Efeitos tóxicos induzidos por nanopartículas de zircônia em células 3T3-E1 semelhantes a osteoblastos

Resumo

Zircônia (ZrO ₂ ) é um dos óxidos de metal amplamente usados para bioaplicações potenciais, como biossensores, terapia de câncer, implantes e odontologia, devido à sua alta resistência mecânica e menor toxicidade. Por causa de suas aplicações generalizadas, a exposição potencial a essas nanopartículas (NPs) aumentou, o que atraiu grande atenção. Assim, é urgente investigar o perfil toxicológico de ZrO ₂ NPs. Dióxido de titânio (TiO ₂ ) é outro nanomateriais amplamente usados que são conhecidos por serem fracamente tóxicos. Neste estudo, TiO ₂ NPs foram servidos como controle para avaliar a biocompatibilidade de ZrO ₂ NPs. Detectamos a citotoxicidade do TiO ₂ e ZrO ₂ NPs em células 3T3-E1 semelhantes a osteoblastos e descobriram que espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenharam um papel crucial no TiO ₂ e ZrO ₂ Citotoxicidade induzida por NP de maneira dependente da concentração. Também mostramos TiO ₂ e ZrO ₂ NPs podem induzir apoptose e alterações morfológicas após cultivo com células 3T3-E1 em altas concentrações. Além disso, TiO ₂ e ZrO ₂ NPs em altas concentrações podem inibir a diferenciação osteogênica celular, em comparação com aqueles em baixas concentrações. Concluindo, TiO ₂ e ZrO ₂ Os NPs podem induzir respostas citotóxicas in vitro de uma maneira dependente da concentração, o que também pode afetar a osteogênese; ZrO ₂ NPs mostraram efeitos tóxicos mais potentes do que TiO ₂ NPs.

Introdução

Durante as últimas décadas, a aplicação de nanopartículas projetadas (NPs) se expandiu em vários campos, como eletrônicos, aplicações biomédicas e produtos farmacêuticos. Zircônia (ZrO ₂ ) NPs são um dos principais nanomateriais usados para sintetizar refratários, areias de fundição e cerâmicas. Devido à resistência mecânica preferencial, este material também é utilizado na área biomédica, incluindo biossensores, terapia do câncer, implantes, endopróteses articulares e odontologia [1, 2]. No entanto, a ampla aplicação de partículas tem gerado preocupação sobre seus riscos potenciais à saúde e ao meio ambiente, dos quais garantir a segurança ocupacional e do consumidor é uma preocupação essencial. Até agora, estudos toxicológicos sobre ZrO ₂ NPs são limitados e os resultados foram controversos.

Alguns estudos relataram que ZrO ₂ NPs mostraram melhor biocompatibilidade quando comparados com outros nanomateriais, incluindo óxido férrico, dióxido de titânio (TiO ₂ ) e óxido de zinco (ZnO) [3,4,5,6]. De acordo com esses resultados, outros relataram ZrO ₂ NP poderia induzir efeitos citotóxicos leves [3, 7] ou nenhum efeito [8,9,10], e apenas alguns estudos indicaram um potencial citotóxico leve. No entanto, Stoccoro et al. [11] desenvolveu os efeitos tóxicos do ZrO ₂ NPs e TiO ₂ NPs revestidos ou não, eles descobriram que todos os tipos de NPs mostraram efeitos tóxicos em diferentes graus. Além disso, mudanças na morfologia celular e rachaduras na superfície celular foram observadas em outro estudo após ZrO ₂ Tratamento de NP em concentrações de até 1 mg / mL nas hemácias [12]. Portanto, neste estudo, avaliamos os efeitos citotóxicos do ZrO ₂ NPs, fornecendo uma visão útil para sua futura aplicação in vivo. Enquanto isso, tratamos as células com TiO ₂ NPs como grupo controle, cujo perfil toxicológico está bem desenvolvido [13].

Estudos anteriores mostraram que os NPs têm sido amplamente usados como materiais de engenharia de tecidos e têm a capacidade de melhorar a diferenciação osteogênica dos osteoblastos [14,15,16,17]. Um relatório indicou que os NPs de sílica (Si) podem reverter a perda óssea associada à idade em camundongos, provavelmente devido à formação óssea induzida por Si NP [16]. Liu et al. [14] descobriram que liga de aço inoxidável revestida com prata (Ag) NPs / poli (ácido DL-láctico-co-glicólico) tem forte capacidade antibacteriana e pode promover a proliferação e maturação osteoblástica das células MC3T3-E1 in vitro. Além disso, foi relatado que os nanotubos de carbono induzem a calcificação óssea, provavelmente resultado de suas estruturas nanométricas que são semelhantes ao tamanho das organelas intracelulares [18].

ZrO ₂ NPs têm sido aplicados como o principal componente dos implantes biocerâmicos, devido à sua biocompatibilidade e resistência à biocorrosão [19]. Embora a maioria dos estudos tenha se concentrado nas propriedades vantajosas do ZrO ₂ NPs, os efeitos biológicos adversos são impossíveis de serem negligenciados. Portanto, neste estudo, usamos TiO ₂ , como grupo controle, que é um nanomaterial tradicional que apresentou propriedades físico-químicas semelhantes. Nosso objetivo foi investigar os efeitos do TiO ₂ e ZrO ₂ NPs na viabilidade celular, estresse oxidativo, morfologia celular e respostas osteogênicas de osteoblastos MC3T3-E1 após co-cultura e, portanto, para revelar a osteoindutividade de TiO ₂ e ZrO ₂ Tratamento NP.

Materiais e métodos

Preparação e caracterização de materiais

TiO ₂ NPs (número CAS 637262) e ZrO ₂ NPs (número CAS 544760) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e caracterizados por microscópio eletrônico de transmissão (TEM, MFP-3D-S, Asylum Research, Santa Bárbara, CA, EUA) , Potencial Zeta e medidas de análise de tamanho de partícula de espalhamento dinâmico de luz (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Reino Unido). Os NPs foram dispersos em álcool para detecção de TEM, o que poderia mostrar a morfologia e o tamanho das partículas de NPs mais claramente. Além disso, o tamanho agregado das partículas foi detectado por meio de DLS, onde o meio de cultura completo foi usado para trazer correspondência com os caracteres das partículas aplicadas na cultura de células. Antes do tratamento das células, a solução estoque foi dispersa pelo Sistema de Disrupção de Células Ultrassônicas (Ningbo Xinzhi Biotechnology, China) por 30 min, acompanhado de resfriamento com gelo e diluída em diferentes concentrações com meio de cultura completo antes dos experimentos celulares.

Cultura de células 3T3-E1

A linha celular 3T3-E1 (o Banco de Células da Infraestrutura de Xangai para Pesquisa e Desenvolvimento Público da Academia Chinesa de Ciências Médicas, Xangai, China) foi cultivada em meio alfa mínimo essencial (α-MEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA , EUA) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS, Thermo Fisher Scientific, EUA) e 1% de antibiótico / antimicótico (Thermo Fisher Scientific, EUA). As células foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO ₂ em atmosfera com 95% de umidade e o meio de cultura foi trocado a cada dois dias.

Ensaio de proliferação celular

A viabilidade celular foi detectada usando o ensaio CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto city, Japan). As células foram semeadas em placas de 96 poços a 5000 células por poço. TiO ₂ NPs e ZrO ₂ NPs foram então adicionados às placas de 96 poços em concentrações em série de 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 e 150 μg / mL, seguido por incubação por 24 e 48 h a 37 ° C com 5% de CO ₂ , acompanhado de N -acetil-L-cisteína (NAC) ou não, que foram usados para inibir a produção de ROS. O grupo de controle não foi tratado. Em seguida, o teste de CCK-8 foi conduzido adicionando 110 μL de reagentes de detecção a cada poço, e as placas de 96 poços foram incubadas por mais 2 h a 37 ° C. Para evitar que os NPs interfiram neste ensaio analítico, os reagentes a serem testados nas placas de 96 poços foram transferidos para uma nova placa de 96 poços após 2 h de tempo de reação; os NPs e células depositados foram deixados na placa primária. A densidade óptica (DO) de cada poço foi medida em um único comprimento de onda de 450 nm com o leitor de microplaca (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Cada tratamento foi feito em seis repetições.

Análise de apoptose de anexina V por citometria de fluxo

As células foram cultivadas em uma placa de 12 poços a uma densidade de 30.000 células / poço para confluência. Após TiO ₂ NP e ZrO ₂ Tratamento NP por 48 h, as células foram lavadas com PBS e coletadas usando tampão de tripsina livre de EDTA. As células foram ressuspensas com tampão PBS a uma concentração de 25.000 células / mL e centrifugadas a 1000 × g . Em seguida, as células foram coradas com FITC Anexina V e PI (Invitrogen ™, EUA) em temperatura ambiente sem exposição à luz. Finalmente, as células foram misturadas com 400 μL de tampão de ligação e analisadas imediatamente por citometria de fluxo (BD FACSAria III, BD, Franklin Lakes, NJ, EUA).

Análise de geração de ROS

A formação de ROS intracelulares foi determinada usando o Reactive Oxygen Species Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China). Resumidamente, após a lavagem com PBS, as células foram semeadas em uma placa de 6 poços a 20.000 células / poço em 2 mL de meio de cultura e tratadas com TiO ₂ NPs e ZrO ₂ NPs na concentração de 0, 10, 50 e 100 μg / mL por 48 h, acompanhados com NAC ou não. Após o tratamento com TiO ₂ NPs e ZrO ₂ NPs, as células foram coletadas e incubadas com DCFH-DA 10 μM por 30 min a 37 ° C e 5% de CO ₂ . As intensidades fluorescentes foram analisadas em um BD FACSAria III (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA).

Microscopia Confocal

Devido a uma grande proporção de células ter se transformado em estado de apoptose, escolhemos 24 horas como o ponto de tempo para observar as mudanças na estrutura do citoesqueleto das células em nosso estudo. As células 3T3-E1 foram semeadas em lamelas de vidro e cultivadas na presença de TiO ₂ NPs e ZrO ₂ NPs por 24 h. As células foram lavadas imediatamente após o tratamento com tampão PBS por três vezes e fixadas com paraformaldeído 4%, permeabilizadas com Triton X-100 0,1% e bloqueadas com PBS contendo BSA 5%. Em seguida, as células foram incubadas para α-tubulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA, 1:4000) a 4 ° C durante a noite e carregadas com o anticorpo secundário ligado a FITC a 37 ° C por 1 h no dia seguinte após lavar com PBS por três vezes. Consequentemente, o citoesqueleto foi corado por rodamina-faloidina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA, 1:1000) por 1 h no escuro, e os núcleos foram corados com Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por 20 min. As lamelas foram examinadas usando um microscópio confocal FV10i (Olympus, Tóquio, Japão).

Detecção de indução de mineralização

As células 3T3-E1 foram semeadas em uma placa de 6 poços a uma densidade de 15.000 células / poço. As células foram tratadas com TiO ₂ NPs e ZrO ₂ NPs nas concentrações de 10 e 100 μg / mL, e o meio de cultura contendo os nanomateriais foi substituído a cada dois dias; as células foram lavadas suavemente com PBS para remover os nanomateriais residuais antes de cada troca de meio de cultura. Após cultura por 7, 14 e 21 dias na presença de TiO ₂ NPs e ZrO ₂ NPs, as células foram coradas por vermelho de alizarina S. Resumidamente, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% a 4 ° C por 30 min e coradas com solução de vermelho de alizarina S (40 mM, pH 4,1) à temperatura ambiente por mais 20 min. Após lavagem com água destilada três vezes, os nódulos mineralizados foram observados em microscópio de luz (Olympus, Japão).

Extração de RNA e RT-PCR

O RNA total foi extraído por meio do reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Em seguida, a concentração de RNA foi avaliada por meio de um espectrofotômetro ultravioleta. O RNA isolado foi transcrito reversamente para cDNA usando um kit de reagentes RT (TaKaRa Bio, Dalian, China). A PCR em tempo real foi realizada usando o reagente verde SYBR (TaKaRa Bio, Dalian, China). Genes relacionados à osteogênese foram detectados, incluindo fator de transcrição relacionado a runt 2 (RUNX2), colágeno 1α1 (Col1α1), fosfatase alcalina (ALP), osteopontina (OPN), osteocalcina (OC) e sialoproteína óssea (BSP). Os dados foram analisados usando o 2 ^−ΔΔ Método CT. Os primers usados foram listados na Tabela 1.

Análise estatística

Os resultados foram representados como médias ± SEM. Todos os dados foram analisados estatisticamente pelo teste ANOVA. O teste de homogeneidade de variância foi realizado, e os testes T3 de Bonferroni e Dunnett foram usados quando a variância igual foi assumida e quando não havia homogeneidade, respectivamente. p valor inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Caracterização do TiO ₂ e ZrO ₂ NPs

Primeiro caracterizamos o TiO ₂ NP e ZrO ₂ Pós NP via microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e espalhamento de luz dinâmico (DLS) (Fig. 1a, b, Tabela 2). As imagens TEM e SEM revelaram as formas e tamanhos das partículas. O TiO ₂ NPs eram pequenas esferas em forma de bastonete com um tamanho médio de 25,4 ± 2,8 nm. O ZrO ₂ NPs eram pequenas esferas em forma de bastonete com um tamanho médio de 31,9 ± 1,9 nm. Para medir o tamanho do TiO ₂ NPs e ZrO ₂ NPs em solução, DLS foi usado e as partículas de TiO ₂ NPs e ZrO ₂ NPs expandiram para 81,2 nm e 93,1 nm, respectivamente, o que indicou um efeito de aglomeração. Os potenciais zeta do TiO ₂ NPs e ZrO ₂ NPs foram 32,9 ± 5,4 mV e 42,4 ± 7,4 mV, respectivamente.

Caracterizações do TiO ₂ e ZrO ₂ NPs. TiO ₂ ( a ) e ZrO ₂ ( b ) A morfologia e o tamanho de NP foram detectados usando TEM. ( c ) A situação de co-cultura de células 3T3 e nanomateriais foi observada após TiO ₂ e ZrO ₂ Concentrações de tratamento NP de 10, 50 e 100 μg / mL. ( d ) Os resultados de TEM foram obtidos após TiO ₂ e ZrO ₂ Tratamento NP por 1 h

Em seguida, observamos a fotografia das células 3T3 após TiO ₂ NP e ZrO ₂ Exposição a NP em várias concentrações. Descobrimos que os NPs se distribuíam uniformemente nas células ou se espalhavam. Os NPs mostraram capacidade de agregação potente em altas concentrações devido a uma pequena fração de NPs com microescala observada, enquanto uma grande massa de NPs era pequena com nanoescala e provavelmente se transloca em células que eram difíceis de ver (Fig. 1c). Além disso, resultados de TEM de células após TiO ₂ e ZrO ₂ Tratamento de NP por 1 h foi obtido; nossos dados mostraram que os NPs podem ser translocados em vesículas celulares. Enquanto isso, alguns danos à organela também são observados, por exemplo, inchaço mitocondrial e vacúolo ocorreram.

TiO ₂ e ZrO ₂ Efeitos tóxicos induzidos por NP em células 3T3-E1

Avaliamos a viabilidade celular após TiO ₂ NP e ZrO ₂ Tratamento de NP em concentrações em série (10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 μg / mL). Para TiO ₂ NPs (Fig. 2a), após 24 h de incubação, descobrimos que TiO ₂ NPs não eram tóxicos em doses mais baixas (≤ 20 μg / mL), enquanto uma diminuição óbvia na viabilidade celular foi observada em concentrações mais altas (> 20 μg / mL) ( p <0,001). Uma diminuição mais dramática da viabilidade celular no grupo de tratamento de 20 μg / mL foi observada após 48 h de incubação; TiO ₂ NPs na concentração de 20 μg / mL induziu diminuição da viabilidade celular ( p <0,01). Além disso, doses mais altas de TiO ₂ NPs (> 20 μg / mL) mostraram diminuição significativa da viabilidade celular em 48 h ( p <0,001). No entanto, a viabilidade celular permaneceu estável quando tratada com 10 μg / mL de TiO ₂ NPs por 48 h. Além disso, para ZrO ₂ NPs (Fig. 2b), resultados semelhantes foram observados quando comparados com TiO ₂ NPs; efeitos tóxicos mais elevados foram observados na concentração de 150 μg / mL por 48 h, onde a viabilidade celular diminuiu para menos de 50%. Esses resultados indicaram que TiO ₂ e ZrO ₂ NPs eram biocompatíveis em doses mais baixas. No entanto, esses dois nanomateriais mostraram ligeira citotoxicidade em altas concentrações tóxicas.

TiO ₂ e ZrO ₂ A viabilidade celular induzida por NP diminui em células 3T3-E1. Células 3T3-E1 foram tratadas com TiO ₂ ( a ) e ZrO ₂ ( b ) NPs em concentrações de 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 e 150 μg / mL por 24 e 48 h e, em seguida, a viabilidade celular foi detectada por meio do ensaio CCK-8. Enquanto isso, as alterações de viabilidade celular foram detectadas após o tratamento com NAC, o que poderia eliminar ROS intracelulares. Os resultados representam as médias ± SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001, em comparação com o controle

Efeitos da inibição do NAC no TiO ₂ e ZrO ₂ Citotoxicidade induzida por NPs

Em seguida, detectamos os efeitos de inibição do NAC, que é um agente de eliminação de ROS. Os resultados mostraram que NAC potencialmente inibiu TiO ₂ (Fig. 2a), e ZrO ₂ NPs (Fig. 2b) induziram a viabilidade celular após 24 horas e 48 horas de tratamento. Após a inibição de NAC, a viabilidade celular foi mantida por 24 h em todas as concentrações de TiO ₂ e ZrO ₂ Tratamento NP exceto a concentração mais alta (150 μg / mL). Embora o efeito de inibição tenha diminuído ligeiramente nas células tratadas com altas concentrações de TiO ₂ (100 e 150 μg / mL) e ZrO ₂ NPs (80, 100 e 150 μg / mL) no ponto de tempo de 48 h, nenhuma alteração potente de viabilidade celular foi observada para concentrações abaixo de 80 μg / mL, onde a viabilidade celular foi significativamente maior do que aquelas sem NAC.

TiO ₂ e ZrO ₂ NPs-Induced ROS Generation in 3T3-E1 Cell

We further detected the ROS generation after TiO₂ and ZrO₂ NPs exposure in 3T3-E1 cells (Fig. 3). Our results showed that TiO₂ and ZrO₂ NPs induced ROS generation after 24 h, which was the most significant at the concentration of 100 μg/mL. There was no significant ROS generation for TiO₂ NPs at a concentration of 10 μg/mL, while ZrO₂ NPs induced potent ROS generation at the same concentration. Meanwhile, NAC could significantly inhibit TiO₂ and ZrO₂ NP-induced ROS generation in 3T3-E1 cell at all concentrations.

TiO ₂ and ZrO₂ NP-induced ROS generation in 3T3-E1 cells. 3T3-E1 cells were treated with TiO₂ and ZrO₂ NPs at various concentrations for 48 h, and NAC (10 mM) was incubated simultaneously, and then the ROS levels in the 3T3-E1 cells were detected. The results represent the means ± SEM. * p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0.001, compared with the control

TiO₂ and ZrO₂ NPs-Induced Apoptosis and Necrosis in 3T3-E1 Cell

Cell apoptosis and necrosis were detected after various concentrations of TiO₂ and ZrO₂ NP exposure at 48 h (Fig. 4). The red dots located in the third quadrant represented normal cells, while the red dots located in the first quadrant and fourth quadrant represented the early apoptotic cells and late apoptotic or necrotic cells, respectively. Interestingly, our results indicated that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce apoptosis in concentration- and time-dependent manners. Following the TiO₂ NP exposure for 48 h, no significant cell apoptosis was detected at concentrations of 10 μg/mL; however, at concentrations of 50 and 100 μg/mL, the percentage of late apoptotic or necrotic cells reached to high levels. Following the ZrO₂ NP exposure for 48 h, we did not find cell apoptosis at the concentration of 10 μg/mL too, but the percentage of late apoptotic or necrotic cells was 43.7% at 50 μg/mL group. Most interestingly, significant early apoptosis was observed (34.1%) at the concentration of 100 μg/mL after 48 h treatment. We found that the early apoptosis levels of TiO₂ NPs were significantly higher than ZrO₂ NPs; however, the late apoptotic or necrotic levels were in verse.

TiO ₂ and ZrO₂ NP-induced apoptosis in 3T3-E1 cells. a After the 3T3-E1 cells were treated with the TiO₂ and ZrO₂ NPs at various concentrations for 48 h, the levels of cell apoptosis were detected. b The apoptotic levels including early apoptosis and late apoptosis levels were calculated, and then the data carried out the statistics. The results represent the means ± SEM. * p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0.001, compared with the control

TiO₂ and ZrO₂ NP-Induced Morphological Changes in 3T3-E1 Cells

To study the morphological changes of 3T3-E1 cells after exposure to TiO₂ and ZrO₂ NPs, we performed fluorescence staining followed by confocal microscopy (Figs. 5 and 6). Compared with untreated control cells, there was no morphological change after 10 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NP treatment at 24 h, while cells turned to become round and smaller after 100 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NP treatment. Most interestingly, slight cell area decrease was observed after 50 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NP treatment, where TiO₂ showed more potent cell area decrease. Consistently, quantitative results confirmed a significant decrease in cell area after 100 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NP treatment (Fig. 5).

TiO ₂ and ZrO₂ NP-induced cell area changes in 3T3-E1 cells. After the 3T3-E1 cells were treated with the TiO₂ ( a ) and ZrO₂ ( b ) NPs at concentrations of 10 and 100 μg/mL for 24 h, the cells were loaded with tubulin (green), actin (red), and Hoechst 33342 (blue). The cell morphology was observed based on the alterations of the actin (red) and tubulin systems (green), and the cell area distribution changes were calculated

TiO ₂ and ZrO₂ NP-induced cytoskeleton changes in 3T3 cells. After the 3T3-E1 cells were treated with the TiO₂ ( a ) and ZrO₂ ( b ) NPs at concentrations of 10 and 100 μg/mL for 24 h, the cytoskeleton changes were assessed based on the alterations of the actin (red) and tubulin systems (green)

We further studied the cytoskeleton changes in both actin filaments and microtubule levels (Fig. 6). Similarly, no significant difference was shown between control group and 10 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NP treatment, and cells in both groups revealed explicit structures of actin filaments and microtubule system. In contrast, 100 μg/mL of ZrO₂ NP treatment induced a shrinkage of 3T3-E1 cells, along with a pyknosis-like nuclei and condensed unclear actin filaments and microtubule structures. Para TiO ₂ NPs, so many actin dots were observed, and the actin filaments located at the cell membrane were misty and rough. For ZrO₂ NPs, more potent cytoskeleton disruption was detected, and actin and microtubule structure were rough and defective.

TiO₂ and ZrO₂ NP-Induced Mineralization in 3T3 Cells

Next, we detected the mineralization status of 3T3 cells by alizarin red staining and observed the formation of mineralized nodules under light microscopy (Fig. 7). Cells were stained after osteogenic induction for 7, 14, and 21 days in the presence of various concentrations of TiO₂ and ZrO₂ NPs. We found that mineralized nodules became visible after 14 and 21 days induction. There was no significant difference on mineralization after 14 and 21 days induction between the control group and TiO₂ and ZrO₂ NP treatment at 10 μg/mL. However, decrease of mineralization probably was observed after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment at 100 μg/mL, due to the mineralized nodule that got smaller and blurry.

TiO ₂ and ZrO₂ NP-induced mineralization effects in 3T3 cells. After the 3T3-E1 cells were differentiated using mineralized solution for 7 d, 14 d and 21 d, accompanied with TiO₂ ( a ) and ZrO₂ NPs (b ) at various concentrations. The alizarin red staining was used to detect the mineralized nodule (black arrow)

TiO₂ and ZrO₂ NP-Induced Expression of Osteogenesis-Related Genes in 3T3 Cells

In order to investigate the mechanism of TiO₂ and ZrO₂ NP-induced osteogenesis in 3T3 cells, we detected the levels of osteogenesis-related genes in 3T3 cells after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment, including genes that preferentially upregulated during the early (Runx2 , Col1α1 , and Alp ) and late (Opn , Ocn , and Bsp ) phases of osteogenesis (Fig. 8). We found that 10 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NPs induced the highest expression level of Runx2 after 3 days of treatment, while at day 7, Runx decreased to the lowest level after ZrO₂ NP treatment at 100 μg/mL. Col1α1 increased after 10 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NP treatment both at days 3 and 7, while for cells treated with 100 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NPs, Col1α1 first significantly upregulated at day 3 but decreased dramatically after 7 days. We also detected significant decrease of Alp expression after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment at 100 μg/mL for 3 days.

TiO ₂ and ZrO₂ NP-induced osteogenesis-related genes changes in 3T3 cells. After the 3T3-E1 cells were differentiated using mineralized solution for 3, 7, 14, and 21 d, accompanied with TiO₂ and ZrO₂ NPs at various concentrations. The osteogenesis-related gene changes were detected using RT-PCR. The results represent the means ± SEM of three independent experiments. * p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0.001, compared with the control

For genes upregulated in the late phase of osteogenic induction, the expression levels of Opn , Ocn , and Bsp increased significantly after 10 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NP treatment for 14 days, and Opn continuously upregulated to a higher level at day 21. These results suggested that compared with Ocn and Bsp , Opn was a later stage marker of TiO₂ and ZrO₂ NP-induced osteogenesis. Interestingly, 100 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NPs failed to enhance the expression of Opn , Ocn , or Bsp at day 14; moreover, these genes showed significant downregulation at day 21.

Discussion

ZrO₂ NPs were important components in refractories, ceramics, and biomedical appliances, including implants, joint endoprostheses, and dental materials. Until now, TiO₂ NPs as one of the other NPs with similar physicochemical properties, many studies have focused on its toxicological data. They found that TiO₂ NPs could translocate into cells and showed potential cell damage due to different physicochemical characteristics [20, 21]. Meanwhile, the toxicological data for ZrO2 NPs was lacking. In our study, we regarded TiO₂ NPs as the control group and explored the toxicological effects of TiO₂ and ZrO₂ NPs on 3T3-E1 cells. Physicochemical properties of NPs, especially size and morphology, have been known to effectively impact biosafety. Some studies have shown that nanoscaled particles were significantly more toxic than microscaled particles [22, 23]. In most cases, particle morphology was also reported to affect the toxicity [24,25,26]. In our study, we showed that TiO₂ and ZrO₂ NPs were rod-shaped spheres. Compared with previous reports [5, 27, 28], our TiO₂ and ZrO₂ NPs had a relatively weaker agglomeration effect in water where the particles enlarged to 81.2 and 93.1 nm in size, while we also could observe some microscale materials in culture medium after NP exposure with concentration-dependent manner, which confirm the agglomeration effect in this study even after using ultrasonic dispersion technology. However, the agglomeration effect could not inhibit the NP translocation into the cytoplasm, due to potent NPs were detected in intracellular vesicles. Organelles, like mitochondria, probably was one main target.

We have detected the viability of 3T3-E1 cells at various concentrations of TiO₂ and ZrO₂ NP treatment. Our results showed that 10 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NPs is a biosafety concentration for 3T3-E1 cells. The cell viability decreased in time- and concentration-dependent manner, which implied that TiO₂ and ZrO₂ NPs were potentially cytotoxic after longer exposure of higher doses compared with other oxide metal nanoparticles, such as silicon dioxide and ZnO [4, 28, 29]. Moreover, ZrO₂ NPs showed more potent toxic effects than TiO₂ NPs in our study at high toxic concentrations.

Oxidative stress, a byproduct of outpaced ROS generation and decreased antioxidant factors, is known as one crucial factor in nanomaterial-induced cytotoxicity, and it is reported to trigger cell apoptosis through distinct mechanism [30, 31]. Furthermore, Kozelskaya et al. [12] observed that ZrO₂ NPs induced the increase of membrane microviscosity, cell morphology changes, and surface cracks on the red blood cells due to the oxidative stress. In agreement with these studies, we detected the ROS levels in 3T3-E1 cells after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment and found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce significant ROS generation in concentration-dependent manners, and ZrO₂ NPs induced more potent oxidative stress effects. Moreover, the elevated ROS levels could be eliminated by NAC which is a ROS scavenger. These results suggested the important role of ROS in TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cell cytotoxicity.

Apoptosis is a type of cell death which clears the senescent and abnormal cells, so as to sustain the cell biological functions [32]. Some studies have reported that apoptosis was one of the main toxic responses after treating with oxide metal nanomaterials, such as TiO₂ , ZnO, Si, and Ag [33,34,35,36]. In our study, we found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce apoptotic/necrotic body formation in 3T3-E1 cells in time/concentration-dependent manners, which was correlated with the decreased cell viability shown previously. Moreover, we found that when large parts of late apoptotic or necrotic cells were observed after ZrO₂ NP treatment, the cell status for TiO₂ NPs largely was early apoptosis. These phenomena applied that ZrO₂ NPs induced more rapid and potent apoptosis effects. Similarly, other studies also showed that ZrO₂ NPs induced significant apoptotic and necrotic processes in MSTO cells [4, 11].

The cytoskeleton metabolism is a dynamic biological process involving polymerization and depolymerization, which could sustain cell morphology and promote cell function. Some studies have shown that nanomaterials could affect the cell morphology and cytoskeleton system [37,38,39]. We found 3T3-E1 cells became smaller and rounded in the high-dose group of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL), along with decreased cell area due to cytoskeleton disruptions. These findings were also supported by previous reports that ZrO₂ NP treatment could induce cell morphology changes in MSTO cells at higher concentration [4]. Another study showed the disrupted blood cell morphology after ZrO₂ NP treatment [12].

Alizarin red staining is a key indicator of osteogenic responses. In our study, no impact on osteogenic induction has been shown by TiO₂ and ZrO₂ NP treatment (10 μg/mL), except that cells treated with a cytotoxic dose of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL) had a significant decrease of mineralized nodules due to the potential inhibition of osteoinductive properties. In addition, the expression level of osteogenesis-related genes was important biomarkers. Our results showed that lower concentration (10 μg/mL) of TiO₂ and ZrO₂ NPs promoted the expression of osteogenesis-related genes; however, TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations (100 μg/mL) could significantly inhibit gene expression for both early- and late phases of mineralization, indicating that TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations indeed inhibited osteoinductive properties. Other studies also obtained similar results; they claimed that TiO₂ NPs inhibited the osteogenesis of osteoblasts in a size-dependent manner while potentially promoted osteoclastogenic process [33]. Sengstock et al. [40] found that sub-toxic concentrations of Ag NPs and Ag ions could significantly impair the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. More ongoing or newly initiated researches are focused on developing nanoparticles with acceptable biosafety and osteogenic potential to promote osseointegration for in vivo application [18, 41].

Conclusion

In conclusion, our data indicated that ZrO₂ NPs were nanoparticles with good biocompatibility, just like TiO₂ NPs, while they could induce toxic effects at high toxic concentrations on 3T3-E1 cells. ROS played a key role on TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cytotoxicity, including cell viability, apoptosis and necrosis, and changes in cell morphology. Moreover, TiO₂ and ZrO2 NPs at high concentrations showed inhibitory effects on osteogenic differentiation of 3T3-E1 cells. Our findings could provide deep insights into the biocompatibility and potential application of ZrO2 NPs.