O efeito da apoptose nas células cancerosas do fígado de nanopartículas de ouro modificadas com ácido litocólico

Resumo

Nanopartículas de ouro funcionalizadas (AuNPs) têm ampla aplicação em muitos campos, devido à sua boa biocompatibilidade, longa meia-vida do fármaco, e sua bioatividade está relacionada ao seu tamanho e aos ligantes modificados em sua superfície. Aqui, sintetizamos os AuNPs capeados com ligantes que possuem polietilenoglicol (PEG) e ácido litocólico (LCA) ligados por grupos carboxila (AuNP @ MPA-PEG-LCA). Nossos resultados de citotoxicidade indicaram que AuNP @ MPA-PEG-LCA tem melhor seletividade celular; em outras palavras, poderia inibir o crescimento de várias células cancerosas do fígado de forma mais eficaz do que outras células cancerígenas e células normais. A apoptose desempenha um papel na proliferação celular de inibição de AuNP @ MPA-PEG-LCA, que foi convincentemente comprovada por alguns experimentos de índice apoptótico, como coloração nuclear, anexina V-FITC, análise de potencial de membrana mitocondrial (MMP) e experimentos de coloração AO / EB . O AuNP @ MPA-PEG-LCA mais potente foi confirmado para induzir apoptose de forma eficiente por meio de uma disfunção mitocondrial mediada por espécies reativas de oxigênio (ROS). E AuNP @ MPA-PEG-LCA poderia ser mais eficaz na promoção da morte celular programada de células cancerosas do fígado.

Histórico

Nanopartículas de ouro (AuNPs) como nanomateriais têm sido amplamente aplicadas em muitos campos por causa de suas propriedades ópticas únicas, boa estabilidade química e biocompatibilidade [1,2,3,4,5]. Portanto, ele tem amplas perspectivas de aplicação em nanoeletrônica, nano-fotônica, catálise, sensores, biomarcadores e muitas outras áreas [6,7,8]. Como os AuNPs têm grande área superficial e formato esférico, eles podem ser usados como carreadores de drogas antineoplásicas [9,10,11,12]. Além disso, muitos complexos AuNP têm sido usados principalmente para o novo tipo de drogas antitumorais, a fim de tratar o câncer [13, 14]. Como um carreador de droga antineoplásica, o complexo AuNP pode controlar a função celular, regular a expressão gênica e detectar analitos na célula [15, 16]. Portanto, a melhora dos AuNPs funcionalizados torna-se uma das tendências importantes na pesquisa do tratamento do câncer [17,18,19].

O ácido litocólico (LCA) existe amplamente no ácido biliar secundário de vertebrados superiores na bile. Diversidade de espécies de ácido biliar foi relatada na aplicação de diferentes tipos de ácido biliar e seus derivados na medicina e alguns outros campos [20,21,22], como pode ser usado no tratamento de deficiência de ácido biliar, cálculos biliares e doença hepática [23,24,25]. E alguns ácidos biliares e seus derivados podem, como transportadores de drogas, ter como alvo o tratamento de doenças hepáticas, promotores de absorção e agentes redutores do colesterol. [26,27,28]. Relatórios anteriores demonstraram que o LCA tem um efeito antitumoral muito forte nas células cancerosas do fígado e o mecanismo de morte celular é a apoptose [29, 30]. A apoptose é um processo biológico de morte celular ativa, e é um mecanismo importante pelo qual o organismo multicelular regula o desenvolvimento do corpo, controla o envelhecimento celular e mantém o ambiente interno estável [31, 32]. Especialmente, a inibição da proliferação, diferenciação, redução do grau de malignidade e promoção da apoptose de células tumorais são os objetivos do tratamento tumoral [33,34,35,36,37].

Neste estudo, sintetizamos os AuNPs com propriedades de direcionamento biológico por meio da combinação de NPs de ouro com derivados de LCA. Nós estudamos sua citotoxicidade usando o método MTT com células HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 e MCF-7 por 48 h. Nossos resultados de citotoxicidade revelaram que AuNP @ MPA-PEG-LCA poderia inibir o crescimento de múltiplas células cancerosas do fígado de forma mais eficaz do que outras células cancerosas e células normais. A apoptose desempenha um papel na inibição da proliferação celular, o que foi confirmado através da coloração Hoechst 33342, coloração com anexina V-FITC, análise do potencial de membrana mitocondrial (MMP) e experimentos de coloração AO / EB. E o nível de ROS aumentou em células de câncer de fígado, sugerindo que AuNP @ MPA-PEG-LCA pode induzir apoptose via disfunção mitocondrial mediada por geração de ROS.

Métodos

Materiais

A menos que especificado, os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e usados sem purificação adicional. O meio RPMI-1640 e o soro fetal bovino (FBS) eram da Invitrogen Corporation. HepG2 (células de carcinoma hepático hepatocelular humano), SMMC-7721 (células de carcinoma hepático hepatocelular humano), QSG-7701 (células de hepatócitos normais humanos) e MCF-7 (células de câncer de mama humano) foram adquiridos do Instituto de Ciências Biológicas de Xangai ( Xangai, China).

Síntese de AuNP @ MPA

Nanopartículas de ouro revestidas com citrato (AuNP @ MPA) com um tamanho médio de 4,0 nm foram preparadas de acordo com o método pioneiro de J. Turkevich et al. [38]. Resumidamente, 773 μl de solução de citrato de sódio 38,8 mM e 2 mL de HAuCl 15 mM ₄ solução foram dissolvidos em 30 mL de Milli-Q H ₂ O, e a solução foi agitada a 25 ° C. Em seguida, 3 mL de 0,1 M de NaBH ₄ (preparado na hora) foi adicionado. Após reagir por 2h 25 ° C, a solução mudou de incolor para laranja claro. Em seguida, 3 mL de 0,01 M de ácido 3-mercaptopropiônico (MPA) em etanol anidro foram adicionados a pH 11 e mantidos reagindo por 2 h a 25 ° C. A mistura reaccional foi centrifugada para obter o composto AuNP @ MPA.

Síntese de AuNP @ MPA-PEG

10,5 mg (0,0875 mmol) de 1-Hidroxipirrolidina-2,5-diona (NHS) e 7 mg (0,035 mmol) de cloridrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC) foram adicionados a solução de AuNP @ MPA 50 mM em Ácido 4-morfolinetanossulfônico (MES), e a solução foi agitada durante 30 min a 25 ° C. Então, 0,045 mmol NH ₂ -PEG1000-NH ₂ foi adicionado e a mistura foi agitada durante 24 h a 25 ° C. Quando a reação está completa, a mistura foi centrifugada para obter o composto AuNP @ MPA-PEG.

Síntese de AuNP @ MPA-PEG-LCA

O composto AuNP @ MPA-PEG em água ultrapura foi adicionado a 200 μL de solução de dimetilformamida anidra (DMF) incluindo 17 mg (0,045 mmol) de LCA, e a solução de reação foi agitada por 24 h a 25 ° C. Quando a reação está completa, a mistura de reação foi centrifugada para obter o composto AuNP @ MPA-PEG-LCA.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

A morfologia e o tamanho dos AuNPs foram detectados em um JEOL JEM-200CX TEM, operando em até 200 kV. A solução AuNP foi colocada em uma grade de cobre (malha 300).

Ensaios de capacidade antitumoral de AuNPs

Usamos quatro tipos de células (HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 e MCF-7) para investigar a capacidade antitumoral dos AuNPs por um 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5 modificado método do brometo de difeniltetrazólio (MTT). Os 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mg / mL de AuNPs e nanopartículas de ouro originais (AuNP @ MPA) foram usados no ensaio. A DO570 de cada poço foi medida em um leitor de placas multimodo Tecan Infinite M200.

Determinação da morfologia por coloração Hoechst

Após 24 e 48 h com AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / mL), as células HepG2 foram coradas com 10 μg / mL de Hoechst 33342 por 30 min em incubadora de células. A morfologia dos núcleos das células foi detectada por microscopia confocal Leica-SP8.

Apoptose da prófase celular:coloração com anexina V-FITC

Após 6 h com AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / mL), as células HepG2 foram coradas com anexina V-FITC por 10 min em incubadora de células, em seguida, observadas com um microscópio confocal Leica-SP8.

Para a detecção de AuNPs por citômetro de fluxo, após 6 h de tratamento com AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / mL), as células HepG2 foram coradas com anexina V-FITC por 10 min na incubadora de células e foram detectadas com um citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson &Co., Franklin Lakes, NJ).

Análise do Potencial da Membrana Mitocondrial (MMP)

Células HepG2 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / mL) por 6 h a 37 ° C foram incubadas com 10 μg / mL JC-1 (5,5 ′, 6,6′-tetracloro-1,1 Iodeto de ′, 3,3′-tetraetilbenzimidazolilcarbo-cianina; sondas moleculares) durante 10 min a 37 ° C. As células foram posteriormente detectadas com um citômetro de fluxo FACSCalibur.

Para observação por microscopia de fluorescência, as células HepG2 foram tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA por 10 min com 10 μg / mL JC-1 e observadas usando microscopia confocal Leica-SP8.

Medição de espécies reativas de oxigênio (ROS)

O acúmulo de ROS intracelular foi testado usando diacetato de 2 ′, 7′-diclorofluoresceína (H ₂ DCF-DA). O tratamento de células HepG2 com amostras AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / mL) por 6 h foram incubadas com 10 μM de H ₂ DCF-DA por 30 min a 37 ° C. E a intensidade de fluorescência das células foi visualizada usando um citômetro de fluxo FACSCalibur e um microscópio confocal.

Resultados e discussão

Preparação e caracterização de AuNPs

Em primeiro lugar, foi preparado AuNP @ MPA solúvel em água (Esquema 1). A Figura 1a mostra os resultados de TEM do AuNP @ MPA. É indicado que a forma e o tamanho do AuNP @ MPA apresentaram uma forma esférica muito semelhante com tamanho compacto de 4,0 ± 0,5 nm. O AuNP @ MPA-PEG-LCA foi então preparado (Esquema 1). E a morfologia das partículas também foi analisada por TEM (Fig. 1c). As imagens TEM mostram que a morfologia do AuNP @ MPA-PEG-LCA é semelhante à do AuNP @ MPA. E os diâmetros de AuNP @ MPA-PEG-LCA foram de ~ 16 nm por meio de análise estatística.

Representação esquemática da síntese do AuNP @ MPA-PEG-LCA

Imagens TEM de a AuNP @ MPA, b AuNP @ MPA-PEG e c AuNP @ MPA-PEG-LCA

Os resultados da citotoxicidade

A fim de investigar a citotoxicidade dos AuNPs, células HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 e MCF-7 foram selecionadas e tratadas com AuNPs e AuNP @ MPA por 48 h. E o ensaio MTT foi usado para detectar a toxicidade celular das amostras. As viabilidades celulares dos AuNPs e AuNP @ MPA em diferentes células são mostradas na Fig. 2. Os resultados sugeriram que a citotoxicidade do AuNP @ MPA é muito baixa em todas as células. No entanto, o AuNP @ MPA-PEG-LCA poderia inibir o crescimento de várias células cancerosas do fígado de forma mais eficaz com o aumento da concentração de nanopartículas, mas teria menos danos às células normais e outras células cancerosas. Nomeadamente, a atividade antiproliferativa do AuNP @ MPA-PEG-LCA para as células HepG2 e SMMC-7721 foi muito elevada em relação às células QSG-7701 e MCF-7.

Viabilidade celular de AuNP @ MPA e AuNP @ MPA-PEG-LCA (AuNPs) incubado com células HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 e MCF-7 por 48 h

Indução de apoptose

Os núcleos apoptóticos são um índice comum de apoptose. Após o tratamento com AuNP @ MPA-PEG-LCA pelos tempos indicados, as células foram incubadas com Hoechst 33342. E então as características morfológicas do núcleo da célula foram visualizadas usando microscopia confocal. Como mostrado na Fig. 3, as células de controle e as células incubadas com AuNP @ MPA exibem coloração de núcleo celular intacta e homogênea; no entanto, o número de células apoptóticas em células HepG2 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA aumenta gradualmente com o aumento do tempo de incubação e o núcleo da célula exibe características de apoptose típicas, como núcleos fragmentados, cromatina condensada e redução do volume celular.

Características morfológicas do núcleo celular de células HepG2 coradas com Hoechst 33342. As células HepG2 foram incubadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / ml) para a 0 h, b 24 h, e c 48 h e d AuNP @ MPA (0,5 mg / ml) incubado por 48 h. As células apoptóticas exibiram núcleos condensados e fragmentados e redução do volume celular; barra de escala 20 μm

Como todos sabemos, a coloração com anexina V pode distinguir os estágios iniciais da apoptose das células necróticas. No estágio inicial da apoptose, a anexina V pode ligar-se ao fosfolipídio fosfatidilserina (PS) da membrana, que é externalizado da superfície interna para a externa da membrana plasmática [39]. Portanto, investigamos o potencial de induzir apoptose de AuNP @ MPA-PEG-LCA por meio de ensaios de coloração com anexina V-FITC. Como mostrado na Fig. 4a, não há fluorescência verde óbvia na membrana celular no controle, mas há fluorescência verde óbvia na membrana celular de células HepG2 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA. Este fenômeno é um forte indicador de apoptose em estágio inicial. Como todos sabemos, as imagens da microscopia confocal apenas comprovaram a ocorrência de apoptose; no entanto, a citometria de fluxo pode medir de forma rápida e sensível a ocorrência de apoptose e determinar exatamente a taxa de apoptose. Portanto, investigamos ainda mais os estágios da apoptose usando citometria de fluxo. A Figura 4b mostra os resultados da taxa de apoptose por citometria de fluxo. A percentagem de apoptose foi cerca de 38,45% das células HepG2 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA, mas a percentagem de apoptose foi apenas cerca de 8,16% nas células de controlo. A porcentagem significativa de apoptose sugere que a célula incubada com AuNP @ MPA-PEG-LCA sustentou apoptose.

Os resultados da apoptose de a imagens confocais e b dados de citometria de fluxo de células HepG2 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / ml). As células foram coradas com anexina V-FITC (excitação a 488 nm e emissão a 500-560 nm); barra de escala 20 μm

A diminuição de MMP

A mitocôndria desempenha um papel importante na apoptose, pois pode liberar fatores pró-apoptóticos, como o citocromo C e o fator indutor de apoptose [40,41,42]. Portanto, exploramos a mudança de MMP usando microscopia confocal e citometria de fluxo. A Figura 5a mostra as imagens de fluorescência de células HepG2 marcadas com JC-1 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA por microscopia confocal. Podemos observar que há fluorescência JC-1 vermelha óbvia e mitocôndrias saudáveis em células HepG2 controle, indicando a presença de agregação de JC-1. No entanto, há mais fluorescência verde nas células HepG2 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA, indicando que ocorreu colapso da membrana. A ruptura mitocondrial em células apoptóticas indica que o JC-1 não se acumula dentro da mitocôndria, mas se distribui por toda a célula. E como a forma monomérica, o JC-1 espalhado que existe fica com uma fluorescência verde. Para quantificar ainda mais a alteração de MMP, avaliamos as células HepG2 coradas com JC-1 por citometria de fluxo. Os sinais representativos da razão vermelho / verde JC-1 registrados em células HepG2 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA e células de controle por citometria de fluxo são mostrados na Fig. 5b. Podemos observar que a proporção de vermelho / verde mostrou uma diminuição significativa nas células tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA a partir da análise quantitativa de células coradas com JC-1 enquanto que teve um aumento significativo nas células de controle, o que sugere que AuNP @ MPA-PEG-LCA pode induzir apoptose em células HepG2.

a Imagens de fluorescência de células marcadas com JC-1 visualizadas por microscopia confocal e b efeitos de AuNP @ MPA-PEG-LCA em MMP analisados por citometria de fluxo

Efeitos de AuNP @ MPA-PEG-LCA em ROS

Como todos sabemos, a apoptose pode ser desencadeada com o aumento dos níveis de ROS intracelulares, que também são uma forte evidência envolvida na indução da apoptose [43]. Para explorar ainda mais se a disfunção mitocondrial estava relacionada à geração de ROS, determinamos o nível de ROS em células HepG2 coradas com H ₂ DCF-DA usando microscopia confocal e citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 6a, a intensidade da fluorescência verde de H ₂ DCF-DA mostra um aumento significativo nas células HepG2 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA em comparação com as células de controle. Ou seja, o conteúdo de ROS em células HepG2 tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA foi significativamente aumentado. Em seguida, a análise quantitativa do conteúdo de ROS nas células foi investigada por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 6b, a maior intensidade de fluorescência foi detectada em células incubadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA em comparação com as células de controle, o que indica que o conteúdo de ROS é maior nas células tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA . Os dados sugeriram que a disfunção mitocondrial talvez estivesse relacionada à geração de ROS. Estes resultados indicam preliminarmente que a geração de ROS tem um papel importante na indução de apoptose de AuNP @ MPA-PEG-LCA.

Análise da produção de ROS após as células HepG2 serem tratadas com AuNP @ MPA-PEG-LCA por 6 h. O conteúdo de ROS em células HepG2 foi investigado por a microscopia confocal (excitação em 488 nm e emissão em 530 nm) e b citometria de fluxo (excitação a 488 nm e emissão a 525 nm)

Conclusões

Em resumo, sintetizamos o AuNP @ MPA-PEG-LCA com um diâmetro médio de 16,0 nm que pode inibir o crescimento de várias células cancerosas do fígado. O AuNP @ MPA-PEG-LCA inibiu eficazmente a proliferação de células devido à apoptose, o que foi comprovado por coloração nuclear, coloração de JC-1, análise de MMP e experimentos de coloração com anexina V-FITC. No estudo de citometria de fluxo, a parada de AuNP @ MPA-PEG-LCA em células de câncer de fígado prova ainda mais seu comportamento de apoptose. Portanto, os AuNPs podem induzir com eficiência a apoptose por meio de uma disfunção mitocondrial mediada por ROS e são mais eficazes na promoção da morte celular programada em células de câncer de fígado em um estudo mecanístico preliminar.

Abreviações

AuNPs:: Nanopartículas de ouro
DMF:: Dimetilformamida
EDC:: Cloridrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida
FBS:: Soro fetal bovino
H ₂ DCF-DA:: Diacetato de 2 ′, 7′-diclorofluoresceína
HepG2:: Células de carcinoma hepático hepatocelular humano
JC-1:: Iodeto de 5,5 ′, 6,6′-tetracloro-1,1 ′, 3,3′-tetraetilbenzimidazolilcarbo-cianina
LCA:: Ácido litocólico
MCF-7:: Células de câncer de mama humano
MES:: Ácido 4-morfolinaetanossulfônico
MMP:: Potencial de membrana mitocondrial
MPA:: Ácido 3-mercaptopropiônico
MTT:: Brometo de 3- (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5-difeniltetrazólio
NHS:: 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona
PEG:: Polietileno glicol
PS:: Fosfatidilserina
QSG-7701:: Células de hepatócitos humanos normais
ROS:: Espécies que reagem ao oxigênio
SMMC-7721:: Células de carcinoma hepático hepatocelular humano
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão

Uma bomba d'água nanométrica induzida pelo movimento browniano e não browniano de uma folha de grafeno em uma superfície de membrana Efeito aprimorado da combinação de ácido clorogênico em nanopartículas de selênio na inibição da agregação de amilóide β e formação de espécies reativas de oxigênio in vitro

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias