Células endoteliais de segmentação com nanopartículas de GaN / Fe multifuncionais

Resumo

Neste artigo, relatamos a interação de nanopartículas multifuncionais com células endoteliais vivas. As nanopartículas foram sintetizadas usando crescimento direto de nitreto de gálio em nanopartículas de óxido de zinco ligadas com óxido de ferro seguido pela decomposição do núcleo em fluxo de hidrogênio em alta temperatura. Usando microscopia eletrônica de transmissão, demonstramos que as células endoteliais aórticas porcinas absorvem nanopartículas baseadas em GaN suspensas no meio de crescimento. As nanopartículas são depositadas em vesículas e as células endoteliais não mostram nenhum sinal de dano celular. Nanopartículas inertes intracelulares são usadas como elementos de orientação para transporte controlado ou distribuição espacial projetada de células em campos magnéticos externos.

Histórico

Nos últimos anos, muitos esforços foram realizados para combater o câncer e doenças relacionadas usando a nanotecnologia. Uma das abordagens mais comuns é baseada em nanopartículas que podem ser exploradas como carreadores de drogas [1, 2]. Essa abordagem, no entanto, apresenta limitações relacionadas à necessidade de revestir as nanopartículas com ligantes de reconhecimento para adsorção e ligação covalente do fármaco, ou devido à necessidade de encapsular os fármacos dentro das nanopartículas. Uma abordagem terapêutica alternativa é utilizar nanopartículas para terapia celular direta, ou seja, para alvejar locais com a finalidade de tratar a doença biologicamente [3]. Por exemplo, células endoteliais carregadas com nanopartículas magnéticas podem ser guiadas para locais de lesão arterial por meio de um campo magnético aplicado. Além de aplicações terapêuticas, o guiador de células assistidas por nanopartículas também pode ser útil para separação de células in vitro e revestimento celular de construções tridimensionais [4]. Neste trabalho, demonstramos que as células endoteliais absorvem nanopartículas baseadas em GaN / Fe e que esse fenômeno pode ser usado para controlar a distribuição espacial das células in vitro.

Métodos

Síntese de nanopartículas

Camadas finas de GaN foram cultivadas em nanopartículas de ZnO com liga de Fe ₂ O ₃ por HVPE em duas etapas. Inicialmente, a camada de nucleação foi depositada a 600 ° C por 5 min. Posteriormente, a temperatura foi elevada para 800 ° C e mantida nesta temperatura por 10 min. O segundo regime de temperatura é necessário para a decomposição do núcleo de ZnO e melhoria da qualidade cristalina de GaN. O crescimento de GaN foi descrito em detalhes por nosso grupo anteriormente [5, 6]. Em resumo, usamos gálio metálico, amônia (NH ₃ ) gás, gás cloreto de hidrogênio (HCl) e hidrogênio (H ₂ ) como gases portadores. No processo de crescimento de GaN, o HCl, NH ₃ , e H ₂ as taxas de fluxo foram de 20, 600 e 3500 sccm, respectivamente.

Cultura de células

Células endoteliais aórticas porcinas foram isoladas de aortas por raspagem delicada da camada de células endoteliais com um bisturi. As células foram cultivadas em uma incubadora padrão a 37 ° C com 5% de CO ₂ em EGM ™ -2 (meio de fator de crescimento endotelial 2, Lonza). A divisão das células foi realizada com TrypLE ™ Select (1X) (Gibco®). Para todas as experiências, foram utilizadas células entre as passagens 3 e 8. As células foram marcadas com proteína fluorescente verde (GFP) por transdução lentiviral, conforme descrito em outro lugar [7].

Ensaio XTT

O ensaio XTT foi iniciado 24 horas após a mudança do meio, quando um novo meio suplementado com nanopartículas foi adicionado. O meio de cultura foi então substituído por meio EGM2 fresco com reagente XTT em uma proporção de 2:1. O reagente XTT consiste em 0,1 ml de reagente de acoplamento de elétrons em 5 ml de XTT. Após 4 h de incubação a 37 ° C com 5% de CO ₂ , a absorbância foi medida em um leitor de placas multimodo Paradigm.

Contagem de células

Após 2 dias de incubação de células com diferentes concentrações de nanopartículas, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% por 10 min, lavadas com PBS e coradas com DAPI (1:7500 diluído em PBS) por 10 min. Um campo de visão aleatório foi fotografado a partir de seis poços independentes com uma câmera de alta resolução instalada em um microscópio de fluorescência (Zeiss). O software assistido por computador DotCount v1.2 [8] foi usado para quantificar o número relativo de células em cada poço e comparado ao controle.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

A microscopia eletrônica de transmissão foi realizada após incubação das células com nanopartículas por 1 dia. Depois que as células atingiram 50% de confluência, o meio de cultura foi substituído por meio suplementado com nanopartículas de GaN / Fe 50 μg / ml e as células foram incubadas por outras 24 h. As células foram então lavadas com PBS, fixadas em 2% de glutaraldeído e 2% de formaldeído à temperatura ambiente durante 2 h e depois incubadas durante a noite a 4 ° C. As amostras foram lavadas em cacodilato de sódio 0,1 M e pós-fixadas em 1% OsO ₄ em cacodilato de sódio 0,1 M durante 1 h. Após a fixação, as amostras foram desidratadas em uma série graduada de acetona e incluídas em EPON. A polimerização foi realizada durante 2 dias a 60 ° C. Seções finas de ~ 50 nm de espessura foram coletadas em grades de cobre revestidas com formvar e coradas com acetato de uranila a 4% e citrato de chumbo. As seções celulares foram investigadas em detalhes usando um microscópio eletrônico de transmissão FEI Tecnai 20 a uma tensão de aceleração de 200 kV.

Resultados e discussão

Nanopartículas magnéticas multifuncionais foram fabricadas pelo crescimento de uma camada de GaN em nanopartículas sacrificais de ZnO com liga de Fe ₂ O ₃ . Após o crescimento da camada de GaN usando epitaxia de fase de vapor de hidreto (HVPE), o núcleo de ZnO é decomposto. As nanopartículas quimicamente estáveis resultantes consistem principalmente em um invólucro de GaN com propriedades magnéticas atribuíveis à difusão de átomos de ferro no GaN depositado, bem como à presença de átomos de Fe no filme fino de ZnO ligado com Fe ₂ O ₃ na superfície interna do escudo GaN. Essas nanopartículas foram investigadas usando microscopia eletrônica. Após o processo de crescimento HVPE de GaN, as nanopartículas cristalinas simples com tamanhos transversais variando de 20 a 100 nm permanecem espacialmente separadas (Fig. 1). Os resultados da difração de raios-X e caracterização da espectroscopia Raman (Fig. 1c, d) das nanopartículas antes e depois do crescimento de GaN demonstram a decomposição do núcleo de ZnO e a formação de nanopartículas de GaN. As análises químicas das nanopartículas realizadas usando análise de energia dispersiva de raios-X (EDX) confirmam o crescimento da camada de GaN e a decomposição do núcleo de ZnO (Fig. 1e, f). Observe que o material resultante exibe uma concentração relativamente alta (aproximadamente 50%) de Fe em comparação com as nanopartículas iniciais.

Análise de nanopartículas. a Imagem SEM de nanopartículas de GaN cultivadas em nanopartículas de ZnO ligadas a Fe ₂ O ₃ . b Imagem TEM das nanopartículas de GaN / Fe resultantes. c Padrão de XRD de ZnFe inicial ₂ O ₄ nanopartículas e GaN / ZnFe resultante ₂ O ₄ nanopartículas. d Espectros Raman das nanopartículas iniciais e resultantes após o crescimento de GaN. e Análise EDX de ZnO ligado com Fe ₂ O ₃ nanopartículas. f Análise EDX de nanopartículas resultantes após o crescimento da camada de GaN

Nanopartículas baseadas em GaN / Fe foram incubadas com células endoteliais de aorta suína primária. Como foi mostrado anteriormente, nanopartículas de GaN são toleradas pelas células endoteliais em concentrações inferiores a 100 μg / ml [5]. Durante o processo de incubação, as células endoteliais ocupam a maioria das nanopartículas no meio de cultura circundante, mantendo a migração e proliferação celular. Apesar disso, notamos alguma diminuição no número de células viáveis com o aumento da concentração de nanopartículas nos meios de cultura. Esta tendência é confirmada pelos resultados do ensaio XTT apresentado na Fig. 2.

Impacto das nanopartículas na viabilidade celular. Redução de XTT dependente da concentração medida após 1 dia de células sendo incubadas com diferentes concentrações de nanopartículas. O número de células contadas no final do ensaio XTT é expresso em relação às células não tratadas. Os valores são expressos como médias ± desvio padrão de dois experimentos independentes com seis repetições

Para entender como as nanopartículas de GaN / Fe interagem com as células e para identificar sua localização dentro das células, realizamos uma análise morfológica completa usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Após a incubação de células endoteliais aórticas porcinas com nanopartículas de 50 μg / ml por 1 dia, as nanopartículas provaram estar localizadas em vesículas dentro das células (Fig. 3a). Nenhuma nanopartícula foi encontrada no citoplasma ou no núcleo da célula. O processo de captação de nanopartículas é apresentado na Fig. 3b – d. A maioria das nanopartículas é captada pelas células por meio de uma das vias de captação clássicas, ou seja, por micropinocitose, endocitose mediada por clatrina ou endocitose mediada por caveolina [9]. O processo de internalização depende do tipo de célula e ambiente celular local, bem como das propriedades físico-químicas da própria partícula (por exemplo, tamanho, forma, carga superficial). No caso de células endoteliais, a endocitose mediada por caveolina foi relatada como tendo uma maior influência na captação de nanopartículas do que outros mecanismos devido à abundância de caveolina neste tipo de célula [10, 11].

Imagens TEM tiradas de uma única célula endotelial incubada com nanopartículas de GaN / Fe. a Distribuição das nanopartículas nas vesículas celulares. b - d O processo de absorção de nanopartículas em vesículas. Setas vermelhas indicam nanopartículas que parecem mais escuras em TEM devido à alta densidade atômica em comparação com meios biológicos

Devido à já mencionada incorporação de uma elevada quantidade de Fe, as nanopartículas resultantes exibem ferromagnetismo, juntamente com a piezoeletricidade inerente ao material semicondutor GaN [12, 13]. Essas duas propriedades fundamentais podem ser utilizadas para ativação remota de alguns processos nas nanopartículas e / ou sua orientação controlada e distribuição espacial em meios relevantes. As propriedades piezoelétricas podem ser usadas para induzir polarização elétrica em nanopartículas de GaN por, por exemplo, um campo de ultrassom aplicado. Desta forma, pode-se transmitir sinais elétricos às células para ativar ou inibir processos celulares específicos. Quanto às propriedades magnéticas conferidas pelo teor de Fe, elas possibilitam a visualização dinâmica e o controle da posição espacial das células. Para demonstrar experimentalmente a última possibilidade, as células endoteliais foram incubadas em meio EGM ™ -2 suplementado com 50 μg / ml de nanopartículas de GaN / Fe por 3 dias (até 70-80% da confluência celular). Posteriormente, as células foram destacadas da superfície e ressuspensas em EGM ™ -2. Observe que o desprendimento das células com TrypLE ™ Select e a centrifugação não afetaram a viabilidade celular nem resultaram na liberação de nanopartículas das células (dados não mostrados). Imediatamente após a semeadura, as células foram incubadas em uma incubadora padrão a 37 ° C sob 5% de CO ₂ , onde a placa de cultura foi colocada em ímãs permanentes. A Figura 4 mostra a distribuição de células endoteliais carregadas de nanopartículas na presença e ausência de um campo magnético. A Figura 4a representa células carregadas de nanopartículas incubadas na ausência de um campo magnético, enquanto na Fig. 4b, células endoteliais sem nanopartículas são incubadas em um campo magnético. Essas fotos mostram uma distribuição aleatória de células em ambos os casos. A incubação de células carregadas de nanopartículas em um gradiente de campo magnético leva a uma distribuição pré-projetada de células em certas áreas, de acordo com o mapa do campo magnético. A Figura 4c representa as células na placa de cultura após 1 dia de incubação no campo magnético gerado por sete ímãs circulares de neodímio de terras raras com um diâmetro de 5 mm e uma espessura de 1 mm. A Figura 4d ilustra a distribuição das células após a incubação no campo magnético gerado por um único ímã em forma de anel com um diâmetro de 7 mm e uma espessura de 1 mm. Em ambos os casos, os ímãs foram colocados abaixo da placa de cultura.

Guia de células endoteliais carregadas de nanopartículas usando um campo magnético. O grupo de controle mostra a distribuição espacial de a células endoteliais direcionadas com nanopartículas e incubadas na ausência de campo magnético e b células endoteliais livres de nanopartículas incubadas em campo magnético. c , d A distribuição de células endoteliais direcionadas com nanopartículas após 1 dia de incubação em um campo magnético

Conclusões

Demonstramos pela primeira vez que as nanopartículas à base de GaN / Fe exibindo propriedades magnéticas são absorvidas pelas células endoteliais e armazenadas nas vesículas. As células endoteliais carregadas de nanopartículas de GaN / Fe podem ser guiadas de forma controlada usando campos magnéticos aplicados. Esses resultados abrem novas possibilidades para a engenharia de tecidos tridimensionais in vitro ou para direcionar células in vivo para locais de lesão de tecido. Junto com isso, a presença nas células de nanopartículas de GaN com propriedades piezoelétricas inerentes abre o caminho para a estimulação elétrica remota de processos biológicos celulares. Esta abordagem promissora está sob investigação em nossos laboratórios.

Abreviações

EDX:: Análise de energia dispersiva de raios-X
EGM ™ -2:: Meio de fator de crescimento endotelial
Fe:: Ferro
Fe ₂ O ₃ :: Óxido de ferro (III)
GaN:: Nitreto de gálio
GFP:: Proteína fluorescente verde
H ₂ :: Hidrogênio
HCl:: Cloreto de hidrogênio
NH ₃ :: Amônia
OsO ₄ :: Tetróxido de ósmio
PBS:: Salina tamponada com fosfato
SEM:: Microscopia eletrônica de varredura
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
XRD:: Difração de raios X
ZnO:: Óxido de zinco

Nanofios de silício amorfo cultivados em filme de óxido de silício por recozimento Nanohelices de ouro depositadas obliquamente em superfícies nanossedidas preparadas sem litografia

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias