Efeito aprimorado da combinação de ácido clorogênico em nanopartículas de selênio na inibição da agregação de amilóide β e formação de espécies reativas de oxigênio in vitro

Resumo

A deposição de placas β-amiloide (Aβ) e a formação de espécies reativas neurotóxicas de oxigênio (ROS) é uma assinatura patológica significativa da doença de Alzheimer (AD). Aqui, uma nova estratégia é relatada para combinar a propriedade única de absorção de Aβ de nanopartículas de selênio com o agente antioxidante natural ácido clorogênico (CGA) para formar CGA @ SeNPs. A avaliação biológica in vitro revelou que o CGA poderia limpar as ROS induzidas pelos agregados Aβ40, mas não inibiu a agregação Aβ40 e danos à membrana celular que também foram causados pelos agregados Aβ40. Curiosamente, CGA @ SeNPs mostram um efeito de inibição intensificado na agregação de Aβ40 e, mais importante, protegem as células PC12 da morte celular induzida por agregação Aβ. Acredita-se que CGA @ SeNPs são mais eficientes do que CGA na redução do tóxico de Aβ40 em uso de longo prazo.

Histórico

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa progressiva irreversível caracterizada por deficiências cognitivas progressivas e perda neuronal [1]. Hoje é amplamente aceito que o acúmulo de placas amiloides extracelulares no cérebro é uma característica patológica comum na DA [2, 3]. As placas contêm o dobramento incorreto e a agregação da proteína β-amiloide (Aβ) [4]. Embora o papel exato das protofibrilas ou oligômeros Aβ na patogênese da DA não seja totalmente compreendido, evidências acumuladas sugerem que a maioria deles são espécies tóxicas responsáveis pela disfunção neuronal e morte [5,6,7,8]. Além disso, os agregados Aβ já existem no cérebro de um paciente com DA. Esses agregados continuarão a formatar espécies reativas de oxigênio à neurotoxina (ROS), o que desencadeará uma série de danos a componentes celulares como DNA, lipídios e proteínas e causará o estresse oxidativo na DA [9]. Danos ao neurônio geralmente resultam em déficits de aprendizagem e memória. Portanto, prevê-se que a inibição da agregação de β amiloide e a formação de espécies reativas de oxigênio podem ser alvos terapêuticos promissores para prevenir ou aliviar a patologia da DA.

Os nanomateriais têm propriedades físico-químicas exclusivas, como tamanho pequeno, grande área de superfície e alta reatividade. Recentemente, a pesquisa enfatizou que, com modificações de superfície apropriadas, as nanopartículas (NPs) podem ser usadas como ferramentas para entrega de drogas, imagens e aplicações terapêuticas na DA [10,11,12]. Geralmente, os NPs têm grande área de superfície, o que traz grandes capacidades de adsorção. Especificamente, Aβ pode se ligar a alguns NPs para retardar os processos de fibrilação de Aβ. Por exemplo, a ligação de um monômero Aβ em polioxometalatos reduziria a concentração de monômeros livres e desviaria o equilíbrio da fibrilação [13]. Entre esses nanomateriais, as nanopartículas de selênio (SeNPs) apresentam vários recursos que os tornam adequados para aplicações biomédicas, como preparação direta e estabilidade. O selênio é um oligoelemento essencial, que desempenha papéis importantes na regulação redox celular, desintoxicação e proteção do sistema imunológico [14]. Portanto, comparando com os compostos inorgânicos e orgânicos de selênio, os SeNPs apresentam melhor biocompatibilidade e menor toxicidade [15]. Hoje em dia, modificações de superfície de NPs facilitam a afinidade de ligação entre NPs e Aβ e ajudam a remediar as propriedades bioquímicas das moléculas conjugadas. Nosso estudo anterior descobriu que a capacidade anti-amilóide de SeNPs poderia ser aumentada pelo enxerto de um peptídeo anti-amilóide (LPFFD) em uma superfície SeNP [12]. No entanto, a maioria dessas pesquisas não se concentrou na capacidade antioxidante dos NPs após as modificações da superfície.

O ácido clorogênico (CGA) é o principal componente polifenol em frutas como maçã, pera e bagas e é particularmente abundante no café [16]. O CGA tem uma série de propriedades farmacológicas, como anticancerígena, antiinflamatória e antibacteriana [16]. Especialmente, o CGA tem atividades antioxidantes e neuroprotetoras, o que permite a aplicação no tratamento da doença de Alzheimer [17, 18]. No entanto, o efeito do CGA na agregação de Aβ nunca foi relatado. Além disso, o uso de CGA é limitado por sua baixa biodisponibilidade e estabilidade, e apenas um terço do CGA absorvido do trato gastrointestinal atinge a circulação sanguínea [19]. Vários estudos relataram que, devido ao pequeno tamanho dos NPs, eles podem entrar na corrente sanguínea diretamente por inalação, ingestão e transporte através da circulação para muitos órgãos. Portanto, a fim de resolver este problema, exploramos a ligação de CGA a SeNPs (CGA @ SeNPs) para melhorar a eficácia terapêutica potencial de CGA. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar a potencial eficácia terapêutica dos CGA @ SeNPs na agregação e antioxidação anti-Aβ. Até onde sabemos, não há relato anterior do uso de CGA @ SeNPs para terapia de DA.

Métodos / Experimental

Materiais e linhas celulares

Aβ40 foi sintetizado em GL Biochem Ltd. (Shanghai, China). Dióxido de selênio (Na ₂ SeO ₃ ), NaBH ₄ , brometo de azul de tiazolil tetrazólio (MTT), tioflavina T e diacetato de 2 ', 7' -diclorodi-hidrofluoresceína (DCFH-DA) eram da Sigma (St. Louis, MO, EUA). A CGA foi adquirida da Aladdin (Shanghai, China). Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino (FBS) e soro de cavalo foram obtidos da Gibco (Life Technologies AG, Suíça). Células PC12 (feocromocitoma de rato, American Type Culture Collection) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 5% de FBS e 10% de soro de cavalo a 37 ° C em 5% de CO ₂ ambiente umidificado a 37 ° C.

Preparação de CGA @ SeNPs

Primeiro, soluções estoque de 25 mM CGA, 0,1 M Na ₂ SeO ₃ e NaBH 0,1 M ₄ estavam preparados. Em seguida, alíquota de 200 μL de Na ₂ SeO ₃ solução foi misturada com volumes variados de CGA, e as razões de concentração de reagente de Na ₂ SeO ₃ para CGA eram 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 e 1:8. Depois disso, 200 μL de NaBH 0,1 M ₄ foi adicionado à mistura e agitado durante 30 min. A cor da solução foi alterada para vermelho. Excesso de CGA e Na ₂ SeO ₃ foram removidos por diálise. Descobrimos que a melhor razão de concentração de Na ₂ SeO ₃ para CGA era 1:6.

Caracterização de CGA @ SeNPs

Os CGA @ SeNPs preparados foram caracterizados por microscópio eletrônico de transmissão (TEM; Hitachi, H-7650), espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR; espectrômetro Equinox 55 IR) e espectroscopia UV-vis (espectrofotômetro Carry 5000). A distribuição de tamanho foi determinada pelo analisador de partículas Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited). A fluorescência das nanopartículas foi realizada com um espectrofluorômetro JASCO FP6500 ( λ ex =350 nm).

H ₂ O ₂ Ensaio de geração

O radical hidroxil, 2, 29-azinobis- (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS ⁺ ), e as atividades de eliminação do ânion superóxido de CGA e CGA @ SeNPs foram analisadas por kits comerciais (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). O poder de redução das amostras foi medido da seguinte forma:2 mL de CGA ou CGA @ SeNPs foram incubados com 2 mL de tampão de fosfato (0,2 mol / L, pH 6,6) e 2 mL de K ₃ Fe (CN) ₆ (1%, w / v ) a 50 ° C por 20 min. Depois disso, a reação foi interrompida pela adição de 2,5 mL de ácido tricloroacético (10%, w / v ) e centrifugado a 3000 rpm por 10 min. Dois mililitros do sobrenadante foram misturados com 2 mL de água destilada e 1 mL de FeCl ₃ (0,1%, w / v ) à temperatura ambiente por 10 min. Finalmente, a absorbância foi medida a 700 nm. A vitamina C (Vc) foi usada como controle positivo no ensaio de atividade antioxidante.

O H ₂ O ₂ geração em Aβ40 foi analisada por DCFH-DA. Solução estoque DCFH-DA (1 mM) adquirida do Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China). Quatro micromolares de peroxidase de rábano (HRP) foram preparados em tampão (Tris-HCl 20 mM / NaCl 150 mM, pH 7,4). Soluções de amostra contendo 35 μM Aβ40 com ou sem 20, 40 e 60 μg / mL CGA @ SeNPs / CGA foram incubadas a 37 ° C por 3 dias. Ascorbato (10 μM) foi adicionado a cada amostra e posteriormente incubado por 1 h. As análises de amostra foram realizadas adicionando DCFH-DA (20 μL, 100 μM) e HRP (2 μL, 0,04 μM) à solução de amostra (10 μL). Os espectros de fluorescência com excitação e emissão de comprimentos de onda de 488 e 525 nm foram medidos por um espectrofluorômetro JASCO FP6500.

Medições de fluorescência com tioflavina T

A cinética da fibrilação Aβ40 foi detectada usando o corante tioflavina T (ThT). Resumidamente, 35 μM Aβ40 foi incubado com 20, 40 e 60 μg / mL de CGA @ SeNPs / CGA a 37 ° C de 0 a 5 dias. A cada dia, 50 μL de solução foram retirados e adicionados a 200 μL de solução ThT (15 μM de ThT em 50 mM de PBS, pH 7,4). Então, a excitação de ThT foi de 440 nm, e o comprimento de onda de emissão de 490 nm foi registrado.

TEM

Morfologias de Aβ40 na presença ou ausência de CGA @ SeNPs / CGA foram observadas por TEM (Hitachi, H-7650). As amostras foram preparadas da mesma forma que no ensaio de fluorescência ThT. Após 3 dias de incubação, 10 μL de solução de amostra foram aplicados nas grades de cobre revestidas com carbono por 10 min. Em seguida, cada grade foi corada com 1,5% ( w / v ) ácido fosfotúngstico (pH 7,4) e deixado secar.

A ligação de nanopartículas a Aβ40 também foi confirmada por TEM. Em primeiro lugar, 35 μM Aβ40 foi incubado por 3 dias para formatar as fibras. Em seguida, nanopartículas de 20 μg / mL foram adicionadas à solução pré-incubada e incubadas por mais 6 h. Depois disso, esta amostra foi examinada em TEM.

Medições de dispersão de luz de ressonância

O espalhamento de luz de ressonância (RSL) foi medido de acordo com o método de Yu et al. [20] com algumas modificações. Uma certa quantidade de dispersão de Aβ40 foi diluída para 1 mL com H ₂ O, enquanto a concentração final de CGA @ SeNPs variou de 0,05 a 0,45 μg / mL. A mistura foi incubada durante 10 min. As intensidades RLS foram registradas no fluorospectrofotômetro Cary Eclipse (tecnologias Agilent, EUA) por varredura sincronizada dos monocromadores de excitação e emissão (Δ λ =0 nm) entre 200 e 800 nm. Tanto a excitação quanto a largura da fenda de emissão foram ajustadas para 5 nm.

Ensaio de citotoxicidade

A viabilidade celular foi analisada usando o ensaio MTT. As células PC12 foram semeadas a uma densidade de 5000 células por poço em placas de 96 poços em meio fresco sem FBS. Aβ (35 μM) foi co-incubado com ou sem 60 μg / mL CGA @ SeNPs / CGA por 3 dias. Em seguida, as células foram tratadas com essas amostras por mais 72 horas. Após a incubação, as células foram tratadas com 10 μL de MTT por poço, seguindo o manual do ensaio Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation (Promega). A liberação de lactato desidrogenase (LDH) foi avaliada usando o kit de detecção comercial. As células PC12 foram tratadas como acima. No final dos tratamentos, a placa de 96 poços foi centrifugada a 1500 × g por 10 min. A atividade de LDH nos sobrenadantes foi medida de acordo com as instruções do fabricante.

Geração de ROS intracelular

Os efeitos de CGA @ SeNPs / CGA na geração de ROS intracelular induzida por Aβ40 foram monitorados pelo ensaio DCFH-DA. As células PC12 (1 × 10 ⁵ por poço) foram tratados da mesma forma que no ensaio MTT. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas com DCFH-DA (10 mM) a 37 ° C por 30 min. O nível de ROS intracelular foi examinado em microscópio de fluorescência (ampliação x 200) com os comprimentos de onda de excitação e emissão em 488 nm e 525 nm, respectivamente. Para medir o nível de ROS intracelular, as células foram tratadas da mesma forma e colhidas por centrifugação, ressuspensas em PBS. Em seguida, as células foram analisadas por citometria de fluxo.

Ensaio de Co-coloração TUNEL-DAPI

As células PC12 foram tratadas da mesma forma que no ensaio MTT. Em seguida, as células nas lâminas da câmara foram fixadas com forma-aldeído 3,7% e permeabilizadas com Triton X-100 0,1% em PBS. O ensaio de coloração foi realizado usando o kit de ensaio de rotulagem terminal de transferase dUTP nick end (TUNEL) (KeyGen BioTECH, Nanjing, China) seguindo o protocolo do fabricante. As imagens foram capturadas em microscópio de fluorescência (ampliação de 200 ×).

Estatísticas

A significância estatística foi estimada usando análise de variância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Bonferroni. A significância estatística foi estabelecida em P <0,05.

Resultados e discussão

Caracterização de CGA @ SeNPs

Neste estudo, usamos um método simples para sintetizar CGA @ SeNPs reduzindo uma mistura de CGA e Na ₂ SeO ₃ com NaBH ₄ . Nanopartículas com tamanho variando de 30 a 150 nm foram mais favoráveis para a captação celular [21]. TEM mostrou que CGA @ SeNPs têm uma estrutura esférica com um diâmetro de cerca de 100 nm (Fig. 1a), sugerindo que o tamanho dos CGA @ SeNPs era adequado para a aplicação biológica. A análise da composição elementar mostrou que Se, C e O podem ser facilmente encontrados no gráfico de espectroscopia de raios-X de dispersão de energia (EDX) de CGA @ SeNPs (Fig. 1b). O sinal dos átomos de Se foi de 30,00%, juntamente com o sinal forte do átomo C (52,60%) e o sinal do átomo O (1,50%) do CGA, indicando que preparamos com sucesso os CGA @ SeNPs.

Caracterização de CGA @ SeNPs. a Imagens TEM de CGA @ SeNPs. b Análise EDX de CGA @ SeNPs. c Espectro de absorção de UV-vis de CGA @ SeNPs. d O espectro de emissão de CGA @ SeNPs

O espectro de absorção UV-vis de CGA mostra um pico de absorção característico em 334 nm (Fig. 1c). No entanto, foi observada uma ligeira mudança no espectro de absorção de UV-vis de CGA @ SeNPs e o pico de absorção foi alterado para 337 nm. Os comprimentos de onda de emissão de CGA e CGA @ SeNPs foram detectados por espectrofotômetro de fluorescência. O comprimento de onda de emissão de CGA foi de 442,9 nm, que foi deslocado para 437,5 nm em CGA @ SeNPs (Fig. 1d). Esses resultados confirmaram a presença de CGA na superfície de SeNPs. O espectro FT-IR de CGA @ SeNPs dá evidências de que o CGA formou uma parte do nanocompósito. A frequência de alongamento O – H está localizada em 3353,99 cm ⁻¹ no espectro FT-IR de CGA (arquivo adicional 1:Figura S1); no entanto, este pico característico em CGA @ SeNPs foi alterado para 3419,00 cm ⁻¹ . A mudança confirmou que o CGA foi conjugado à superfície dos SeNPs por meio do grupo −OH.

A estabilidade dos CGA @ SeNPs sob condições fisiológicas é importante para avaliar suas aplicações futuras. Assim, a distribuição de tamanho de CGA @ SeNPs em PBS (pH 7,4) foi monitorada à temperatura ambiente durante 7 dias. Conforme mostrado no arquivo adicional 1:Figura S2, o tamanho de CGA @ SeNPs permaneceu estável com um tamanho médio de cerca de 100 nm, e CGA @ SeNPs reteve boa dispersibilidade em água em PBS em 7 dias. A estabilidade favorável do CGA @ SeNPs apóia sua aplicação potencial na área médica.

Inibição da geração de ROS

O Aβ depositado pode ativar a microglia e estimular a microglia a produzir neurotoxinas, como as ROS, que podem causar danos neuronais graves no cérebro [22]. Além disso, ROS, como peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ) também podem ser gerados por agregados Aβ [23]. Assim, investigamos as atividades antioxidantes de CGA @ SeNPs e o efeito de CGA @ SeNPs em H ₂ induzido por agregados Aβ O ₂ formação. Conforme mostrado no arquivo adicional 1:Figura S3, os CGA @ SeNPs têm fortes atividades de eliminação contra radicais de uma maneira dependente da concentração. Quando a concentração atingiu 60 μg / mL, o radical hidroxila, ABTS ⁺ e as atividades de eliminação do ânion superóxido atingiram 70,3%, 95,2% e 95,1%, respectivamente. Obviamente, o poder redutor de CGA @ SeNPs aumentou com o aumento das concentrações. Entre todas as amostras, CGA @ SeNPs exibiu forte poder de redução e capacidade de eliminação no radical hidroxila, ABTS ⁺ e ânion superóxido do que Vc e CGA. Esses resultados sugeriram que CGA @ SeNPs mostraram maior atividade antioxidante, o que pode ajudar na eliminação de oxigênio ativo na DA. O ponto a ser observado é que a modificação de CGA em SeNPs exerce um efeito sinérgico na atividade antioxidante.

O efeito de CGA @ SeNPs no H mediado por Aβ ₂ O ₂ geração foi investigada por um ensaio DCFH-DA [24], que pode indicar a geração de H ₂ O ₂ do Aβ na presença ou ausência de CGA @ SeNPs. Como mostrado na Fig. 2, CGA @ SeNPs e CGA diminuíram H ₂ O ₂ de uma forma dependente da dose. Mais importante, as amostras Aβ contendo CGA @ SeNPs mostram menos H ₂ O ₂ do que aqueles contendo CGA, revelando que a alta atividade antioxidante de CGA @ SeNPs mostrou mais efeito do que CGA na redução do H ₂ induzido por Aβ O ₂ geração.

H ₂ O ₂ geração de reações de Aβ40 na presença ou ausência de nanopartículas. Aβ =35 μM, nanopartículas / CGA =20, 40 e 60 μg / mL

Inibição da agregação de Aβ por CGA @ SeNPs

Embora a atividade antioxidante do CGA seja uma propriedade bem conhecida, a atividade de agregação anti-amilóide do CGA ainda é desconhecida. Para verificar a viabilidade de CGA @ SeNPs para aplicações terapêuticas de AD, o efeito de inibição de CGA @ SeNPs na agregação de Aβ foi investigado pela primeira vez por ensaio fluorométrico baseado em ThT, que é um método bem estabelecido para monitorar a formação de folha β em regime contínuo tempo [25]. Como mostrado na Fig. 3a, Aβ40 agregou-se espontaneamente e a fluorescência das fibrilas Aβ aumentou gradualmente até atingir um patamar por 3 dias de incubação. Observamos que CGA @ SeNPs foram capazes de agregar proteínas amilóides lentamente com o aumento da concentração. A intensidade de fluorescência de fibras Aβ40 cerca de duas vezes mais do que Aβ40 incubado com 60 μg / mL CGA @ SeNPs foi alcançada. No entanto, pouca ou nenhuma mudança na intensidade de fluorescência de ThT foi observada em CGA, sugerindo que CGA inibiu apenas ligeiramente a agregação de Aβ40.

Efeito de inibição de CGA @ SeNPs na fibrilação Aβ40. a Fluorescência ThT da formação de fibrilas Aβ40 na presença ou ausência de nanopartículas / CGA de 0 a 5 dias. Aβ40 =35 μM, nanopartículas / CGA =20, 40 e 60 μg / mL. b Morfologia de Aβ40 incubado com ou sem nanopartículas ou CGA por 3 dias. Aβ40 =35 μM, nanopartículas / CGA =60 μg / mL

As alterações morfológicas de Aβ40 incubado com ou sem CGA ou CGA @ SeNPs são mostradas na Fig. 3b. O Aβ40 incubado em 3 dias formou fibrilas abundantes, enquanto na presença de CGA @ SeNPs (60 μg / mL), nenhuma fibrila se formou. Como esperado, o CGA não inibiu significativamente a fibrilogênese de Aβ, enquanto grandes quantidades de agregados foram observadas na solução de Aβ40 tratado com CGA, o que foi consistente com o ensaio fluorométrico ThT. Estes resultados indicaram que após a modificação de CGA em SeNPs, ele poderia obviamente diminuir a formação de folhas β.

Atividade de ligação de CGA @ SeNPs a Aβ40

Para obter uma melhor compreensão da atividade inibitória de CGA @ SeNPs na agregação de Aβ, investigamos a afinidade de ligação de CGA @ SeNPs para Aβ40. Primeiro, para avaliar a ligação de nanopartículas em fibras Aβ40 no nível ultraestrutural, fibras Aβ40 foram incubadas com CGA @ SeNPs. Observamos que as fibrilas se ligam especificamente na superfície de SeNPs sem a presença de quaisquer nanopartículas suspensas não associadas livres (Fig. 4a).

Afinidade de CGA @ SeNPs para Aβ40. a A capacidade de ligação de CGA @ SeNPs em fibras Aβ40. As fibras de Aβ40 realizadas foram incubadas com CGA @ SeNPs e examinadas em TEM. Aβ40 =35 μM, CGA @ SeNPs =60 μg / mL. b Afinidade e especificação de CGA @ SeNPs para o monômero Aβ40. Os espectros RLS do monômero Aβ40 na presença de diferentes concentrações de CGA @ SeNPs. Aβ40 =600 nM, concentração de nanopartículas, 1–9:0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35 e 0,4 μg / mL. c Os espectros RLS de CGA @ SeNPs, concentração de nanopartículas, 1–9:0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4 e 0,45 μg / mL

O espalhamento de luz por ressonância (RLS) é uma técnica ótica poderosa baseada no espalhamento elástico de luz e tem sido amplamente aplicada para estudar o tamanho, a forma e a distribuição de nanopartículas em solução [26]. Assim, em seguida usamos RLS para analisar a interação entre o monômero Aβ40 e CGA @ SeNPs. Como mostrado na Fig. 4b, c, a intensidade de RLS de NPs é muito menor do que a de NPs incubados com monômero Aβ40 600 nM na mesma concentração. Uma vez que os CGA @ SeNPs foram expostos às moléculas Aβ, acredita-se que o Aβ se ligue na superfície das SeNPs por meio de doadores N contendo cadeias laterais de aminoácidos para formar uma ligação Se – N [27]. A formação de conjugados de moléculas Aβ em CGA @ SeNPs resulta no aumento do tamanho das dispersões, o que aumenta a intensidade de RLS do sistema (Fig. 4b). Combinado com o resultado do ensaio ThT e TEM, especula-se que as interações entre a grande superfície CGA @ SeNP e o monômero Aβ40 podem resultar em condições desfavoráveis para nucleação e crescimento de fibrila através do bloqueio do contato direto entre os monômeros. Assim, CGA @ SeNPs exercem mais efeito do que CGA na inibição da agregação de Aβ40.

Inibição da neurotoxicidade de Aβ40

A citotoxicidade de Aβ40 na presença ou ausência de CGA @ SeNPs em células PC12 foi investigada por ensaio de MTT. A Figura 5a mostra que as fibras Aβ40 eram tóxicas para as células PC12, o que reduziu a viabilidade celular para 53%. Na presença de CGA @ SeNPs, a sobrevivência das células aumentou para cerca de 95%. No entanto, o pré-tratamento das células com CGA aumentou apenas ligeiramente a sobrevivência das células para 66%. Além disso, os CGA @ SeNPs não eram tóxicos para as células PC12 (Arquivo adicional 1:Figura S4), sugerindo que os CGA @ SeNPs podiam inibir a neurotoxicidade de Aβ40.

A neurotoxicidade de Aβ40 incubado com ou sem CGA @ SeNPs / CGA. a A viabilidade celular de células PC12 para Aβ40 na presença de CGA @ SeNPs ou CGA testada por ensaio de MTT. b A liberação de LDH no meio de cultura. Aβ40 =35 μM, CGA @ SeNPs / CGA =60 μg / mL

Foi relatado que o Aβ imobilizou-se preferencialmente na superfície celular e causou danos à membrana celular [28]. Portanto, para determinar a integridade da membrana celular após a exposição a Aβ40 na presença ou ausência de NPs / CGA, medimos os níveis de LDH extracelular em meio de cultura de células. Neste ensaio, o alto nível de LDH reflete o dano da membrana celular. Conforme mostrado na Fig. 5b, em comparação com o controle, após a exposição a Aβ40, a liberação de LDH aumentou para 142%. De acordo com o resultado do MTT, na presença de CGA @ SeNPs, a liberação de LDH foi reduzida a um nível normal. Curiosamente, observamos que o CGA não reduziu a concentração de LDH, sugerindo que o CGA não pode prevenir as células PC12 de danos à membrana celular induzidos por agregados Aβ.

Prevenção da geração de ROS induzida por Aβ40 em células PC12

Os agregados Aβ são capazes de produzir ROS que podem causar estresse oxidativo na DA [29]. Devido às propriedades anti-oxidação e anti-agregação de CGA @ SeNPs, formulamos a hipótese de que seria capaz de reduzir a geração de ROS induzida por Aβ40 na célula PC12. Assim, o efeito de NPs na geração de ROS induzida por agregado Aβ40 foi medido por DCFH-DA. DCF é um marcador fluorescente derivado da reação de DCFH-DA não fluorescente com ROS, que pode indicar a geração de ROS induzida por agregados Aβ40. Conforme mostrado no arquivo adicional 1:Figura S5, o tratamento com agregados Aβ40 causou um aumento de mais de 1,5 vezes no conteúdo de ROS em relação às células não tratadas. O tratamento com CGA @ SeNP diminuiu a intensidade de fluorescência de DCF em células PC12, indicando que os CGA @ SeNPs diminuíram as ROS induzidas por fibrila Aβ para um nível normal. Curiosamente, o CGA também reduziu a geração de ROS nas células PC12, mas não tão obviamente quanto o CGA @ SeNPs.

Prevenção da apoptose celular induzida por Aβ40 em células PC12

Foi relatado que a morte de células neuronais causada por fibrila Aβ é um evento crítico na patologia da DA [30]. Para estudar mais a citotoxicidade das fibrilas Aβ40, realizamos a co-coloração TUNEL-DAPI para determinar o efeito de NPs ou CGA na apoptose celular induzida por Aβ40. A fragmentação do DNA é uma marca registrada da apoptose celular, que pode ser detectada nos estágios iniciais da apoptose usando TUNEL [31]. Como mostrado na Fig. 6, os núcleos apoptóticos foram corados em verde fluorescente brilhante por TUNEL. Aβ40 aumentou dramaticamente o número de núcleos corados por TUNEL, enquanto o tratamento com CGA @ SeNP causou uma diminuição de núcleos TUNEL positivos, demonstrando que CGA @ SeNPs poderiam proteger os neurônios da apoptose de células PC12 induzida por Aβ40. Caso contrário, altos níveis de ROS nas células também participam da apoptose [32]. Assim, esses resultados indicam que a apoptose estimulada pelo Aβ40 pode ser atribuída à geração de ROS. É importante notar que o CGA também pode reduzir a apoptose celular induzida por Aβ40. A partir do ensaio de MTT e LDH, o CGA não aumentou a sobrevivência da célula e diminuiu o dano à membrana celular induzido pelo agregado Aβ. Resultados combinados do ensaio TEM e ThT, descobrimos que o CGA tem propriedade antioxidante que pode limpar o oxigênio ativo no processo de agregação de Aβ, mas não pode inibir totalmente a agregação de Aβ. Portanto, o CGA pode diminuir a geração de ROS na solução de incubação e nas células PC12, protegendo a apoptose celular induzida por ROS, mas não pode diminuir o dano à membrana celular induzida pelo agregado Aβ. O dano à membrana celular resultará no vazamento de conteúdo intracelular para o tecido circundante, o que pode levar a dano tecidual e inflamação [33]. Assim, a combinação de agregação de Aβ inibida e formação de espécies reativas de oxigênio pode ser considerada como um novo método terapêutico.

CGA @ SeNPs previnem a apoptose celular induzida por Aβ40 em células PC12. A apoptose celular foi detectada pelo ensaio de co-coloração TUNEL-DAPI. O núcleo da célula normal foi corado em azul e o fragmento de DNA foi corado em verde. Aβ40 =35 μM, CGA @ SeNPs / CGA =60 μg / mL

Conclusões

Em resumo, o CGA tem uma propriedade farmacológica antioxidante, mas não tem efeito na inibição da fibrilação Aβ. A modificação da superfície de CGA em SeNPs fornece uma nova propriedade anti-agregação. O Aβ40 pode ligar-se à superfície dos CGA @ SeNPs, o que resulta em condições desfavoráveis para a nucleação e o crescimento da fibrila através do bloqueio do contato direto entre os monômeros. Nesse caso, CGA @ SeNPs inibiu a agregação de Aβ40, eliminou as ROS e protegeu as células PC12 da ruptura da membrana celular e da apoptose mediada por ROS induzida por agregados de Aβ40. Porém, no grupo CGA, os agregados Aβ imobilizados na superfície celular causaram danos à membrana celular, que também resultaram em morte celular. No geral, CGA @ SeNPs são mais eficientes do que CGA na redução de Aβ40 tóxico em uso de longo prazo.