Otimização da Captura de Nanopartículas Core-Shell Fe₃O₄-Au para Endocitose Direcionada em Células de Câncer Colorretal

Resumo

Nanopartículas (NPs) core-shell de magnetita (Fe₃O₄)-ouro (Au) têm propriedades magnéticas e ópticas únicas. Quando combinadas com moiedades biológicas, estas NPs podem oferecer novas estratégias para aplicações biomédicas, como liberação de fármacos e direcionamento de câncer. Aqui, apresentamos um método eficaz para a captação celular controlável de sistemas de NP core-shell magnéticas combinadas com moiedades biológicas. Vimentina, que é a proteína estrutural, foi bioquimicamente confirmada para afetar fagocitose potentemente. Além disso, a vimentina afeta a internalização de materiais exógenos nas células mesmo sob inibições múltiplas de moiedades biológicas. Neste estudo, demonstramos o desempenho de internalização celular de NPs core-shell Fe₃O₄-Au com modificação de superfície usando combinação de moiedades biológicas. A fotofluorescência de NPs marcadas com vimentina permaneceu inalterada sob testes de inibição múltipla, indicando que as NPs foram minimamente influenciadas por nistatina, dynasore, citochalasina D e até mesmo anticorpo Muc1 (Ab). Consequentemente, este resultado indica que o Ab Muc1 pode direcionar moléculas específicas e controlar endocitose específica. Além disso, mostramos a possibilidade de controlar endocitose específica em células de câncer colorretal.

Introdução

Nanomateriais abriram novos caminhos para diagnóstico clínico e terapêutica. Especialmente, nanopartículas (NPs) são uma das ferramentas mais importantes e têm sido usadas em aplicações como biossensores [1, 2], diagnóstico [3, 4] e sistemas de liberação de fármacos direcionados [5, 6]. Para aplicações biomédicas, NPs geralmente compostas de materiais orgânicos circundando superfície em materiais de núcleo [7,8,9]. Os materiais de núcleo, que consistem de materiais magnéticos, materiais semicondutores ou outros tipos de materiais, têm propriedades físico-químicas úteis, e a superfície orgânica externa fornece estabilidade química e funcionalidade às NPs. Para aplicações em sistemas de direcionamento biológico, não apenas as propriedades físico-químicas mas também a superfície orgânica externa, que são biofuncionalizadas para direcionamento, são parâmetros críticos. Exemplos de moiedades de direcionamento para funcionalização são anticorpos ou ligantes específicos para um alvo. Dependendo dos materiais biofuncionalizados na superfície externa, os mecanismos de endocitose de NPs são determinados. O mecanismo que permite NPs entrarem nas células tem sido assunto de muitos trabalhos de pesquisa recentes devido à sua importância em aplicações de nanomedicina [10,11,12,13,14,15].

Em particular, NPs magnéticas têm sido amplamente usadas em muitas aplicações de direcionamento de sítio específico, incluindo separação celular [16, 17], MRI [18], isolamento de DNA [19], liberação de fármacos [20], tratamento de hipertermia [21] e direcionamento de câncer [22]. Entre várias NPs magnéticas, nanocristais de magnetita têm sido mais amplamente usados em aplicações biomédicas devido à sua biocompatibilidade e estabilidade química. Embora muitos esforços tenham sido dedicados a aplicações biomédicas usando NPs magnéticas, ainda existem algumas questões críticas como boa dispersibilidade em solução aquosa, funcionalidade e biocompatibilidade. Para superar esses problemas, muitos estudos focaram na modificação de superfície de NPs usando uma variedade de grupos funcionais (ex: grupos carboxil e amina) [23]. No entanto, a fixação dos grupos funcionais na superfície de NPs de magnetita é um processo demorado e laborioso. Dado este fato, NPs magnéticas do tipo core-shell revestidas de Au são atrativas porque a superfície de Au pode ligar facilmente a biomoléculas e materiais orgânicos.

Especialmente, as propriedades magnéticas de NPs magnéticas núcleo-Au casca permitem separação magnética, aumentam resolução em imagem MRI, e podem ser aplicadas a terapia de hipertermia. Além disso, as propriedades superiores de ligação química do ouro são vantajosas para construção de sistemas de liberação mediada por receptor para direcionamento específico de câncer [24,25,26].

Nas últimas décadas, muitos pesquisadores relataram sistemas de liberação mediada por receptor para direcionamento de câncer [27,28,29].

O direcionamento de células cancerígenas mediado por receptor é uma forma de direcionamento ativo. A escolha do alvo é a chave para direcionamento ativo eficaz, e os alvos devem ser superexpressos na membrana extracelular. A maioria dos pesquisadores usou anticorpos monoclonais para tratamento de câncer, e o efeito terapêutico poderia ser grandemente aumentado quando terapias de anticorpos monoclonais são combinadas com quimioterapia convencional [30]. Apesar do sucesso da terapia de anticorpos monoclonais, anticorpos monoclonais apresentam várias limitações no direcionamento de câncer. Seu grande tamanho (aproximadamente 150 kDa) é um grande obstáculo para penetração tumoral [31, 32], e sua baixa estabilidade e baixa solubilidade dificultam seu uso generalizado [33]. A direção inhomogênea de sua fixação no transportador de direcionamento também é considerada obstáculo para ligação inespecífica. Para produzir anticorpos com penetração tumoral melhorada, uma ampla gama de formatos de anticorpos foram projetados e testados [34]. Além de anticorpos clássicos, um formato único de anticorpo está presente em espécies da família Camelidae. Os chamados anticorpos de cadeia pesada (HCAbs) ocorrem naturalmente no sangue periférico e leite destas espécies. Os fragmentos de ligação a antígeno de tais HCAbs são compostos de um único domínio, o domínio variável de cadeia pesada (VH) do HCAb camelídeo (VHH). O VHH, obtido recombinante após clonagem e expressão em bactérias ou fungos, é chamado de nanobody. Tem peso molecular de 11–15 kDa e é o menor anticorpo entre todos mAbs [35,36,37]. Não apenas seu pequeno tamanho os torna potencialmente adequados como sondas de direcionamento contra antígenos em locais isolados, mas também sua extremidade terminal facilmente modificável é atrativa para aplicação em direcionamento de câncer.

A entrega eficiente de NPs com direcionamento adequado e internalização de células são também fatores importantes no sistema de liberação. Relatou-se que vimentina atua papel importante como componente de anexação de patógeno e vias de entrada intracelular. Silenciamento da expressão do gene vimentina inibe fagocitose [38], enquanto vimentina clivada é sinal que aumenta significativamente fagocitose [39]. Portanto, neutralizar resistência à fagocitose celular causada por vimentina na superfície celular é importante para entrega eficiente de nanopartículas.

Neste estudo, investigamos as vias de endocitose de NPs core-shell Fe₃O₄-Au marcadas com nanobody modificadas com espaçadores PEG (polietileno glicol) de diferentes comprimentos. Vimentina, que se sabe ter forte efeito na fagocitose por experimentos bioquímicos [39], foi comparada como controle, e confirmou-se que efetivamente atua na internalização celular de NPs. Além disso, Muc1, que é uma glicoproteína de superfície celular e superexpressa em vários cânceres, como pancreático, mama, pulmão e estômago, é utilizada como biomarcador de direcionamento de câncer. Confirmamos a internalização eficiente de NPs core-shell Fe₃O₄-Au e os métodos de direcionamento controlável a células cancerígenas através da via de endocitose mediada por receptor Muc1 em células colônicas.

Materiais e Métodos

Materiais

Acetato de ouro (III) (Au(OOCCH₃)₃, 99,9%) foi obtido da Alfa Aesar. Outros produtos químicos incluindo acetilacetonato de ferro (III) (Fe(acac)₃, 99,9%), 1,2-hexadecanodiol (C₁₄H₂₉CH(OH)CH₂(OH), 90%), poli(etileno glicol)-bloco-poli(propileno glicol)-bloco-poli(etileno glicol) (PEG-PPG-PEG), e éter octil (C₈H₁₇OC₈H₁₇, 99%) foram comprados da Sigma-Aldrich e usados como recebidos. Alfa-piridil-2-dissulfeto-ômega-carboximido succinimílico polietileno glicol (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K e 10K) foi comprado da Nanocs. Bicarbonato de sódio, WST-1, clorpromazina, nistatina, citochalasina D, dynasore, brefeldina A (BFA), monensina e azul de tripano foram comprados da Sigma-Aldrich. Cy3 e Cy7.5 foram comprados da Lumiprobe. Anti-Muc1 Ab foi comprado da Abcam Inc. (Cambridge, MA). Salina fosfatada tamponada (PBS), meio Eagle modificado de Dulbecco, e soro fetal bovino foram comprados da Invitrogen Corp.

Síntese de NPs Core-Shell Fe₃O₄-Au

As NPs core-shell Fe₃O₄-Au foram sintetizadas via método de nanoemulsão. O processo sintético para NPs core-shell consiste em duas etapas: (1) formação dos NPs de núcleo Fe₃O₄ e (2) revestimento da casca Au nas NPs magnéticas. Na primeira etapa, os NPs Fe₃O₄ foram preparados de uma solução mista de Fe(acac)₃ (0,1766 g ou 0,5 mmol), 1,2-hexadecanodiol (0,6468 g ou 2,5 mmol), e copolímero de bloco (poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno); PEO-PPO-PEO) (0,4 ~ 1,2 g) em éter octil. A solução mista foi aquecida a 300 °C para reduzir o precursor de Fe. A formação dos NPs de núcleo Fe₃O₄ foi completada pelo resfriamento da solução aquecida. O segundo processo foi conduzido continuamente sem qualquer processo de purificação após a formação do núcleo magnético. Precursores de Au (0,2338 g ou 0,62 mmol) e 1,2-hexadecanodiol (0,88 g, 3,4 mmol) foram adicionados na emulsão consistindo de NPs Fe₃O₄, e então a solução mista foi aquecida a 230 °C. Após resfriar à temperatura ambiente, a emulsão foi precipitada por centrifugação e os NPs core-shell foram separados.

Construção do Vetor de Expressão Recombinante Anti-Muc1-VHH 5-24 K10

Reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada usando primer forward 5′-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3′ e primer reverse 5′-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3′. O produto PCR foi digerido com EcoRI e XhoI e purificado em gel usando Kit QIA quick Gel Extraction (QIAGEN, Valencia, CA, EUA). O produto PCR purificado foi clonado em pET-23a digerido EcoRI/XhoI (Novagen, Darmstadt, Alemanha). Escherichia coli (E. coli) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) foi transformado com o construto resultante por choque térmico e selecionado em placas de ágar LB contendo 100 μg/mL ampicilina (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Baixos).

Expressão e Purificação de Proteína Recombinante

Para expressar e purificar proteína recombinante anti-Muc1-VHH 5-24 K10, cepas E. coli BL21 (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) foram transformadas com pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Bactérias foram então cultivadas em caldo LB contendo ampicilina (100 μg/mL). Expressão de proteína foi induzida por isopropil β-d-tiogalactosídeo (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Baixos) a concentração final de 0,4 mM por 5 h a 37 °C. Pelotas bacterianas foram ressuspensas em buffer de lise (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0; 300 mM NaCl) seguido por sonicação em gelo por 10 min. Lisados sonicados foram centrifugados a 20.000×g por 20 min a 4 °C e submetidos a Resina Ni-NTA His·Bind (Peptron, Daejeon, Coreia). Proteínas marcadas com His ligadas à resina foram eluídas com buffer de eluição (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0; 300 mM NaCl; 150 mM imidazol). Proteína purificada foi separada em gel SDS-PAGE 15%.

Modificação de NPs Core-Shell Fe₃O₄-Au

OPSS-PEG-NHS em vários comprimentos (2, 5 e 10 K) foi dissolvido em bicarbonato de sódio 0,1 M para ativação dos grupos tiol. OPSS-PEG-NHS ativado foi adicionado à solução de NPs core-shell Fe₃O₄-Au sintetizadas e agitado por 12 h a 4 °C. Os grupos tiol de OPSS-PEG-NHS ativado foram ligados covalentemente à superfície de Au dos NPs core-shell. Então, solução de nanobody (0,25 mg/mL) foi adicionada aos NPs core-shell Fe₃O₄-AU PEGilados por 12 h a 4 °C. Os grupos amina das dez caudas lisina (K) no terminal foram ligados covalentemente aos grupos NHS de OPSS-PEG-NHS a pH 8,3. Cy3 e Cy7.5 foram marcados nos grupos amina residuais do nanobody.

Curva de Internalização

Células CT26 foram semeadas a 5 × 10³ células por poço em placa de 96 poços de fundo claro e incubadas em 250 μL de meio de cultura por 24 h a 37 °C em 5% CO₂ no escuro. O meio foi removido, e 250 μL de meio de cultura fresco contendo 50 μg/mL NPs Fe₃O₄-Au marcados com Cy3 e NPs marcados com PEG-Cy3 ou PEG-nanobody-Cy3 foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas adicionalmente por diferentes períodos (0, 10, 20, 30, 60, 120 e 360 min). As células foram então lavadas três vezes com PBS para remover NPs livres, e a fluorescência de cada poço foi medida com azul de tripano como quencher de fluorescência impermeável à membrana por SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, EUA). Cada experimento foi realizado com quantidades iguais de NPs (50 μg/mL) e repetido três vezes [40].

Teste de Inibição

Células CT26 foram semeadas a 5 × 10³ células por poço em placa de 96 poços de fundo claro e incubadas em 250 μL de meio por 24 h a 37 °C em 5% CO₂ no escuro. O meio foi removido e 250 μL de meio de cultura fresco contendo 20 μg/mL clorpromazina (CPZ), 50 μg/mL nistatina, 20 μg/mL citochalasina D, 25 μg/mL dynasore, 20 μg/mL BFA, 140 μg/mL monensina, ou 5 μM anti-Muc1 Ab foram adicionados, e as células foram incubadas por 1 h.

O meio foi removido novamente, e 250 μL de meio de cultura contendo 50 μg/mL NPs Fe₃O₄-Au marcados com Cy3, NPs marcados com PEG-Cy3, NPs marcados com PEG-nanobody-Cy3, ou NPs marcados com vimentina-Cy3 foi adicionado.

Após 1 h a 37 °C e 5% CO₂, as células foram lavadas três vezes com PBS para remover NPs livres, e a fluorescência foi medida com azul de tripano como quencher de fluorescência impermeável à membrana por SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, EUA). Cada experimento foi realizado com quantidades iguais de NPs (50 μg/mL) e repetido quatro vezes.

Resultados e Discussão

Os NPs core-shell foram sintetizados por método publicado [16, 17]. Observações de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) na Fig. 1a, b mostram que os NPs core-shell Fe₃O₄-Au eram esféricos com diâmetro médio de 13,5 nm e distribuição de tamanho estreita.

Caracterização dos NPs core-shell Fe₃O₄-Au sintetizados. a, b Observações TEM dos NPs core-shell Fe₃O₄-Au sintetizados. c, d NPs em solução aquosa, antes e depois de aplicar campo magnético externo. e Pico de absorbância UV dos NPs core-shell sintetizados aparece a ~530 nm. f Laços de histerese magnética do núcleo Fe₃O₄

O aumento dos ~8,5 nm do NP de núcleo (Fe₃O₄) decorre do revestimento de casca Au de ~2,5 nm de espessura na superfície do núcleo, resultando em NP core-shell. Uma imagem TEM de alta resolução com análise de transformada rápida de Fourier (FFT) do NP core-shell Fe₃O₄-Au está incluída na Informação Suplementar Fig. S1.

O produto fabricado em solvente orgânico foi purificado usando separação magnética e transferido para água.

Os NPs core-shell estavam bem dispersos e estáveis em água sem qualquer modificação de superfície, devido a copolímeros de bloco residuais presentes nos NPs.

A Figura 1c e d mostram os NPs em solução aquosa antes e depois de aplicar campo magnético externo. Sob campo magnético externo, os NPs core-shell mudaram rapidamente de dispersão homogênea (Fig. 1c) para solução clara e transparente (Fig. 1d).

A banda de absorção dos NPs core-shell foi investigada usando espectrometria UV-Vis. Como mostrado na Fig. 1e, um pico de absorbância apareceu a ~530 nm, indicando a presença de Au na superfície dos NPs (Informação Suplementar Fig. S2 inclui resultado de dados EDX para NPs core-shell Fe₃O₄-Au). Como a amostra foi purificada, os resultados ópticos demonstraram a formação da estrutura core-shell.

Laços de histerese magnética foram obtidos de medições de amostra vibratória para investigar propriedades magnéticas do núcleo Fe₃O₄ e NPs core-shell. Ambos NPs mostraram comportamento superparamagnético com coercividade próxima a 0 Oe a temperatura ambiente (Fig. 1f).

Como relatado em trabalhos anteriores, a suscetibilidade de NPs core-shell foi maior que a de NPs de magnetita, que pode ser parcialmente devida a efeitos de proximidade e configurações espaciais únicas [41, 42]. Além disso, as magnetizações de saturação dos NPs de núcleo e NPs core-shell são ~37 emu/g e ~21 emu/g a 10 kOe, respectivamente. A diferença no Ms decorre da existência de componente não-magnético (Au) nos NPs core-shell.

O gene VHH 5-24 K10 foi clonado in-frame para produzir pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 após amplificação PCR (Fig. 2a). A proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 transformado com pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 após indução com IPTG e purificada por Resina Ni-NTA His·Bind. Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinante foi prontamente expresso em E. coli como proteína solúvel de 18 kDa. De uma cultura de 1 L, obtivemos 1 ± 0,5 mg de anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinante purificado.

Expressão e purificação de proteína de fusão anti-Muc1-VHH 5-24 K10. O gene VHH 5-24 K10 foi clonado in-frame para produzir a pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 após b purificação de proteína de fusão Muc1-VHH 5-24 K10. Proteína purificada foi separada em SDS-PAGE 15%. Linha 1 escada de proteína. Linha 2 proteína purificada. c Ilustração esquemática de NPs marcados com PEG-nanobody-corante usados neste estudo

A proteína purificada foi verificada por gel SDS-PAGE 15%. Coloração com azul de Coomassie da proteína purificada revelou que era >95% pura (Fig. 2b). Os NPs Fe₃O₄-Au sintetizados foram modificados em três etapas, nomeadamente PEGilação, marcação com anticorpo e marcação com corante (Fig. 2c). Após cada etapa de modificação, o potencial zeta foi medido para confirmar a modificação bem-sucedida. A Tabela 1 mostra o efeito da modificação nos potenciais zeta correspondentes. O potencial zeta de NPs core-shell nus era −19,8 ± 6,68 mV. PEGilação de NPs foi realizada usando OPSS-PEG-NHS. Para produzir uma série de nanocomplexos com diferentes tamanhos, OPSS-PEG-NHS com vários comprimentos (2K, 5K e 10K) foi usado.

Após PEGilação, os potenciais zeta foram reduzidos (−44,9 ± 8,19 mV, −40,7 ± 7,88 mV e −39,6 ± 8,74 mV para 2K, 5K e 10K, respectivamente).

Curiosamente, após marcação com nanobody, os potenciais zeta aumentaram claramente (−38,5 ± 5,61 mV, −23,3 ± 8,61 mV e −31,8 ± 7,37 mV para 2K, 5K e 10K, respectivamente).

Após marcação com corante, os potenciais zeta também aumentaram (−12,5 ± 7,25 mV, −17,7 ± 3,94 mV e −10,6 ± 4,72 mV para 2, 5 e 10K, respectivamente).

O potencial zeta de NPs core-shell Fe₃O₄-Au nus era −19,8 ± 6,68 mV. Após PEGilação, o potencial zeta foi reduzido para cerca de −40 mV. Estes resultados indicam que as moléculas PEG foram bem ligadas covalentemente à casca Au dos NPs core-shell porque moléculas PEG têm grupos funcionais N-hidroxisuccinimida carregados negativamente. Enquanto isso, o potencial zeta aumentou após marcação com corante no nanobody (−38,5 ± 5,61 mV para NP-PEG2K-nanobody e −12,5 ± 7,25 mV para NP-PEG2K-nanobody-corante). Este resultado é razoável porque o nanobody recombinante tem dez caudas lisina no terminal. Cada tipo de nanobody foi categorizado por medição de potencial zeta, e para determinar ligação de anticorpo no nanobody, medimos a fluorescência para cada tipo de nanobody.

Como mostrado na Fig. 3, confirmamos que todos os tipos de nanopartículas e nanobodies têm boa captação e internalização celular na ausência de restrições de inibidor. Uma curva de internalização celular foi obtida de células incubadas na presença de 50 μg/mL NPs Fe₃O₄-Au marcados com Cy3, NPs marcados com PEG-Cy3 e NPs marcados com PEG-nanobody-Cy3 por diferentes períodos (entre 0 e 360 min) após remoção de meio, lavagem de NPs livres e finalmente medição da fluorescência total das células com azul de tripano (Fig. 3).

Fotofluorescência normalizada de células CT26 mucina após incubação com 50 μg/mL a NPs Fe₃O₄-Au, b NPs PEGilados e NPs marcados com PEG-nanobody, e c NPs Fe₃O₄-Au, NPs marcados com nanobody e NPs marcados com vimentina a 37 °C em 5% CO₂ por diferentes períodos (10, 20, 30, 60, 120 e 360 min)

De acordo com o resultado de medição de intensidade de fluorescência, podemos determinar que os NPs foram internalizados nas células dentro de 1 h (Fig. 3a). A intensidade de fluorescência de NP atingiu máximo dentro de 1 h, e a intensidade de fluorescência diminuiu gradualmente após atingir estado estacionário. Embora haja leve diferença de tempo dependendo da presença de Ab, a intensidade de fluorescência por tempo de cultivo não foi significativamente diferente do resultado de NPs nus (Fig. 3b). Como mostrado na Fig. 3c, confirmou-se que o efeito de Ab, usando Ab heterogêneo de Muc1 e vimentina, foi desprezível na captação e internalização celular de NP.

Com ensaio WST-1, a viabilidade (%) de células CT26 mucina dependendo da concentração e modificação de superfície de NPs core-shell Fe₃O₄-Au foi estimada seguindo vários tempos de exposição (Fig. 4a, b). A viabilidade de células CT26 não mostrou diferenças significativas seguindo 24 h e 48 h de exposição, seja com doses variadas ou após modificação de superfície dos NPs. Viabilidade celular foi maior que 90% tanto nos NPs core-shell Fe₃O₄-Au nus (Fig. 4a) quanto nos NPs modificados (Fig. 4b).

Viabilidades de células CT26 mucina tratadas com NPs core-shell Fe₃O₄-Au nus e NPs Fe₃O₄-Au modificados de superfície em diferentes concentrações. a NPs Fe₃O₄-Au e b NPs marcados com PEG-nanobody-Cy3. Cada gráfico experimental representa a média de uma série de quatro experimentos diferentes

A Figura 5 indica que NPs entraram nas células CT26 mucina via várias vias de endocitose (mediada por clatrina, mediada por caveolae e vias de fagocitose/macropinocitose). Curiosamente, Fig. 5b mostra que anti-Muc1 Ab também afetou principalmente a endocitose de NPs marcados com PEG-nanobody-Cy3. Para entender a via de internalização de NP, tentamos inibir vias de endocitose com inibidores químicos específicos (Fig. 5). As vias de endocitose são bem conhecidas por serem divididas em três tipos: mediada por clatrina, mediada por caveolae e macropinocitose/fagocitose.

Fotofluorescência normalizada de células CT26 mucina tratadas com inibidores químicos de endocitose por 1 h e incubadas com 50 μg/mL a NPs core-shell nus e b NPs marcados com nanobody a 37 °C em 5% CO₂ por 30 min. Inibidores com efeito estatístico na internalização (teste t de Student, p (*) < 0,05 e p (**) < 0,01) são marcados com asteriscos pretos

Neste estudo, inibidores foram usados como primeira abordagem para investigar a internalização de NPs marcados com nanobody. CPZ (inibidor de endocitose mediada por clatrina), nistatina (inibidor de endocitose mediada por caveolae), dynasore (inibidor de dinamina), citochalasina D (inibidor de fagocitose/macropinocitose), BFA (destruidor de aparelho de Golgi), monensina (inibidor de lisossomo) ou anti-Muc1 Ab (competidor específico de receptor/transportador) foram incubados com células por 1 h. CPZ, nistatina, dynasore e citochalasina D afetaram a endocitose de NPs (Fig. 5a).

A moiedade de direcionamento é a chave para o sucesso do direcionamento de câncer, que é excepcionalmente importante na terapia de câncer. Para direcionamento, modificação de superfície eficaz é muito importante para aumentar eficiência terapêutica e limitar efeitos colaterais. NPs core-shell Fe₃O₄-Au marcados com nanobody foram feitos com sucesso dos NPs sintetizados e nanobody recombinante. A Tabela 1 mostra claramente que cada etapa de modificação foi realizada com sucesso.

Viabilidade celular é um dos elementos essenciais para aplicação biológica de nanomateriais. As viabilidades celulares foram maiores que 90% nos NPs core-shell nus e NPs modificados (Fig. 4a, b). Estes resultados implicam que NPs core-shell Fe₃O₄-Au nus e NPs modificados não causaram citotoxicidade significativa dependente de concentração e modificação e que os NPs modificados eram adequados para aplicação biológica.

Os estudos de eficiência de internalização e efeito de inibidor de NPs fornecem informação importante para entender os mecanismos através dos quais NPs entram nas células. NPs PEGilados foram internalizados relativamente mais lentamente nas células comparados com NPs nus, mas NPs marcados com nanobody foram internalizados nas células ligeiramente mais rápido que NPs nus (Fig. 3a, b). Como PEGilação é um método bem conhecido de modificação de superfície para prevenir internalização de NPs, a tendência de internalização de NPs PEGilados é facilmente explicada. Além disso, o nanobody induziu a endocitose de NPs. Para verificar a especificidade do nanobody, confirmamos a taxa de internalização de NPs marcados com Ab vimentina. Curiosamente, NPs marcados com Ab vimentina não promoveram internalização celular (Fig. 3c).

Estes resultados indicam que o nanobody pode efetivamente induzir a internalização de nanomateriais em células CT26 mucina e implicam que a tendência de internalização pode ser controlada com modificação específica da membrana externa de NPs. Adicionalmente, os mecanismos de endocitose de NPs marcados com nanobody foram claramente mostrados via testes de inibição e imagem de microscopia confocal. A fotofluorescência de ambos NPs marcados com nanobody e NPs não marcados mostraram valores decrescentes similares quando cultivados com CPZ, nistatina ou dynasore (Fig. 5a, b). CPZ, nistatina e dynasore desempenham papel inibindo, respectivamente, endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolae e dinamina, que é uma grande GTPase implicada na brotação e cisão de vesículas nascentes de membranas parentais. Com isso, os valores de fotofluorescência em ambos casos diminuíram rapidamente porque dinamina está intimamente relacionada à produção de vesículas para endocitose mediada por clatrina e caveolae. Como mostrado na Fig. 5a, tanto NPs não marcados (Fig. 5a) quanto NPs marcados com nanobody (Fig. 5b) mostraram diminuições rápidas em fotofluorescência.

Em particular, NPs marcados com nanobody exibiram valores de fotofluorescência significativamente menores em CPZ, nistatina e dynasore. Além disso, confirmamos que NPs não marcados foram mais fortemente afetados que NPs marcados com nanobody quando aplicados a citochalasina D, que é uma toxina permeável à célula que bloqueia polimerização de filamentos de actina para fagocitose [43]. Estes resultados implicam que NPs não marcados foram internalizados através de múltiplos mecanismos como endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolae e fagocitose. Consequentemente, a internalização celular de NPs marcados com nanobody depende de endocitose mediada por clatrina e caveolae. Além disso, a quantidade de captação celular de NPs marcados com nanobody foi reduzida consideravelmente quando células foram cultivadas com anticorpo Muc1 (Fig. 5b). Este resultado indica que o anticorpo Muc1 livre desempenha papel como competidor do nanobody nos NPs modificados na fixação à membrana de célula CT26 e que o anticorpo Muc1 desempenha parte importante na internalização celular dos NPs modificados. Peculiarmente, NPs marcados com Ab vimentina mostraram diferenças óbvias comparados com NPs marcados com nanobody em termos de capacidade de inibição. A fotofluorescência de NPs marcados com vimentina permaneceu inalterada sob testes de inibição múltipla, indicando que as NPs foram minimamente influenciadas por nistatina, dynasore, citochalasina D e até mesmo Ab Muc1. Este fenômeno pode ser evidência da eficácia da vimentina, que foi bioquimicamente confirmada para afetar potentemente fagocitose [39]. Consequentemente, este resultado indica que o Ab Muc1 pode direcionar moléculas específicas e controlar endocitose específica.

Como mostrado na Fig. 6, resultados análogos foram obtidos quando as células foram tratadas com NPs core-shell nus marcados com Cy7.5 e NPs marcados com PEG-nanobody, indicando captação celular similar em ambos casos na ausência de inibição de dynasore. Inibição de dynasore induziu internalização celular distintamente menor dos NPs marcados com PEG-nanobody comparados com NPs nus (Fig. 6b, linha inferior). Estes resultados implicam que existem dois mecanismos de endocitose, que são endocitose não-específica de NPs nus e endocitose restrita de NPs marcados com nanobody via molécula dinamina. Uma vez que o nanobody fixa na membrana celular externa, os NPs marcados com nanobody poderiam facilmente passar pela membrana celular devido à ativação simultânea dos mecanismos mediados por clatrina e caveolae. Consequentemente, poderíamos supor que os principais mecanismos são ambos endocitose mediada por clatrina e caveolae para internalização de NPs marcados com nanobody em células CT26 mucina.

Imagem de microscopia confocal de células CT26 mucina incubadas com a NPs Fe₃O₄-Au e b NPs marcados com PEG-nanobody por 1 h a 37 °C em incubadora 5% CO₂, antes e depois de inibição de dynasore (1 ng/mL)

Conclusões

Nanomateriais para direcionamento de câncer e inserção controlável de materiais exógenos como fármacos, genes e peptídeos são avanços críticos em aplicações biomédicas. Estes conceitos familiares mas criativos podem oferecer estratégias para novos métodos terapêuticos. Neste artigo, demonstramos captação celular aprimorada de NPs core-shell Fe₃O₄-Au após PEGilação com anticorpo Muc1. Os principais mecanismos de endocitose de NPs marcados com nanobody foram demonstrados, mostrando a possibilidade de endocitose específica controlável em células de câncer colorretal. Estas descobertas fornecem insight sobre o direcionamento entre NPs marcados com nanobody e células de câncer colorretal para auxiliar o projeto de transportadores de direcionamento de alta eficiência.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.

Abreviações

Fe₃O₄:

Magnetita

Au:

Ouro

NPs:

Nanopartículas

Ab:

Anticorpo

HCAbs:

Anticorpos de cadeia pesada

VHH:

VH do HCAb camelídeo

PEG:

Poli(etileno glicol)

PPG:

Poli(propileno glicol)

PCR:

Reação em cadeia da polimerase

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

PEO-PPO-PEO:

Poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno)

OPSS-PEG-NHS:

Éster succinimílico PDP PEG ortopiridil dissulfeto

BFA:

Brefeldina A

CPZ:

Clorpromazina