UV-vis de Au NSs de diferentes formas

Quando a concentração de OA em relação ao CTAB foi aumentada na solução de crescimento (Tabela 1), Au NSs de formato THH alongado foram obtidos (Fig. 2b e Tabela 2). A mudança na forma dos Au NSs pode ser explicada com base na modificação de estruturas micelares mistas por OA. As estruturas micelares mistas semelhantes a bastonetes são formadas em uma baixa concentração de OA. O aumento da quantidade de OA nas estruturas micelares mistas modifica sua estrutura para convexa e facilita a formação de THH Au NSs alongados. Nosso estudo anterior também revelou que um aumento na concentração de co-surfactante torna as estruturas micelares mistas mais convexas [25]. A forma dos Au NSs também pode ser alterada substituindo OA por DDAB. Obtivemos Au NSs de forma bipiramidal (BP) pelo uso de CTAB e DDAB (Fig. 2c e Tabela 2), conforme relatado em nosso trabalho anterior [25]. Além disso, partículas esféricas de Au foram sintetizadas por um método de Turkevich modificado (Fig. 2d).

Também investigamos a influência da solução de sementes na forma de Au NSs. A solução de semente foi retirada da solução de crescimento de CTAB e OA (OA:CTAB ~ 20:1) após 1 min da reação e adicionada à solução de crescimento fresca contendo OA:CTAB ~ 20:1. Au NSs de nano makura (NM) morfologia foi obtida após a conclusão da reação de crescimento (Fig. 2e). A morfologia do NM parece semelhante ao osso de cachorro. No entanto, uma vez que os NSs crescem em todas as direções, conforme mostrado nas imagens TEM feitas em ângulos diferentes (Fig. 3a e Tabela 2), portanto, chamamos esses NSs de NM. Para ilustrar o mecanismo de crescimento de Au NMs, um pequeno volume foi retirado da solução de crescimento em diferentes intervalos de tempo e a reação intermediária foi analisada usando imagens STEM (Fig. 3b). Quando as partículas de sementes revestidas com CTAB foram adicionadas à primeira solução de crescimento, a cor da solução de crescimento mudou rapidamente para violeta escuro, indicando a formação de Au NSs anisotrópicos. 300 μL de solução da primeira solução de crescimento foram adicionados à segunda solução de crescimento e, posteriormente, algumas gotas da solução foram adicionadas à grade TEM imediatamente.

Morfologia e crescimento de Au NM (nano makura ) a Imagens TEM de NM tiradas em ângulos diferentes. b Imagens BF-STEM mostram as etapas de crescimento na formação de NM tipo Au NSs. A solução retirada da solução de crescimento em diferentes pontos de tempo foi adicionada diretamente à grade TEM sem purificação

Imagens representativas de STEM mostraram um crescimento relativamente mais rápido de Au NM na direção longitudinal do que transversal (0 s). Após 30 s, NSs semelhantes à configuração de gravata borboleta foram vistos. Os NM com tamanhos finais já foram observados em torno de 3 min da reação. Não vimos nenhuma mudança adicional na forma e no tamanho dos NSs após 30 min e 8 h. Com base em nossa análise, pode-se supor que o crescimento geral de Au NMs segue um mecanismo de crescimento autocatalítico estocástico, semelhante a "pipoca", no qual as sementes individuais ficam dormentes por algum tempo antes de crescer repentina e rapidamente nas formas finais, como tem foi observada para NRs por Cortie et al. [47]. Os NMs têm uma estrutura tridimensional, mostrada por imagens HRTEM dos NMs obtidos em diferentes ângulos de rotação (Fig. 3a), ao contrário dos NSs em forma de osso de cão relatados anteriormente [48, 49].

As propriedades ópticas dos Au NSs de diferentes formatos foram medidas e os resultados são mostrados na Fig. 2f. Os Au NSs exibem características LSPR ajustáveis ​​na faixa de UV-Vis –– visível –– infravermelho próximo (IR). As bandas de plasmon se dividem em multipletos para estruturas anisotrópicas - as bandas longitudinais e transversais, devido a oscilações de ressonância ao longo de diferentes eixos. Os NRs mostram pelo menos três bandas distintas –– 516 nm, 679 nm e 796 nm, sendo a mais forte a do meio. O surgimento de uma terceira banda pode estar associado à polidispersividade dos NRs causada pelo efeito de condicionamento do ácido oleico. Isso leva à formação de nanobastões com bordas ásperas. Os picos de ressonância transversal e longitudinal (557 e 760 nm, respectivamente) são observados para NM, que tem uma superfície mais irregular do que os nanobastões. No entanto, para estruturas maiores (THH e BPs), picos de LSPR simples e amplos são observados em 568 nm e 593 nm, respectivamente. Enquanto os espectros de UV-vis para THH mostram semelhanças semelhantes com estudos anteriores [50], os dois modos para BPs parecem ser fundidos em um pico amplo, ao contrário do observado [51]. Isso pode ser atribuído a um baixo rendimento da forma de BP ou à centrifugação não seletiva de forma aplicada ao Au NS ou a um revestimento irregular que leva à anisotropia de forma em solução.

Funcionalização de superfície de Au NSs

Au NSs de diferentes formas foram funcionalizados usando um método de duas etapas - substituindo a bicamada CTAB por O- [2- (3-mercaptopropionilamino) etil] -O-metilpolietilenoglicol (PEG-SH) e subsequentemente por MUA. A Figura 4a mostra os diâmetros hidrodinâmicos dos NSs em cada estágio da funcionalização. Um aumento sequencial nos tamanhos é obtido quando comparado aos NSs revestidos com CTAB, para cada NS (exceto para BPs) indicando funcionalização bem-sucedida. Como as medições DLS são baseadas na suposição de partícula esférica, a análise de determinação de tamanho para os NSs anisotrópicos deve ser aproximada para NSs esféricos com os mesmos coeficientes de difusão que os NSs anisotrópicos.

Tamanhos e potenciais zeta de Au NSs. a Variação dos tamanhos DLS dos Au NSs após cada estágio de funcionalização. b Variação dos potenciais zeta de Au NSs com cada estágio de funcionalização. X -eixo representa a nanoestrutura Au de diferentes formas (NR nanobastões, THH tetrahexahedra, NM nano makura , BP bipiramide, SP esférico)

Isso esclarece uma ligeira diminuição no tamanho dos BPs revestidos com PEG-SH e também suporta os dados de UV-vis acima. Como resultado da funcionalização, as cargas superficiais dos NSs diminuem maciçamente, conforme mostrado na Fig. 4b. O surfactante catiônico é facilmente deslocado com PEG-SH, que é posteriormente substituído por MUA devido à maior afinidade para a superfície de Au. Devido ao pequeno tamanho do MUA, ele tem maior flexibilidade para deslocar CTAB que permanece nos NSs, mesmo após a PEGilação. Os valores de potencial zeta finais de NSs revestidos com MUA refletem superfícies carregadas negativamente para todos os NSs, exceto para NRs. Essa discrepância pode estar relacionada ao revestimento desigual dos pequenos NRs ou à sua polidispersidade e ao princípio de medição aplicado. Para os NSs esféricos, a carga superficial negativa inicial é devido ao revestimento de citrato. No entanto, altas magnitudes dos potenciais zeta para todos os NSs garantem a estabilidade dos NSs em soluções aquosas. As medições de XPS realizadas nos Au NSs após cada estágio de funcionalização, ou seja, com PEG-SH seguido por MUA mostram um teor muito baixo de bromo na superfície, confirmando a remoção de CTAB ligado em grandes quantidades das superfícies dos NSs. (Tabela 1, ESI).

Além disso, um revestimento dos NSs com PEG-SH e MUA não altera suas características ópticas dramaticamente. No entanto, o alargamento do pico sequencial é obtido após a funcionalização para os NSs anisotrópicos (Arquivo adicional 1:Figura S3, ESI †). Isso pode ser devido a diferentes eixos de rotação dos NSs devido à anisotropia, revestimento não uniforme, aumento do tamanho (dados DLS), polidispersidade das amostras ou uma combinação dos anteriores. Como as propriedades ópticas dos Au NSs dependem da forma, superfície, tamanho e estado de agregação, o mesmo ocorre com suas interações com as células. Os estudos de interação celular podem revelar até que ponto os Au NSs são absorvidos, seus efeitos citotóxicos e podem apontar para futuras aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Interação celular de Au NSs de diferentes formas

Geralmente, os Au NSs entram na célula por endocitose, que pode ser mediada por receptor ou independente de receptor, por fagocitose dependente de actina ou por outras vias endocíticas atualmente desconhecidas [52]. Descrever qual rota o NS toma é de importância crítica, pois em última análise, determina o destino intracelular do NS [53]. Estudos têm demonstrado que o mecanismo de captação intracelular depende das propriedades físico-químicas, AR, e das características da superfície do SN, bem como do tipo de célula [54,55,56,57,58]. A carga das moléculas estabilizadoras de superfície será efetivamente a carga do NS [59]. NSs positivamente carregados têm uma forte adsorção de proteínas em meios biológicos e podem danificar gravemente as membranas das células. Devido a isso, uma carga neutra ou negativa é preferível para evitar forte adsorção nas membranas celulares e / ou adsorção de proteínas [26, 60]. Além disso, a forma dos NSs irá determinar até que ponto a cobertura da superfície das moléculas de estabilização é uniforme ou não [61].

Aqui, todos os Au NSs, exceto os NSs esféricos, foram sintetizados com o agente ativo de superfície CTAB. Au NSs foram funcionalizados com MUA para ganhar uma superfície carregada negativamente antes dos estudos de interação celular. Au NSs estáveis ​​revestidos com MUA foram subsequentemente co-incubados com células de glioblastoma-astrocitoma humano por 24 h, e o efeito da forma e concentração na citotoxicidade foi avaliado com um ensaio LIVE / DEAD®, suplementado com uma coloração nuclear para destacar Au NS intracelular .

A maior morte celular foi observada com o NM em alta concentração (Fig. 5a), com morte celular próxima a 20% após a correção do branco. Os outros NSs não mostraram a mesma tendência de citotoxicidade, o que pode indicar que os NMs são captados em uma taxa / volume maior do que as outras formas [62]. A contagem de células para essas formas mostrou uma citotoxicidade abaixo de 5% após a correção do branco (para imagens de todas as formas, consulte o arquivo adicional 1:Figura S4, ESI †).

Efeito de Au NSs em células de glioblastoma-astrocitoma. a Porcentagem de morte celular de células de glioblastoma-astrocitoma em função da concentração de AuNSs. O tempo de incubação foi de 24 horas. Imagens b –M são adquiridos após a incubação de makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. b TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. e Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). g Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. h TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.

Conclusions

In summary, we have synthesized five different shapes of Au NSs using a seed-mediated growth approach (nanorods, nanomakura , tetrahexahedral, bipyramidal) and the Turkevich method (spherical). These NSs have different sizes:the smallest being the NRs and the largest being the BPs, ranging from 22 to 156 nm. Their optical properties measured using UV-vis spectroscopy show LSPR span from UV, visible, to near IR. High values of zeta potential render good stability in aqueous solution. With an aim to exchange the cationic surfactant on the surface, a two-step functionalization protocol was employed to replace the CTAB with PEG thiol and MUA.

After coating, the NSs showed a decrease in surface charge, coupled with an increase in size, proving successful functionalization. In vitro studies were performed for all the synthesized NSs involving co-incubation with glioblastoma-astrocytoma cells for 24 h. The greatest cytotoxic response (~ 20%) was observed with NM at high concentration, which is consistent with higher uptake. An in––depth study with TEM revealed a time-dependent internalization in cancer cells via endocytosis and macropinocytosis. This successful internalization of the Au NM in cancer cells, coupled with their unique physicochemical properties, render them suitable for hyperthermia and drug delivery to cancer cells while being simultaneously imaged.

Abreviações

AgNO₃ :

Silver nitrate

Au:

Ouro

BF:

Bright filed

BPs:

Bipyramids

CTAB:

Cetyltrimethylammonium bromide

DDAB:

Didecyldimethylammonium bromide

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

EMEM:

Eagle’s Minimal Essential Medium

EthD-1:

Ethidium homodimer-1

GBM:

Glioblastoma multiforme

HAuCl4:

Cholorauric aicd

HRTEM:

Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução

IR:

Infravermelho

LSPR:

Ressonância de plasmon de superfície localizada

MUA:

11-Mercaptoundecanoic acid

Na-citrate:

Sodium citrate dihydrate

NM:

Nanomakura

NRs:

Nanorods

Ns:

Nanostructure

OA:

Ácido oleico

PEG-SH:

O-[2-(3-Mercaptopropionylamino) ethyl]-O-ethylpolyethylene glycol

STEM:

Microscopia eletrônica de transmissão de varredura

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

THH:

Tetrahexahedra

UV-Vis:

Visível por ultravioleta

XPS:

espectroscopia de fotoelétrons de raios-X

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