Estabilidade aprimorada de nanopartículas magnéticas de ouro com poli (ácido 4-estirenossulfônico-ácido co-maleico):propriedades ópticas sob medida para detecção de proteínas

Resumo

Nanopartículas magnéticas de ouro (GoldMag) têm atraído grande atenção devido ao seu desempenho físico e químico único, combinando os de Fe ₃ individual O ₄ e nanopartículas de Au. O revestimento do GoldMag com polímeros não apenas aumenta a estabilidade das partículas compostas suspensas no tampão, mas também desempenha um papel fundamental no estabelecimento de testes ópticos de ponto de atendimento para biomoléculas clinicamente relevantes. No presente artigo, poli (ácido 4-estirenossulfônico-ácido co-maleico) (PSS-MA), um polieletrólito carregado negativamente com grupos aniônicos sulfonato e carboxilato, foi usado para revestir a superfície GoldMag carregada positivamente (30 nm). O complexo GoldMag revestido com PSS-MA tem um pico de adsorção de ressonância plasmônica estável a 544 nm. Um par de anticorpos anti-dímero D foi acoplado a esta superfície de nanopartícula de compósito GoldMag e uma proteína alvo, dímero D foi detectada, na faixa de 0,3–6 μg / mL. O deslocamento do pico característico, causado pela montagem de GoldMag devido à formação de pontes sanduíche D-dímero-anticorpo, permitiu a detecção.

Histórico

Tirando vantagem de uma propriedade de magnetização específica, ou seja, superparamagnetismo, as nanopartículas magnéticas têm sido amplamente investigadas para aplicações biomédicas, como entrega de droga / gene, imagem por ressonância magnética e ensaios biológicos [1,2,3]. Nanopartículas magnéticas de ouro (GoldMag), compostas de Fe ₃ O ₄ / Au, além de possuir as propriedades físico-químicas das nanopartículas de óxido de ferro, também apresentam características das nanopartículas de ouro, como fácil funcionalização de superfície e propriedades ópticas únicas. Essas características distintivas têm atraído grande atenção no campo da biologia [4, 5], especialmente na detecção de biomoléculas com base em propriedades ópticas. Como exemplo, Wang et al. usou Fe ₃ O ₄ -Au rods como sondas ópticas para detecção multiplex de patógenos [6]. No entanto, como com outras nanopartículas, a alta energia de superfície força as partículas GoldMag em direção umas às outras de modo que formem aglomerados em solução tampão. Isso limita muito sua aplicação para detecção óptica na área biomédica. Portanto, é crucial evitar a agregação de GoldMag e garantir uma solução colóide estável. Personalizar GoldMag para detectar moléculas alvo com base no revestimento com polímeros tem uma grande utilidade. Foi relatado que a dispersão de GoldMag pode ser melhorada através da modificação da superfície com vários compostos orgânicos macromoleculares, como o ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA) [7], poliestirenossulfonato (PSS) [8] e polietilenimina (PEI) [9]. MUA foi trazido à superfície da GoldMag usando a estratégia de troca de ligante. Ele aumentou a estabilidade das soluções coloidais GoldMag através da modificação da superfície com MUA [7]. Esses MUA-GoldMag têm sido usados na detecção de proteínas com base em propriedades ópticas. No entanto, a cadeia de MUA era muito curta para fornecer impedimento estérico suficiente para garantir dispersidade suficiente de partículas. Além disso, a baixa densidade de grupos carboxila em MUA limita a quantidade de proteína que pode ser absorvida pelo GoldMag. Essas desvantagens restringem a aplicação de partículas MUA em instrumentos ópticos e limitam a sensibilidade necessária para a detecção de biomarcadores.

Poli (ácido 4-estirenossulfônico-ácido co-maleico) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20.000), um copolímero em bloco, é feito pela ligação covalente de PSS e ácido polimaleico e contém sulfonato e grupos carboxilato. A repulsão eletrostática proporcionada pelo grande número de grupos carboxila e grupos sulfonato, bem como o impedimento estérico proveniente da longa cadeia polimérica do PSS-MA tornam este polímero muito útil na manutenção da estabilidade das nanopartículas. De fato, PSS-MA tem sido utilizado como estabilizador na preparação de nanopartículas, como nanomateriais de óxido de ferro, paládio e nanoestruturas bimetálicas de Ag-Au [10,11,12]. Johnston et al. relataram que os nanoclusters de óxido de ferro revestidos com copolímero garantem um maior grau de estabilização eletrostérica do que os nanoclusters de óxido de ferro revestidos com polímero de macromolécula única [13]. Além disso, o grande número de grupos carboxila na porção de ácido polimaleico de PSS-MA permite a modificação química com biomoléculas para aplicações biomédicas.

D-dímeros são produtos finais estáveis da degradação da fibrina reticulada, resultante da formação intensificada de fibrina e fibrinólise [14]. A determinação do nível de dímero D no sangue é amplamente utilizada no diagnóstico de eventos tromboembólicos e infarto do miocárdio [15, 16]. Aqui, usamos D-dímero como um modelo para avaliar o potencial do uso de PSS-MA-GoldMag para detecção óptica de proteínas específicas. Usamos um par de anticorpos anti-dímero D para imobilização em PSS-MA-GoldMag a fim de formar sondas para a detecção de dímero D pelo imunoensaio sanduíche de anticorpo duplo.

Assim, no presente estudo, PSS-MA foi usado para modificação de superfície de GoldMag. Isso não só aumenta a estabilidade das nanopartículas magnéticas, mas também medeia a conjugação entre as nanopartículas e os anticorpos para detecção de dímero.

Métodos

Materiais e Reagentes

GoldMag (5 mg / mL) foram fornecidos por Xi’an GoldMag Nanobiotech Co., Ltd. (Xi’an, PRC). Ácido bórico, bórax, brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), poli (ácido 4-estirenossulfônico-ácido co-maleico) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20.000) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, EUA. Um par de anticorpos monoclonais de dímero D (anticorpo 1:M-2.1.16; anticorpo 2:M-1.2.57) foram adquiridos da Roche. D-dímero foram adquiridos a Meridian Chemicals, EUA.

GoldMag de superfície modificada com PSS-MA

Os GoldMag foram sintetizados conforme descrito anteriormente [17]. 13,3 mL de CTAB (50 mmol / L) foram adicionados a 13,3 mL de GoldMag (aproximadamente 3 mg / mL). A mistura foi agitada mecanicamente (200 rpm) combinada com ultrassom (SB-5200DTD, China) por 30 min, seguido por mais agitação sem ultrassom por mais 30 min. As partículas foram lavadas minuciosamente com água desionizada. O CTAB-GoldMag foi redisperso em 10 mL de água desionizada e 16 mL de 25% ( w / w ) Foi adicionada solução de PSS-MA seguida de agitação (180 rpm) durante 90 min. As partículas modificadas foram lavadas com água desionizada duas vezes e foram dispersas em água desionizada.

Caracterização

Os PSS-MA-GoldMag foram observados usando microscópio eletrônico de transmissão (TEM, Hitachi H-600, Hitachi Corporation, Japão). A distribuição de tamanhos foi analisada por DLS (zeta-sizer, Malvern Instruments, UK). A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR, Thermo Nicolet 5700, Thermo Nicolet Corporation, EUA) foi usada para caracterizar os grupos funcionais de PSS-MA-GoldMag. Um analisador termogravimétrico Metter Toledo SDTA 851e (TGA) foi usado para analisar a proporção da casca da superfície do polímero entre o PSS-MA-GoldMag. O espectro de ressonância plasmônica de superfície (SPR) de GoldMag foi registrado usando um espectrofotômetro UV-2550 (Shimadzu, Japão) na faixa de comprimento de onda de 450–700 nm.

Preparação da sonda de anticorpo anti-D-dímero-PSS-MA-GoldMag

Um miligrama de GoldMag foi suspenso em 1 mL de tampão bórax / borato (0,02 M, pH 7,4), contendo 75 mg / mL de 1-etil-3- (3-dimetil-laminopropil) carbodiimida (EDC). Em seguida, 100 μg de anticorpo anti-dímero D foram adicionados à suspensão, seguido de ultrassom por 1 h. Três mililitros de tampão de bloqueio (tampão de bórax / borato 0,02 M, pH 7,4, contendo 5% de BSA) foram adicionados à mistura e foram incubados por 1,5 h. Após a separação sob um campo magnético externo, o composto de anticorpo anti-dímero D-PSS-MA-GoldMag foi mantido em tampão bórax / borato a 4 ° C. A conjugação do anticorpo anti-dímero D na superfície PSS-MA-GoldMag foi confirmada por espectroscopia SPR e medição de espalhamento dinâmico de luz (DLS).

A solução de dímero D foi preparada diluindo uma solução estoque de dímero D (40 mg / mL) com soro de bezerro. Três concentrações de dímero D (0,6, 2 e 6 μg / mL) foram usadas para otimizar o tempo de reação entre o dímero D e o complexo anticorpo anti-dímero D-PSS-MA-GoldMag. Dez microlitros de anticorpo anti-dímero D-PSS-MA-GoldMag (0,3 mg / mL) foram misturados com 80 μL de solução de dímero D (0,6, 2 e 6 μg / mL) e a mistura foi incubada a 25 ° C por 10, 20, 30 e 40 min. O comprimento de onda do pico SPR do composto PSS-MA-GoldMag foi lido usando um espectrofotômetro UV-2550.

Soluções de dímero D com concentrações de 6, 3, 1,5, 0,75 e 0,3 μg / mL foram preparadas para analisar a relação entre a concentração de dímero D e a mudança do espectro de SPR. Dez microlitros de anticorpo anti-dímero D-PSS-MA-GoldMag (0,3 mg / mL) foram misturados com 80 μL de solução de dímero D (6, 3, 1,5, 0,75 e 0,3 μg / mL) e a mistura foi incubado a 25 ° C durante 30 min. O comprimento de onda do pico SPR de PSS-MA-GoldMag foi lido usando um espectrofotômetro UV-2550.

Para avaliar se triglicerídeos, bilirrubina e hemoglobina podem interferir em nosso sistema de detecção de proteínas, soluções de dímero D (0 e 3 μg / mL) foram preparadas e triglicerídeos 22 mg / mL, bilirrubina 0,2 mg / mL e 2 mg / Amostras de mL de hemoglobina foram adicionadas separadamente. Dez microlitros de anticorpo anti-dímero D-PSS-MA-GoldMag foram adicionados às misturas acima, e o comprimento de onda do pico SPR do compósito PSS-MA-GoldMag foi lido usando um espectrofotômetro UV-2550.

Resultados e discussão

O Esquema 1 ilustra os procedimentos desenvolvidos para a modificação da superfície e funcionalização de partículas para detecção colorimétrica de proteínas. Para estudar a adsorção e incorporação de PSS-MA nas estruturas PSS-MA-GoldMag, foram realizadas análises espectroscópicas de FTIR, espectroscopia de SPR e TGA. A Figura 1a mostra o espectro de FTIR para PSS-MA puro, PSS-MA-GoldMag e GoldMag, respectivamente. A banda larga e forte em 3000–3700 cm ⁻¹ corresponde ao alongamento dos grupos –CO – OH e dos grupos hidroxila de –SO ₂ –OH em cadeias de polímero [18]. Vibrações simétricas de grupos sulfonato:(SO ₃ ^- ) estavam em 1037 e 1126 cm ⁻¹ e as vibrações de alongamento de C =C do benzeno estavam em 1403 e 1637 cm ⁻¹ [19]. Estas bandas de absorção características de PSS-MA foram observadas em PSS-MA-GoldMag demonstrando que as partículas brutas foram revestidas com sucesso com PSS-MA. A alteração dos grupos químicos de superfície do GoldMag foi confirmada por um claro desvio para o azul de 11 nm de 555 a 544 nm na banda SPR após a modificação (Fig. 1b). A posição e a largura do pico SPR foram relacionadas à superfície, ao ambiente e à dispersão das nanopartículas [20,21,22,23]. A análise de TGA indicou que a proporção em peso de material orgânico para GoldMag era quase 1:4 (Fig. 1c). Em baixas temperaturas, a perda de peso pode ser atribuída à desidratação; quando a temperatura aumenta, a perda de peso pode ser atribuída à decomposição oxidativa das moléculas orgânicas na superfície das partículas modificadas [19, 24]. Durante a modificação, CTAB-GoldMag foram carregados positivamente (+ 12,2 mV) e a superfície da partícula tornou-se carregada negativamente (- 24,5 mV) após o revestimento PSS-MA na superfície das partículas (Fig. 1d). Todos os resultados acima mostram que os PSS-MA aderem com sucesso à superfície das nanopartículas.

As micrografias (Fig. 2a, b) do GoldMag e PSS-MA-GoldMag obtidas usando o TEM mostram que essas partículas estavam monodispersas, após a modificação. A camada de polímero na superfície das partículas é claramente visível sob a imagem microscópica eletrônica de alta resolução, indicando ainda que o revestimento do polímero em GoldMag foi bem-sucedido (Fig. 2b). A Figura 2c mostra que o diâmetro médio de PSS-MA-GoldMag é 116 nm. A suspensão PSS-MA-GoldMag possui uma cor vermelho vinho que indica uma boa estabilidade das nanopartículas (1 ano em água).

A estabilidade das características ópticas de GoldMag e PSS-MA-GoldMag em soluções tampão com diferentes valores de pH foram analisadas por espectroscopia SPR [7]. Como mostrado na Fig. 3a, o pico característico de SPR foi deslocado para o comprimento de onda mais longo de 555 nm quando GoldMag foi suspenso em tampão de bórax / borato com um pH de 6,0 a 9,0. A composição da solução tampão também influencia a estabilidade da suspensão GoldMag. A posição do pico característico de SPR foi movida para comprimentos de onda maiores (558 nm) quando GoldMag foi suspenso em tampão PB (pH 7,4), tampão bórax / borato (pH 7,4) e solução de NaCl (10 mM) em comparação com aqueles em água desionizada (550 nm) (Fig. 3c). No entanto, o pico SPR característico (545 ± 2 nm) não mudou significativamente quando PSS-MA-GoldMag foram dispersos em solução eletrolítica ou em solução tampão com diferentes valores de pH (Fig. 3b, d). Xia et al. e Storhoff et al. também relataram que a agregação de nanopartículas pode fazer o espectro SPR mudar para comprimentos de onda mais longos [25, 26]. O potencial zeta de GoldMag e PSS-MA-GoldMag também foi medido (Fig. 3e, f). Foi relatado que um potencial zeta baixo (menos de ± 30 mV) levará à aglomeração de partículas [27, 28]. Quando GoldMag foi suspenso em tampão PB (pH 7,4), tampão bórax / borato (pH 7,4) e solução de NaCl (10 mM), o potencial zeta de GoldMag foi - 16,7 ± 1,1 mV, - 14,3 ± 2,1 mV, e - 8,9 ± 1,5 mV, respectivamente. O potencial zeta de GoldMag foi - 14,2 ± 1,7 mV, - 17 ± 1,1 mV, 13,9 ± 1,7 mV e - 18,1 ± 1,6 mV quando as partículas foram suspensas em tampão bórax / borato com pH de 6,0 a 9,0. No entanto, a adesão do PSS-MA ao GoldMag diminui drasticamente seu potencial zeta em diferentes soluções eletrolíticas, bem como em diferentes valores de pH. Em todos os casos, o potencial zeta foi inferior a - 30 mV. Esses resultados indicam que a modificação da superfície de GoldMag com PSS-MA melhora significativamente sua resistência a mudanças de composição e valores de pH de soluções tampão e garante um alto nível de dispersão [29].

Para investigar a interação entre a proteína e PSS-MA-GoldMag, anticorpos anti-D-dímero foram conjugados com PSS-MA-GoldMag por meio da reação entre os grupos amino da proteína e os grupos carboxila do polímero mediados por EDC. Conforme mostrado na Fig. 4a, o desvio para o vermelho do pico SPR foi observado após a reação de PSS-MA-GoldMag com anticorpos anti-dímero D, o que indica a conjugação de anticorpos em nanopartículas [30, 31]. O aumento do diâmetro médio das partículas de 116 para 130 nm confirma a introdução do anticorpo anti-dímero D ao PSS-MA-GoldMag (Fig. 4b) [24]. A influência da massa do anticorpo na propriedade ótica do PSS-MA-GoldMag foi avaliada por espectroscopia SPR após a adição de diferentes quantidades de anticorpo anti-dímero D (de 20 a 200 μg) à suspensão PSS-MA-GoldMag. Como mostrado na Fig. 4c, o pico de SPR não foi alterado e foi mantido em 548 ± 3,0 nm, independente da quantidade de anticorpo adicionado.

A fim de avaliar a atividade dos anticorpos após a conjugação no PSS-MA-GoldMag, a sonda A e a sonda B foram preparadas por meio da imobilização de um par de anticorpos (anticorpo 1 e anticorpo 2) e o anticorpo 1 no PSS-MA-GoldMag, respectivamente. A interação entre os dois tipos de sonda e dímero-D foi analisada por espectroscopia SPR. O melhor tempo de reação foi obtido observando a mudança do máximo do pico SPR por 40 min após a adição de três concentrações de dímero D (0,6, 2 e 6 μg / mL) à sonda A. Como mostrado na Fig. 5a, foi observada uma mudança significativa na banda de plasmon de superfície resultante da agregação de PSS-MA-GoldMag por meio de ligações cruzadas entre a ponte sanduíche antígeno-anticorpo ao longo do tempo. Em baixa concentração (0,6 μg / mL), não houve alteração significativa no espectro SPR de 20 a 40 min, indicando que 20 min é suficiente para a reação de 0,6 μg / mL ou concentrações menores de dímero-D. No entanto, usando concentrações médias e altas de dímero-D (2 e 6 μg / mL), o comprimento de onda continuou aumentando 30 min. Isso indica que o melhor tempo de reação é 30 min. Como mostrado na Fig. 5b, o espectro SPR das partículas compostas revelou um desvio para o vermelho distinto na ressonância do plasmon de superfície de λ _max =550 a 570 nm e diminuição da intensidade do pico característico conforme a concentração de dímero D aumentou de 0,3 para 6 μg / mL. Isso é provocado pela agregação de PSS-MA-GoldMag causada pela conexão cruzada do dímero D com o anticorpo 1 e o anticorpo 2 na sonda A. A agregação de PSS-MA-GoldMag resultou na alteração das propriedades ópticas do ouro parte do PSS-MA-GoldMag. Jiang et al. e Li et al. também relataram que a agregação de nanogold pode tornar o espectro SPR das nanopartículas red shift e fronteira [32, 33]. No entanto, nenhum desvio para o vermelho foi observado na Fig. 5d porque a interação entre o dímero D e o anticorpo 1 não foi capaz de levar à montagem de nanopartículas. Além disso, um desvio para o vermelho distinguível (5 nm) foi observado até mesmo a quantidade de dímero D adicionado à sonda A foi tão baixa quanto 0,3 μg / mL, o que indica que o limite de detecção está abaixo dos valores de corte de diagnóstico (0,5 μg / mL) para este biomarcador. Uma relação linear entre a posição do pico espectral do SPR e a concentração de dímero D foi encontrada na faixa de 0,3-6 μg / mL ( r ² =0,9944) (Fig. 5c).

Como mostrado na Fig. 6, nenhuma mudança significativa foi encontrada no pico característico de SPR de PSS-MA-GoldMag na presença de triglicerídeos, bilirrubina e hemoglobina, respectivamente. Este resultado indica que nosso sistema de detecção de proteínas não apresenta reações de interferência com triglicerídeos, bilirrubina e hemoglobina.

Estes resultados mostram que PSS-MA-GoldMag é uma nanopartícula magnética promissora para imobilização de proteínas e pode formar uma ponte em sanduíche na superfície da partícula via anticorpo 1-proteína alvo-anticorpo 2. Isso torna PSS-MA-GoldMag valioso como um material para uso na detecção óptica de biomarcadores no ponto de atendimento.

Neste estudo, PSS-MA foi usado primeiramente para modificação de GoldMag (Esquema 1). A introdução do PSS-MA na superfície do GoldMag melhorou significativamente sua estabilidade em solução tampão. Além do impedimento estérico que é causado pela longa cadeia polimérica do PSS-MA, os grupos carboxila e o grupo sulfo no PSS-MA causam repulsão eletrostática entre as nanopartículas [29]. Isso aumenta significativamente a estabilidade do PSS-MA-GoldMag. O alto número de grupos carboxila na superfície da partícula atende ao requisito de conjugação com biomolécula.

Conclusões

No presente estudo, um método fácil e rápido para revestir GoldMag com PSS-MA foi relatado. Os resultados mostram que a estabilidade coloidal e a dispersão de GoldMag foram significativamente melhoradas com a introdução de PSS-MA. As partículas apresentam boa estabilidade em solução tampão com ampla faixa de pH. Além disso, a presença do grupo carboxila oferece a opção de conjugação de proteínas às nanopartículas. Tomando D-dímero e seu anticorpo como um modelo, descobriu-se que a característica óptica pode ser adaptada através da reticulação entre o antígeno e o composto de nanopartícula de anticorpo. Os resultados mostram que o GoldMag modificado com PSS-MA pode servir como um candidato muito promissor para detecção óptica baseada em imunoensaios.

Abreviações

DLS:: Espalhamento de luz dinâmico
FTIR:: Espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier
GoldMag:: Nanopartículas magnéticas de ouro
MUA:: Ácido 11-mercaptoundecanoico
PEI:: Polietilenimina
PSS:: Poliestirenossulfonato
PSS-MA:: Poli (ácido 4-estirenossulfônico-ácido co-maleico)
SPR:: Ressonância de plasmon de superfície
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
TGA:: Analisador termogravimétrico

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