GoldMag: Revestimento PSS-MA Melhora Estabilidade e Precisão Óptica para Detecção de Proteínas

Resumo

Nanopartículas magnéticas de ouro (GoldMag) atraíram grande atenção devido a seus desempenhos físico-químicos únicos combinando os de nanopartículas individuais de Fe₃O₄ e Au. Revestir GoldMag com polímeros não apenas aumenta estabilidade das partículas compostas suspensas em tampão mas também desempenha papel chave no estabelecimento de testes ópticos point-of-care para biomoléculas clinicamente relevantes. No presente artigo, poli(ácido 4-estirensulfônico-co-maleico) (PSS-MA), um polieletrólito negativamente carregado com grupos aniônicos sulfonato e carboxilato, foi usado para revestir superfície de GoldMag (30 nm) positivamente carregado. O complexo GoldMag revestido com PSS-MA tem pico de adsorção de ressonância plasmonica estável a 544 nm. Um par de anticorpos anti-D-dímero foi acoplado na superfície desta nanopartícula composta GoldMag, e uma proteína alvo, D-dímero, foi detectada na faixa de 0,3–6 μg/mL. O deslocamento do pico característico, causado pela montagem de GoldMag devido à formação de pontes sanduíche D-dímero-anticorpo, permitiu a detecção.

Introdução

Aproveitando propriedade de magnetização específica, ou seja, superparamagnetismo, nanopartículas magnéticas têm sido amplamente investigadas para aplicações biomédicas, como liberação de fármacos/genes, imagem por ressonância magnética e ensaios biológicos. Nanopartículas magnéticas de ouro (GoldMag), compostas de Fe₃O₄/Au, não apenas têm propriedades físico-químicas de nanopartículas de óxido de ferro mas também apresentam características de nanopartículas de ouro como fácil funcionalização superficial e propriedades ópticas únicas. Estas características distintivas atraíram grande atenção na área de biologia, especialmente em detecção de biomoléculas baseada em propriedades ópticas. Como exemplo, Wang et al. usaram bastões Fe₃O₄-Au como sondas ópticas para detecção multiplex de patógenos. No entanto, como outras nanopartículas, alta energia superficial força partículas GoldMag umas às outras formando aglomerados em solução tampão. Isso limita grandemente sua aplicação para detecção óptica na área biomédica. É crucial prevenir agregação de GoldMag e garantir solução coloidal estável. Personalizar GoldMag para detectar moléculas-alvo baseando-se em revestimento com polímeros tem alta utilidade. Reportou-se que dispersibilidade de GoldMag pode ser melhorada através de modificação superficial com vários compostos orgânicos macromoleculares, como ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA), poliestirenossulfonato (PSS) e polietilenimina (PEI). MUA foi trazida à superfície de GoldMag usando estratégia de troca de ligante. Melhorou estabilidade de soluções coloidais de GoldMag através de modificação superficial com MUA. Estes MUA-GoldMag foram usados em detecção de proteínas baseada em propriedades ópticas. No entanto, cadeia de MUA era muito curta para fornecer impedimento estérico suficiente para assegurar dispersibilidade suficiente de partículas. Além disso, baixa densidade de grupos carboxila em MUA limita quantidade de proteína que pode ser absorvida ao GoldMag. Estas desvantagens restringem aplicação de partículas MUA em instrumentos ópticos e limitam sensibilidade requerida para detecção de biomarcadores.

Poli(ácido 4-estirensulfônico-co-maleico) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20.000), um copolímero em bloco, é feito por ligação covalente de PSS e ácido polimaleico e contém tanto grupos sulfonato quanto carboxilato. A repulsão eletrostática fornecida pelo grande número de grupos carboxila e sulfonato, bem como o impedimento estérico vindo da longa cadeia polimérica de PSS-MA tornam este polímero muito útil na manutenção da estabilidade das nanopartículas. De fato, PSS-MA tem sido usado como estabilizador no preparo de nanopartículas, como nanomateriais de óxido de ferro, paládio e nanoestruturas bimetálicas Ag-Au. Johnston et al. reportaram que nanoclusters de óxido de ferro revestidos com copolímero asseguram maior grau de estabilização eletroestérica que nanoclusters revestidos com polímero macromolecular único. Além disso, grande número de grupos carboxila no grupo polimaleico de PSS-MA permite modificação química com biomoléculas para aplicações biomédicas.

D-dímeros são produtos finais estáveis da degradação de fibrina cruzada, resultante de formação aprimorada de fibrina e fibrinólise. Determinação de nível de D-dímero no sangue é amplamente usada no diagnóstico de eventos tromboembólicos e infarto do miocárdio. Aqui, usamos D-dímero como modelo para avaliar potencial de uso de PSS-MA-GoldMag para detecção óptica de proteínas específicas. Usamos par de anticorpos anti-D-dímero para imobilização em PSS-MA-GoldMag para formar sondas para detecção de D-dímero por imunoensaio sanduíche de duplo anticorpo.

Assim, no presente estudo, PSS-MA foi usado para modificação superficial de GoldMag. Isso não apenas aumentou estabilidade das nanopartículas magnéticas mas também medeia conjugação entre nanopartículas e anticorpos para detecção de Dímero.

Métodos

Materiais e Reagentes

GoldMag (5 mg/mL) fornecidos por Xi'an GoldMag Nanobiotech Co., Ltd. (Xi'an, PRC). Ácido bórico, borato, brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), Poli(ácido 4-estirensulfônico-co-maleico) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20.000) comprados da Sigma-Aldrich, EUA. Par de anticorpos monoclonais anti-D-dímero (anticorpo 1: M-2.1.16; anticorpo 2: M-1.2.57) comprados da Roche. D-dímero comprado da Meridian Chemicals, EUA.

GoldMag Modificado Superficialmente com PSS-MA

GoldMag sintetizados como descrito anteriormente. 13,3 mL de CTAB (50 mmol/L) adicionados a 13,3 mL de GoldMag (aproximadamente 3 mg/mL). Mistura agitada mecanicamente (200 rpm) combinada com ultrassom (SB-5200DTD, China) por 30 min seguido por agitação adicional sem ultrassom por mais 30 min. Partículas lavadas abundantemente com água desionizada. GoldMag-CTAB redispersos em 10 mL água desionizada e 16 mL de solução 25 % (p/p) PSS-MA adicionados seguido por agitação (180 rpm) por 90 min. Partículas modificadas lavadas com água desionizada duas vezes e dispersas em água desionizada.

Caracterização

PSS-MA-GoldMag observados usando microscópio eletrônico de transmissão (MET, Hitachi H-600, Hitachi Corporation, Japão). Distribuição de tamanho analisada por DLS (zeta-sizer, Malvern Instruments, Reino Unido). Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR, Thermo Nicolet 5700, Thermo Nicolet Corporation, EUA) usada para caracterizar grupos funcionais de PSS-MA-GoldMag. Analisador termogravimétrico Metter Toledo SDTA 851e (TGA) usado para analisar proporção de casca polimérica superficial entre PSS-MA-GoldMag. Espectro de ressonância plasmonica de superfície (SPR) de GoldMag registrado usando espectrofotômetro UV-2550 (Shimadzu, Japão) na faixa de comprimento de onda 450–700 nm.

Preparação da Sonda Anti-D-dímero Anticorpo-PSS-MA-GoldMag

Um miligrama de GoldMag suspenso em 1 mL tampão borato/borax (0,02 M, pH 7,4), contendo 75 mg/mL de 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida (EDC). Então, 100 μg anticorpo anti-D-dímero adicionado à suspensão seguido por ultrassom por 1 h. Três mililitros tampão de bloqueio (0,02 M tampão borato/borax, pH 7,4, contendo 5 % BSA) adicionados à mistura e incubados por 1,5 h. Após separação sob campo magnético externo, composto anti-D-dímero anticorpo-PSS-MA-GoldMag mantido em tampão borato/borax a 4 °C. Conjugação de anticorpo anti-D-dímero na superfície PSS-MA-GoldMag confirmada por espectroscopia SPR e medição de espalhamento dinâmico de luz (DLS).

Solução de D-dímero preparada diluindo solução estoque de D-dímero (40 mg/mL) com soro de bezerro. Três concentrações de D-dímero (0,6, 2 e 6 μg/mL) usadas para otimizar tempo de reação entre D-dímero e complexo anti-D-dímero anticorpo-PSS-MA-GoldMag. Dez microlitros anti-D-dímero anticorpo-PSS-MA-GoldMag (0,3 mg/mL) misturados com 80 μL de solução de D-dímero (0,6, 2 e 6 μg/mL), mistura incubada a 25 °C por 10, 20, 30 e 40 min. Comprimento de onda do pico SPR do composto PSS-MA-GoldMag lido usando espectrofotômetro UV-2550.

Soluções de D-dímero com concentrações de 6, 3, 1,5, 0,75 e 0,3 μg/mL preparadas para analisar relação entre concentração de D-dímero e mudança do espectro SPR. Dez microlitros de anti-D-dímero anticorpo-PSS-MA-GoldMag (0,3 mg/mL) misturados com 80 μL de solução de D-dímero (6, 3, 1,5, 0,75 e 0,3 μg/mL) e mistura incubada a 25 °C por 30 min. Comprimento de onda do pico SPR de PSS-MA-GoldMag lido usando espectrofotômetro UV-2550.

Para avaliar se triglicerídeos, bilirrubina e hemoglobina podem interferir com nosso sistema de detecção de proteínas, soluções de D-dímero (0 e 3 μg/mL) preparadas e 22 mg/mL triglicerídeos, 0,2 mg/mL bilirrubina e 2 mg/mL amostras de hemoglobina adicionados separadamente. Dez microlitros de anti-D-dímero anticorpo-PSS-MA-GoldMag adicionados às misturas acima, e comprimento de onda do pico SPR do composto PSS-MA-GoldMag lido usando espectrofotômetro UV-2550.

Resultados e Discussão

Esquema 1 ilustra procedimentos desenvolvidos para modificação superficial e funcionalização de partículas para detecção colorimétrica de proteínas. Para estudar adsorção e incorporação de PSS-MA nas estruturas PSS-MA-GoldMag, análises espectroscópicas FTIR, espectroscopia SPR e TGA realizadas. Figura 1a mostra espectro FTIR para PSS-MA puro, PSS-MA-GoldMag e GoldMag, respectivamente. Banda larga e forte a 3000–3700 cm⁻¹ corresponde a alongamento de grupos –CO–OH e grupos hidroxila de –SO₂–OH em cadeias poliméricas. Vibrações simétricas de grupos sulfonato: (SO₃⁻) a 1037 e 1126 cm⁻¹ e vibrações de alongamento de C=C de Benzeno a 1403 e 1637 cm⁻¹. Estas bandas de absorção características de PSS-MA observadas em PSS-MA-GoldMag demonstrando que partículas brutas foram revestidas com sucesso com PSS-MA. Mudança de grupos químicos superficiais do GoldMag confirmada por claro deslocamento azul de 11 nm de 555 para 544 nm na banda SPR após modificação (Fig. 1b). Posição e largura do pico SPR relacionados à superfície, ambiente e dispersibilidade das nanopartículas. Análise TGA indicou que razão de peso de material orgânico para GoldMag foi quase 1:4 (Fig. 1c). Em baixa temperatura, perda de peso atribuída a desidratação; quando temperatura sobe, perda de peso pode ser atribuída a decomposição oxidativa de moléculas orgânicas na superfície das partículas modificadas. Durante modificação, GoldMag-CTAB eram positivamente carregados (+12,2 mV) e superfície da partícula tornou-se negativamente carregada (−24,5 mV) após revestimento PSS-MA na superfície das partículas (Fig. 1d). Todos resultados acima mostram que PSS-MA aderem com sucesso na superfície das nanopartículas.

Micrografias (Fig. 2a, b) de GoldMag e PSS-MA-GoldMag obtidas usando MET mostram que estas partículas eram monodispersas após modificação. Camada de polímero na superfície das partículas é claramente visível sob imagem microscópica eletrônica de alta resolução indicando ainda que revestimento de polímero em GoldMag foi bem-sucedido (Fig. 2b). Figura 2c mostra que diâmetro médio de PSS-MA-GoldMag é 116 nm. Suspensão PSS-MA-GoldMag tem cor vinho-avermelhado indicando boa estabilidade das nanopartículas (1 ano em água).

Estabilidade das características ópticas de GoldMag e PSS-MA-GoldMag em soluções tampão com diferentes valores de pH analisadas por espectroscopia SPR. Como mostrado na Fig. 3a, pico característico SPR foi deslocado para comprimento de onda maior de 555 nm quando GoldMag suspensos em tampão borato/borax com pH 6,0 a 9,0. Composição da solução tampão também influencia estabilidade da suspensão GoldMag. Posição do pico característico SPR moveu-se para comprimentos de onda maiores (558 nm) quando GoldMag suspensos em tampão PB (pH 7,4), tampão borato/borax (pH 7,4) e solução NaCl (10 mM) comparados àqueles em água desionizada (550 nm) (Fig. 3c). No entanto, pico SPR característico (545 ± 2 nm) não mudou significativamente quando PSS-MA-GoldMag dispersos em solução eletrolítica ou em solução tampão com diferentes valores de pH (Fig. 3b, d). Xia et al. e Storhoff et al. também reportaram que agregação de nanopartículas pode fazer espectro SPR deslocar para comprimentos de onda maiores. Potencial zeta de GoldMag e PSS-MA-GoldMag também medidos (Fig. 3e, f). Reportou-se que potencial zeta baixo (menor que ±30 mV) levará a aglomeração de partículas. Quando GoldMag suspensos em tampão PB (pH 7,4), tampão borato/borax (pH 7,4) e solução NaCl (10 mM), potencial zeta de GoldMag foi −16,7 ± 1,1 mV, −14,3 ± 2,1 mV e −8,9 ± 1,5 mV, respectivamente. Potencial zeta de GoldMag foi −14,2 ± 1,7 mV, −17 ± 1,1 mV, 13,9 ± 1,7 mV e −18,1 ± 1,6 mV quando partículas suspensas em tampão borato/borax com pH 6,0 a 9,0. No entanto, adesão de PSS-MA a GoldMag diminui dramaticamente seu potencial zeta em diferentes soluções eletrolíticas, bem como em diferentes valores de pH. Em todos casos, potencial zeta foi menor que −30 mV. Estes resultados indicam que modificação superficial de GoldMag com PSS-MA melhora significativamente sua resistência a mudanças de composição e valores de pH de soluções tampão e assegura alto nível de dispersibilidade.

Para investigar interação entre proteína e PSS-MA-GoldMag, anticorpos anti-D-dímero conjugados com PSS-MA-GoldMag através de reação entre grupos amino de proteína e grupos carboxila do polímero mediada por EDC. Como mostrado na Fig. 4a, deslocamento vermelho do pico SPR observado após reação de PSS-MA-GoldMag com anticorpos anti-D-dímero, indicando conjugação de anticorpos nas nanopartículas. Aumento do diâmetro médio de partículas de 116 para 130 nm confirma introdução do anticorpo anti-D-dímero ao PSS-MA-GoldMag (Fig. 4b). Influência de massa de anticorpo na propriedade óptica de PSS-MA-GoldMag avaliada através de espectroscopia SPR após adição de diferentes quantidades de anticorpo anti-D-dímero (20 a 200 μg) à suspensão PSS-MA-GoldMag. Como mostrado na Fig. 4c, pico SPR não mudou e manteve-se em 548 ± 3,0 nm, independente da quantidade de anticorpo adicionada.

Para avaliar atividade dos anticorpos após conjugação no PSS-MA-GoldMag, sonda A e sonda B preparadas imobilizando par de anticorpos (anticorpo 1 e anticorpo 2), e anticorpo 1 no PSS-MA-GoldMag, respectivamente. Interação entre dois tipos de sonda e D-dímero analisada por espectroscopia SPR. Melhor tempo de reação obtido observando mudança do máximo do pico SPR por 40 min após adição de três concentrações de D-dímero (0,6, 2 e 6 μg/mL) à sonda A. Como mostrado na Fig. 5a, deslocamento significativo na banda de plasmon de superfície observado resultante da agregação de PSS-MA-GoldMag através de pontes cruzadas entre ponte sanduíche antígeno-anticorpo ao longo do tempo. Em baixa concentração (0,6 μg/mL), não houve mudança significativa no espectro SPR de 20 a 40 min, indicando que 20 min é suficiente para reação de 0,6 μg/mL ou concentrações menores de D-dímero. Porém, usando concentrações média e alta de D-dímero (2 e 6 μg/mL), comprimento de onda continuou aumentando por 30 min. Isso indica que melhor tempo de reação é 30 min. Como mostrado na Fig. 5b, espectro SPR das partículas compostas revelou deslocamento vermelho distinto em ressonância plasmonica de superfície de λ_max = 550 a 570 nm e diminuição de intensidade do pico característico conforme concentração de D-dímero aumentou de 0,3 a 6 μg/mL. Isso é provocado pela agregação de PSS-MA-GoldMag causada pela conexão cruzada de D-dímero com anticorpo 1 e anticorpo 2 na sonda A. Agregação de PSS-MA-GoldMag resultou em mudança das propriedades ópticas da parte de ouro de PSS-MA-GoldMag. Jiang et al. e Li et al. também reportaram que agregação de nanouro pode fazer espectro SPR de nanopartículas deslocar para vermelho e alargar. No entanto, nenhum deslocamento vermelho observado na Fig. 5d porque interação entre D-dímero e anticorpo 1 não foi capaz de levar à montagem de nanopartículas. Além disso, deslocamento vermelho distinguível (5 nm) observado mesmo quando quantidade de D-dímero adicionada à sonda A foi tão baixa quanto 0,3 μg/mL, indicando que limite de detecção está abaixo dos valores de corte diagnósticos (0,5 μg/mL) para este biomarcador. Relação linear entre posição do pico espectral SPR e concentração de D-dímero encontrada na faixa de 0,3–6 μg/mL (r² = 0,9944) (Fig. 5c).

Como mostrado na Fig. 6, nenhum deslocamento significativo encontrado do pico característico SPR de PSS-MA-GoldMag na presença de triglicerídeos, bilirrubina e hemoglobina, respectivamente. Este resultado indica que nosso sistema de detecção de proteínas não tem reações interferentes com triglicerídeos, bilirrubina e hemoglobina.

Estes resultados mostram que PSS-MA-GoldMag é nanopartícula magnética promissora para imobilização de proteínas e pode formar ponte sanduíche na superfície da partícula via anticorpo 1-proteína alvo-anticorpo 2. Isso torna PSS-MA-GoldMag valioso como material para uso em detecção óptica point-of-care de biomarcadores baseada em imunoensaios.

Neste estudo, PSS-MA foi usado pela primeira vez para modificação de GoldMag (Esquema 1). Introdução de PSS-MA na superfície de GoldMag melhorou significativamente sua estabilidade em solução tampão. Além do impedimento estérico causado pela longa cadeia polimérica de PSS-MA, grupos carboxila e sulfo em PSS-MA causam repulsão eletrostática entre nanopartículas. Isso aumenta significativamente estabilidade de PSS-MA-GoldMag. Alto número de grupos carboxila na superfície da partícula atende requisito para conjugação com biomolécula.

Conclusões

No presente estudo, método fácil e rápido para revestir GoldMag com PSS-MA foi reportado. Resultados mostram que estabilidade coloidal e dispersibilidade de GoldMag foram significativamente melhoradas através de introdução de PSS-MA. Partículas apresentam boa estabilidade em solução tampão com ampla faixa de pH. Além disso, presença de grupo carboxila oferece opção de conjugar proteínas às nanopartículas. Tomando D-dímero e seu anticorpo como modelo, encontra-se que característica óptica pode ser ajustada através de crosslinking entre antígeno e anticorpo-nanopartícula composto. Resultados mostram que GoldMag modificado com PSS-MA pode servir como candidato muito promissor para detecção óptica baseada em imunoensaios.

Abreviações

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

GoldMag:

Nanopartículas magnéticas de ouro

MUA:

Ácido 11-mercaptoundecanoico

PEI:

Polietilenimina

PSS:

Poliestirenossulfonato

PSS-MA:

Poli(ácido 4-estirensulfônico-co-maleico)

SPR:

Ressonância plasmonica de superfície

TEM:

Microscópio eletrônico de transmissão

TGA:

Analisador termogravimétrico