Nanopartículas de Quitosana Conjugadas com Ácido Fólico Entregam Genisteína, Aumentando Eficácia Anticâncer Contra Câncer Cervical

Resumo

Neste trabalho, desenvolvemos nanopartículas de quitosana conjugadas com ácido fólico (FGCN) para entregar o isoflavonoide natural genisteína (GEN) especificamente a células de câncer cervical. Comparadas com nanopartículas de quitosana carregadas com GEN simples (GCN), as FGCN exibiram diâmetro hidrodinâmico ligeiramente maior (~165 nm) e carga superficial modestamente reduzida (+21,5 mV). Ambos os sistemas alcançaram >95% de encapsulamento do fármaco e liberação controlada em salina fosfatada tamponada (pH 7,4), liberando ~90% de GEN em 24 h. Estudos de captação celular em células HeLa mostraram aumento estatisticamente significativo (p < 0,05) de 2 a 3 vezes na internalização para FGCN versus GCN, atribuível à alta afinidade do ácido fólico pelo receptor de folato-α (FR-α) superexpresso. Ensaios de citotoxicidade revelaram que o IC₅₀ da GEN caiu de 33,8 µg/mL (fármaco livre) para 14,6 µg/mL quando entregue via FGCN, enquanto GCN reduziu para 26,5 µg/mL. Análise de apoptose demonstrou que FGCN induziu >55% de morte celular apoptótica, marcadamente maior que GCN (~22%) e GEN livre. Estes achados confirmam que a conjugação com folato melhora a entrega de GEN, captação celular e eficácia antitumoral em células de câncer cervical.

Introdução

O câncer cervical permanece uma das principais causas de morbidade entre mulheres mundialmente, impulsionado principalmente por infecção por papilomavírus humano (HPV) de alto risco. Embora vacinas profiláticas (Gardasil, Cervarix) e terapias convencionais — cirurgia, radioterapia e quimioterapia — estejam disponíveis, elas são insuficientes para muitas pacientes, especialmente em ambientes de baixos recursos. Compostos naturais como flavonoides oferecem atividade anticâncer com menor toxicidade sistêmica. A genisteína, um isoflavonoide da soja, inibe quinases tirosina-proteína e NF-κB, prende o ciclo celular em G2/M e induz apoptose; no entanto, sua utilidade clínica é limitada pela baixa solubilidade aquosa (~1,45 µg/mL) e baixa biodisponibilidade. A encapsulação em nanopartículas pode melhorar essas propriedades físico-químicas, aumentar a acumulação tumoral via efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR) e superar a multirresistência a fármacos.

Quitosana, um polissacarídeo biodegradável rico em aminas primárias, é biocompatível e passível de modificação de superfície. A conjugação de ácido fólico (AF) à quitosana visa o receptor-α de folato, superexpresso em muitas células de câncer cervical, permitindo endocitose mediada por receptor e entrega seletiva.

Métodos

Materiais

Genisteína (Aladdin Chemicals, Xangai), quitosana (85% desacetilada, Sigma-Aldrich), ácido fólico, EDC e NHS (Sigma-Aldrich) foram utilizados como recebidos.

Preparação de Nanopartículas de Quitosana Conjugadas com AF Carregadas com GEN

O ácido fólico foi primeiro ativado com EDC/NHS em DMSO e conjugado à quitosana (0,5% p/p) sob agitação a pH 8. O conjugado AF-quitosana resultante foi purificado por diálise. GEN, quitosana e AF-quitosana (10:1 p/p) foram dissolvidos em DMSO e adicionados gota a gota a 0,5% Tween-80, seguido de agitação por 3 h. O solvente foi evaporado, e a suspensão centrifugada a 10.000 rpm (4 °C) por 30 min. Carregamento de fármaco (DL%) e eficiência de encapsulamento (EE%) foram calculados por HPLC (Agilent LC-1100, coluna C18, 60% MeOH/40% H₂O, 1 mL min⁻¹).

Tamanho de Partícula e Morfologia de Superfície

Espalhamento dinâmico de luz (Malvern Zetasizer Nano ZS90) mediu tamanho e polidispersibilidade. Microscopia eletrônica de transmissão (JEOL JEM-1230, 100 kV) visualizou a morfologia.

Liberação In Vitro do Fármaco

A liberação foi avaliada por diálise (PMCO 3500) em PBS (pH 7,4) a 37 °C com agitação suave. Amostras foram coletadas em intervalos predeterminados e analisadas por HPLC.

Cultura Celular e Captação

Células HeLa (ATCC) foram mantidas em DMEM +10% SFB. A captação celular de GCN e FGCN carregados com cumarina-6 foi quantificada por leitura em microplaca de fluorescência (excitação 430 nm, emissão 485 nm) e visualizada por microscopia confocal a laser (Olympus Fluoview).

Ensaios de Citotoxicidade, Vivo/Morto e Apoptose

MTT (5 mg mL⁻¹) mediu viabilidade; valores de IC₅₀ foram ajustados usando GraphPad Prism. Coloração vivo/morto empregou calceína AM/etídio homodímero. Apoptose foi quantificada por coloração annexina V/PI e citometria de fluxo.

Análise Estatística

Dados são apresentados como média ± DP (n = 3). Significância estatística foi avaliada pelo teste t de Student (p < 0,05).

Resultados e Discussão

Caracterização Físico-Química

GCN exibiu diâmetro médio de 140 nm (+26 mV), enquanto FGCN mediu 165 nm (+21,5 mV). Ambos tiveram EE% >95% e DL% entre 10-12%. Tamanho e potencial zeta permaneceram estáveis após 3 meses de armazenamento a 4 °C.

Cinética de Liberação In Vitro

Tanto GCN quanto FGCN liberaram ~35-40% de GEN nas primeiras 4 h, alcançando ~90% de liberação cumulativa em 24 h. O leve atraso na liberação de FGCN é atribuído ao revestimento de AF, que prolonga a difusão do fármaco.

Captação Celular

Ensaios de fluorescência mostraram captação 2-3 vezes maior de FGCN comparado a GCN a 4 h (p < 0,05). Imagens confocais confirmaram fluorescência intracelular intensa para FGCN, indicando endocitose mediada por AF bem-sucedida.

Citotoxicidade

Valores de IC₅₀: GEN livre 33,8 µg mL⁻¹ → GCN 26,5 µg mL⁻¹ → FGCN 14,6 µg mL⁻¹ (24 h). A eficácia superior de FGCN está ligada à captação aprimorada e liberação controlada, reduzindo o efluxo mediado por P-glicoproteína.

Apoptose

Coloração annexina V/PI revelou taxas de apoptose de 0% (GEN livre), 22% (GCN) e 55% (FGCN), ressaltando a potência da entrega direcionada.

Ensaio Vivo/Morto

Células tratadas com FGCN exibiram fluorescência verde mínima e coloração vermelha abundante, consistente com alta morte celular, enquanto células tratadas com GEN livre permaneceram amplamente viáveis.

Conclusões

Nanopartículas de quitosana conjugadas com ácido fólico melhoram marcadamente a entrega de genisteína a células HeLa de câncer cervical, aumentando a captação celular, reduzindo IC₅₀ para 14,6 µg mL⁻¹ e induzindo >55% de apoptose. Estes resultados apoiam avaliação pré-clínica adicional de FGCN como plataforma promissora de anticâncer direcionado.

Abreviações

EPR

Permeabilidade e retenção aumentadas

FGCN

Nanopartículas de quitosana carregadas com GEN conjugadas com ácido fólico

FR

Receptor de folato

GCN

Nanopartículas de quitosana carregadas com GEN

GEN

Genisteína