Nanopartículas de Ouro Funcionalizadas com Ácido Litocólico Induzem Apoptose Seletiva em Células de Câncer de Fígado

Resumo

Nanopartículas de ouro (AuNPs) são reconhecidas pela sua biocompatibilidade, propriedades ópticas e potencial para liberação de fármacos. Neste estudo, projetamos AuNPs com um espaçador de polietilenoglicol (PEG) e ligante de ácido litocólico (LCA) via acoplamento carboxilato, resultando em AuNP@MPA‑PEG‑LCA. Ensaios de citotoxicidade revelaram que AuNP@MPA‑PEG‑LCA exibe seletividade pronunciada, inibindo marcadamente múltiplas linhagens de carcinoma hepatocelular (HepG2, SMMC‑7721) enquanto poupa hepatócitos normais (QSG‑7701) e células de câncer de mama (MCF‑7). A indução de apoptose foi confirmada por condensação nuclear (Hoechst 33342), ligação de anexina V‑FITC, perda de potencial de membrana mitocondrial (JC‑1) e coloração com laranja de acridina/brometo de etídio (AO/EB). As nanopartículas desencadearam acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS), levando a disfunção mitocondrial e morte celular programada. Estes achados demonstram que AuNP@MPA‑PEG‑LCA é um nanoterapêutico direcionado promissor para câncer de fígado.

Introdução

Nanopartículas de ouro possuem ressonância óptica única, estabilidade química e ampla área de superfície, tornando-as atrativas para aplicações biomédicas, incluindo liberação de fármacos, imagem e terapia fototérmica. Sua geometria esférica facilita a internalização celular eficiente e minimiza efeitos off‑target. A funcionalização de AuNPs com ligantes direcionadores ou polímeros melhora ainda mais seu índice terapêutico, particularmente em oncologia.

Ácido litocólico (LCA), um ácido biliar secundário, demonstrou potente atividade antitumoral contra câncer de fígado via apoptose. Como molécula natural, o LCA pode servir como ligante para guiar AuNPs a tecidos hepáticos, melhorar solubilidade e modular vias de sinalização intracelular.

A combinação da biocompatibilidade das AuNPs com as propriedades supressoras de tumor do LCA pode gerar um agente anticancerígeno seletivo que explora vias mitocondriais mediadas por ROS para desencadear apoptose em células de hepatocarcinoma.

Materiais e Métodos

Materiais

Todos os reagentes foram adquiridos da Sigma‑Aldrich, salvo indicação contrária. Reagentes de cultura celular (RPMI‑1640, FBS) foram obtidos da Invitrogen. Linhagens de carcinoma hepatocelular humano (HepG2, SMMC‑7721), hepatócitos normais (QSG‑7701) e células de câncer de mama (MCF‑7) foram adquiridas do Instituto de Ciências Biológicas de Xangai.

Síntese de AuNP@MPA

AuNPs revestidas com citrato (diâmetro médio 4,0 ± 0,5 nm) foram sintetizadas pelo método de Turkevich usando HAuCl₄ e NaBH₄. As nanopartículas resultantes foram subsequentemente revestidas com ácido 3‑mercaptopropiônico (MPA) a pH 11 para fornecer grupos carboxilato para conjugação posterior.

Conjugação com PEG

AuNP@MPA (0,0875 mmol) foi ativado com NHS (0,0875 mmol) e EDC (0,035 mmol) em tampão MES 50 mM, seguido pela adição de NH₂‑PEG₁₀₀₀‑NH₂ (0,045 mmol). Após 24 h a 25 °C, as nanopartículas PEGiladas (AuNP@MPA‑PEG) foram isoladas por centrifugação.

Fixação do Ácido Litocólico

AuNP@MPA‑PEG foi misturado com LCA (0,045 mmol) em DMF anidro e agitado por 24 h a 25 °C. O produto final, AuNP@MPA‑PEG‑LCA, foi purificado por centrifugação repetida.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

A morfologia e tamanho das partículas foram examinados em um MET JEOL JEM‑200CX operando a 200 kV. Suspensões de nanopartículas foram depositadas em grades de cobre de 300 malhas.

Ensaios de Citotoxicidade

A viabilidade celular após 48 h de exposição a AuNPs (0,2–1,0 mg mL⁻¹) foi medida pelo ensaio MTT. A absorbância a 570 nm foi registrada em um leitor de placas Tecan Infinite M200.

Morfologia Apoptótica (Hoechst 33342)

Células HepG2 foram tratadas com 0,5 mg mL⁻¹ de AuNP@MPA‑PEG‑LCA por 24 e 48 h, então coradas com 10 µg mL⁻¹ de Hoechst 33342 por 30 min. A morfologia nuclear foi imageada com microscópio confocal Leica‑SP8.

Apoptose Precoce (Anexina V‑FITC)

Após 6 h de tratamento com 0,5 mg mL⁻¹ de AuNP@MPA‑PEG‑LCA, células HepG2 foram coradas com anexina V‑FITC e analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur, BD). Imagens confocais também foram adquiridas.

Potencial de Membrana Mitocondrial (PMM)

Corante JC‑1 (10 µg mL⁻¹) foi usado para avaliar alterações no PMM em células HepG2 tratadas com AuNP@MPA‑PEG‑LCA (6 h). Tanto citometria de fluxo quanto microscopia confocal foram empregadas.

Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)

ROS intracelulares foram quantificados usando H₂DCF‑DA (10 µM) após 6 h de exposição a 0,5 mg mL⁻¹ de AuNP@MPA‑PEG‑LCA. A fluorescência foi medida por citometria de fluxo e microscopia confocal.

Resultados e Discussão

Caracterização das Nanopartículas

AuNP@MPA‑PEG‑LCA manteve forma esférica com diâmetro médio de 16,0 ± 1,2 nm, confirmado por MET. As camadas de PEG e LCA contribuíram para o aumento do tamanho hidrodinâmico em comparação ao núcleo AuNP@MPA (4,0 nm). Estas dimensões são ideais para o efeito de permeabilidade e retenção (EPR) em tecidos tumorais.

Esquema da síntese de AuNP@MPA‑PEG‑LCA

Imagens de MET de a AuNP@MPA, b AuNP@MPA‑PEG, e c AuNP@MPA‑PEG‑LCA

Citotoxicidade Seletiva

Ensaios MTT mostraram citotoxicidade desprezível de AuNP@MPA em todas as linhagens. Em contraste, AuNP@MPA‑PEG‑LCA reduziu dose‑dependente a viabilidade de células HepG2 e SMMC‑7721, com valores de IC₅₀ abaixo de 0,6 mg mL⁻¹, enquanto células QSG‑7701 e MCF‑7 foram minimamente afetadas. Este perfil seletivo ressalta a capacidade de direcionamento conferida pelo LCA.

Viabilidade celular de AuNP@MPA e AuNP@MPA‑PEG‑LCA incubadas com HepG2, SMMC‑7721, QSG‑7701 e MCF‑7 por 48 h

Morfologia Apoptótica

Coloração com Hoechst revelou condensação nuclear progressiva, fragmentação e marginação da cromatina em células HepG2 tratadas com AuNP@MPA‑PEG‑LCA ao longo de 48 h, indicando apoptose tardia. Células controle e tratadas com AuNP@MPA mantiveram morfologia nuclear uniforme.

Características morfológicas do núcleo de células HepG2 coradas com Hoechst 33342. Células incubadas com AuNP@MPA‑PEG‑LCA (0,5 mg mL⁻¹) por a 0 h, b 24 h, c 48 h, e d AuNP@MPA (0,5 mg mL⁻¹) por 48 h. Células apoptóticas exibiram núcleos condensados e fragmentados, e encolhimento do volume celular; barra de escala 20 µm

Confirmação por Anexina V‑FITC

Coloração com anexina V demonstrou translocação clara de fosfatidilserina para a folheta externa da membrana plasmática em células tratadas. Citometria de fluxo quantificou taxa de apoptose de 38,45% versus 8,16% em controles, confirmando indução de apoptose precoce.

Resultados de apoptose de a imagens confocais e b dados de citometria de fluxo de células HepG2 tratadas com AuNP@MPA‑PEG‑LCA (0,5 mg mL⁻¹). Células coradas com anexina V‑FITC (excitação 488 nm, emissão 500–560 nm); barra de escala 20 µm

Despolarização Mitocondrial

Análise JC‑1 revelou perda de fluorescência vermelha de agregados e aumento do sinal verde de monômeros, indicando colapso do PMM em células tratadas. Citometria de fluxo confirmou redução significativa da razão vermelho/verde, corroborando disfunção mitocondrial como evento downstream da apoptose.

a Imagens de fluorescência de células marcadas com JC‑1 visualizadas por microscopia confocal e b efeitos de AuNP@MPA‑PEG‑LCA no PMM analisados por citometria de fluxo

Geração de ROS

Coloração com H₂DCF‑DA mostrou aumento marcado de fluorescência verde em células HepG2 tratadas, refletindo produção elevada de ROS. Quantificação por citometria de fluxo confirmou a tendência, sugerindo que estresse oxidativo precede despolarização mitocondrial e apoptose.

Análise de produção de ROS após tratamento de células HepG2 com AuNP@MPA‑PEG‑LCA por 6 h. Conteúdo de ROS investigado por a microscopia confocal (excitação 488 nm, emissão 530 nm) e b citometria de fluxo (excitação 488 nm, emissão 525 nm)

Conclusões

Fabricamos com sucesso nanopartículas AuNP@MPA‑PEG‑LCA (~16 nm) que inibem seletivamente o crescimento de células de hepatocarcinoma ao desencadear apoptose. Ensaios abrangentes — morfologia nuclear, ligação de anexina V, perda de PMM por JC‑1 e elevação de ROS — confirmam que a ação terapêutica é mediada por disfunção mitocondrial induzida por ROS. Estes resultados posicionam AuNP@MPA‑PEG‑LCA como nanomedicina direcionada promissora para tratamento de câncer de fígado.

Abreviações

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

DMF:

Dimetilformamida

EDC:

Cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida

FBS:

Soro fetal bovino

H₂DCF‑DA:

Diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína

HepG2:

Células de carcinoma hepatocelular humano

JC‑1:

5,5′,6,6′-Tetracloro-1,1′,3,3′-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina iodeto

LCA:

Ácido litocólico

MCF‑7:

Células de câncer de mama humano

MES:

Ácido 4-morfolinoetano-sulfônico

MMP:

Potencial de membrana mitocondrial

MPA:

Ácido 3-mercaptopropiônico

MTT:

Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio

NHS:

1-Hidroxipirrolidina-2,5-diona

PEG:

Polietilenoglicol

PS:

Fosfatidilserina

QSG‑7701:

Células de hepatócitos normais humanos

ROS:

Espécies reativas de oxigênio

SMMC‑7721:

Células de carcinoma hepatocelular humano

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão