Ação Antioxidante e Anti-Amiloide Sinérgica de Nanopartículas de Selênio com Ácido Clorogênico In Vitro

Resumo

O acúmulo de placas de amiloide‑β (Aβ) e espécies reativas de oxigênio (ROS) fundamenta a patologia da doença de Alzheimer (DA). Relatamos um novo nanocompósito — nanopartículas de selênio revestidas com ácido clorogênico (CGA@SeNPs) — que combina a capacidade de ligação a Aβ dos SeNPs com a potência antioxidante do ácido clorogênico (CGA). Ensaios in vitro revelam que, embora o CGA livre elimine ROS induzidos por Aβ, ele falha em bloquear a agregação de Aβ ou proteger membranas neuronais. Em contrapartida, CGA@SeNPs inibem marcadamente a fibrilação de Aβ40, reduzem a geração de ROS e preservam a viabilidade e integridade de membrana de células PC12, superando o CGA isolado. Estes achados destacam CGA@SeNPs como candidato terapêutico promissor de duplo alvo para DA.

Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo marcado por declínio cognitivo e perda neuronal. Uma marca registrada da DA é a deposição extracelular de placas de amiloide‑β (Aβ) mal dobradas, que não apenas perturbam a função sináptica mas também catalisam a produção de ROS, impulsionando dano oxidativo a DNA, lipídios e proteínas. Os oligômeros e protofibrilas neurotóxicos de Aβ são cada vez mais reconhecidos como os principais culpados na patogênese da DA.

Nanopartículas (NPs) oferecem atributos físico-químicos únicos — tamanho pequeno, grande área de superfície e reatividade ajustável — que permitem interagir com Aβ, modular sua agregação e entregar agentes terapêuticos. Nanopartículas de selênio (SeNPs) são especialmente atrativas devido à sua biocompatibilidade, baixa toxicidade e papel essencial na homeostase redox celular. Estudos prévios demonstraram que a modificação de superfície de SeNPs com peptídeos anti-amiloide pode aumentar sua sequestração de Aβ. No entanto, o impacto da conjugação de antioxidantes naturais a SeNPs tanto na inibição da agregação quanto na captação de ROS permanece inexplorado.

Ácido clorogênico (CGA) é um polifenol abundantemente presente no café e em várias frutas. Exibe potentes efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e neuroprotetores, mas sua utilidade clínica é limitada pela baixa biodisponibilidade. Ao enxertar CGA em SeNPs, visamos superar estas limitações e avaliar o potencial terapêutico do compósito contra a toxicidade mediada por Aβ.

Materiais e Métodos

Materiais e Linhagens Celulares

Peptídeo Aβ40, dióxido de selênio, borohidreto de sódio, MTT, Tioflavina T, DCFH‑DA e outros reagentes foram obtidos da Sigma. CGA foi adquirido da Aladdin. Células PC12 foram cultivadas em DMEM suplementado com 5% FBS e 10% soro de cavalo a 37 °C, 5% CO₂.

Preparação de CGA@SeNPs

SeNPs foram sintetizados pela redução de uma mistura de CGA‑selenito de sódio com NaBH₄. A razão ótima CGA:SeO₂ foi 1:6, resultando em partículas esféricas de ~100 nm confirmadas por MET.

Caracterização

• Microscopia eletrônica de transmissão (MET) para morfologia.
• Espectroscopia de raios X dispersiva em energia (EDX) para composição elementar.
• Espectroscopia UV‑vis e fluorescência para propriedades ópticas.
• Espalhamento dinâmico de luz (DLS) para estabilidade de tamanho em PBS.

Ensaios Antioxidantes e de ROS

Atividades de captação de radicais hidroxila, ABTS⁺ e superóxido foram quantificadas usando kits comerciais. Produção de H₂O₂ induzida por Aβ foi medida por fluorescência de DCFH‑DA.

Monitoramento da Agregação de Aβ

Fluorescência de Tioflavina T acompanhou a formação de fibrilas ao longo de 5 dias. MET visualizou morfologia de fibrilas. Espalhamento de luz de ressonância (RLS) avaliou afinidade de ligação entre CGA@SeNPs e monômeros de Aβ.

Avaliação de Citotoxicidade e Apoptose

Ensaios MTT e liberação de LDH mediram viabilidade celular e integridade de membrana, respectivamente. ROS intracelular foi detectado por DCFH‑DA, enquanto coloração TUNEL‑DAPI identificou núcleos apoptóticos em células PC12 expostas a agregados de Aβ ± CGA ou CGA@SeNPs.

Resultados e Discussão

Caracterização de CGA@SeNPs

Imagens de MET mostraram esferas uniformes de ~100 nm. EDX confirmou Se (30%) e sinais característicos de CGA (C 52,6%, O 1,5%). A absorção UV‑vis deslocou de 334 nm (CGA livre) para 337 nm após conjugação, enquanto a emissão de fluorescência deslocou para o vermelho de 443 nm para 438 nm, confirmando fixação na superfície. Dados de DLS demonstraram tamanho de partícula estável em PBS por 7 dias.

Atividade Antioxidante Aumentada

CGA@SeNPs exibiram captação dose‑dependente de radicais hidroxila, ABTS⁺ e superóxido, alcançando 70%–95% de inibição a 60 µg/mL — superior a CGA ou vitamina C. Em ensaios de H₂O₂ induzido por Aβ40, CGA@SeNPs reduziram geração de ROS mais eficazmente que CGA livre, ressaltando capacidade antioxidante sinérgica.

Inibição da Agregação de Aβ

Fluorescência de Tioflavina T revelou que CGA@SeNPs suprimem dose‑dependente a formação de fibrilas de Aβ40, reduzindo fluorescência de pico em ~50% a 60 µg/mL. MET corroborou: nenhuma fibrila foi observada na presença de CGA@SeNPs, enquanto CGA sozinho não alterou morfologia de fibrilas. Dados de RLS indicaram forte ligação de CGA@SeNPs a monômeros de Aβ, provavelmente impedindo nucleação por obstáculo estérico.

Efeitos Neuroprotetores

Em células PC12, Aβ40 reduziu viabilidade a 53%. CGA@SeNPs restauraram viabilidade a ~95%, enquanto CGA apenas melhorou para 66%. Liberação de LDH espelhou estas tendências, com CGA@SeNPs normalizando integridade de membrana. Ensaios de ROS intracelular e apoptose (DCFH‑DA, TUNEL) demonstraram que CGA@SeNPs atenuaram estresse oxidativo e fragmentação de DNA induzidos por Aβ, enquanto CGA ofereceu proteção parcial.

Conclusões

Ácido clorogênico conjugado a nanopartículas de selênio confere ao compósito funções duplas anti-amiloide e antioxidante. CGA@SeNPs ligam Aβ, previnem montagem de fibrilas, eliminam ROS e protegem células neuronais de dano de membrana e apoptose. Comparado ao CGA livre, o nanocompósito oferece eficácia e estabilidade aprimoradas, posicionando‑o como estratégia terapêutica promissora para mitigar patologia da DA.

Abreviações

ABTS⁺

Ácido 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico)

AD

Doença de Alzheimer

Aβ

Amiloide‑β

CGA

Ácido clorogênico

DCFH‑DA

Diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína

LDH

Lactato desidrogenase

MTT

Brometo de tiazolil azul tetrazólio

ROS

Espécies reativas de oxigênio

SeNPs

Nanopartículas de selênio

TEM

Microscópio eletrônico de transmissão

ThT

Tioflavina T

TUNEL

Marcação de extremidades de DNA por transferase terminal