Otimização de Hipertermia Disparada por NIR com Nanopartículas Cs_0.33WO₃ para Tratamento de Câncer Hepático HepG2

Resumo

A hipertermia é um dos métodos mais amigáveis ao paciente para curar doenças cancerígenas devido à sua não invasividade, efeitos colaterais e toxicidade minimamente induzidos, e fácil implementação, incentivando o desenvolvimento de novos métodos terapêuticos como sistemas de dosagem acionados fototermicamente. Esta pesquisa investiga as variáveis dos efeitos fototérmicos de nanopartículas (NPs) de Cs_0.33WO₃, a duração da irradiação, densidade de potência óptica e concentração de NPs, sobre a linhagem de células de câncer hepático HepG2 in vitro, levando à formulação de uma dose térmica irradiada por infravermelho próximo (NIR). Expressamente, as NPs com tamanhos de característica particulada de 120 nm foram sintetizadas através de uma série de reações de oxidação-redução (REDOX), recozimento térmico e processos de moagem úmida, e a subsequente caracterização de propriedades físicas, composicionais, ópticas e fototérmicas foram examinadas usando espalhamento dinâmico de luz (DLS), espectroscopia de raios X por energia dispersiva (EDS), microscopias eletrônicas de varredura e tunelamento (SEM e TEM), difração de raios X (XRD) e fotospectroscopia visível-infravermelho próximo (VIS-NIR). Citotoxicidade das NPs e seus parâmetros de irradiação foram obtidos para as células HepG2. Ao incubar as células com as NPs, o estado de endocitose foi verificado, e a dependência da taxa de sobrevivência celular nos parâmetros variáveis de dose fototérmica foi determinada mantendo a temperatura do meio da placa de cultura contendo células na temperatura corporal humana em torno de 36,5 °C.

Introdução

Globalmente, apenas no ano de 2018, doenças cancerígenas ferozes ceifaram cerca de 10 milhões de vidas e adicionaram estimados 18 milhões de novos casos [1]. Até agora, embora quimioterapia, radiação, remoção cirúrgica ou combinação personalizada destes três representem uma melhoria da taxa de sobrevivência de 5 anos ligeiramente acima de 40% de pacientes com câncer tratados [2, 3], a natureza tóxica e deletéria de químicos e bombardeio iônico inevitavelmente causam numerosos efeitos colaterais como perda de cabelo, cardiotoxicidade, infertilidade, anomalias cromossômicas e muitos mais [4, 5]. Tais consequências que afligem a vida têm instado fortemente o desenvolvimento de medicina terapêutica amigável ao paciente incluindo compostos incorporados com NPs.

A nanotecnologia baseada em sistema de material peculiar, estruturas, forma e estequiometria atômica em escala de tamanho abaixo de 100 nm produz propriedades químicas, físicas e bioquímicas sem precedentes aprimoradas pelos fenômenos de quantização e já encontrou aplicações pré-clínicas e in vitro em muitos ramos da ciência biomédica [6, 7]. Apesar das desvantagens da quimioterapia, NPs servindo como transportadores de entrega melhoram a seletividade da liberação de drogas no tumor doente, facilitam a captação de drogas pelas células tumorais e reduzem amplamente a toxicidade cumulativa no tecido saudável [8, 9]. Além disso, a qualidade de imagem produzida por uma variedade de modalidades de imagem baseadas em NPs é grandemente aprimorada com maior sensibilidade, resolução espacial mais fina e melhor penetração de profundidade para revelar bio-distribuição, monitorar captação de drogas, localizar tumor e avaliar eficácia do tratamento [10]. Além da função diagnóstica, as NPs quando aproveitadas com propriedade física inerente, como ablação por radiofrequência (RF) ou hipertermia renderizada fototermicamente, podem induzir danos no local desejado com eficiência aprimorada [11,12,13], das quais a segunda é comumente preferível sobre sua dosagem específica de local, menor grau de dor, baixos efeitos colaterais e risco muito reduzido de queimadura de tecido.

Até agora, os sistemas de material de NP capazes de induzir hipertermia sob foto-irradiação incluem ouro (Au), tungstato de césio (CsWO₃), óxido de ferro, sulfeto de cobre, grafeno e nanotubo de carbono e demonstraram a aplicabilidade de impor danos letais em células cancerígenas elevando a temperatura extracelular ou intracelular in situ [14,15,16,17,18]. Semelhante à ablação RF aprimorada por NP, o nível de densidade de potência incidente de fontes fotônicas é uma questão crítica para segurança clínica e conforto do paciente [11], e manifesta-se que o limite máximo de exposição para pele humana na faixa de comprimento de onda VIS e NIR entre 400 a 980 nm é de 0,2 a 0,726 W/cm² de acordo com a Comissão Internacional de Proteção contra Radiação Não Ionizante (ICNIRP) publicada em 2013 [19]. No entanto, a maioria das densidades de potência óptica relatadas em estudos anteriores de células cancerígenas in vitro estavam bem além do limite de segurança para tecido de pele, o que pode ser um assunto grave quando se trata de tratar tecidos biológicos internos com um baixo limiar de foto-irradiação para vulnerabilidade. Por exemplo, a densidade de potência óptica NIR de nanopartículas de ouro (Au) que demonstraram destruição efetiva de células cancerígenas varia de 2 a 80 W/cm² quando irradiadas por no máximo 10 min [13, 14, 20,21,22]. Similarmente, uma variedade de outros sistemas de material como óxidos de grafeno [18], platina de ferro (FePt) [23] e nanocristais NaYF₄:Yb,Er [24] requereram não menos que 150 mW/cm² para implantação instrumental.

Sendo um material relativamente menos explorado para experimento in vitro, alguns estudos relataram aniquilação de células de câncer cervical (Hela) por NPs de CsWO₃ irradiadas por NIR com pelo menos 0,72 W/cm² [15, 25, 26] que está nas proximidades do limite de exposição de tecido de pele de comprimento de onda NIR definido pela ICNIRP e pode causar efeitos deletérios para tecidos saudáveis sob duração prolongada de exposição [19]. Além disso, a temperatura do meio de cultura engendrada pela combinação de dose de tratamento de concentração de NPs, duração de foto-exposição e intensidade óptica, em estudos passados, estava bem acima de 40 °C, o que é intolerável para células humanas saudáveis, e as taxas de mortalidade de células cancerígenas não foram delineadas em grandes detalhes.

NPs de CsWO₃ são excepcionalmente absorventes na faixa de comprimento de onda NIR de 800 nm até 2400 nm [27] e são funcionalmente adequadas para aplicação biomédica. Apesar de sua eficácia excepcional demonstrada na eliminação de células cancerígenas, a citotoxicidade ainda é amplamente desconhecida e a provisão de uma fórmula de dosagem de concentração de NPs de baixa citotoxicidade, curta duração de irradiação e densidade de potência óptica dentro do limite de segurança de foto-exposição para tecido de pele ainda está faltando.

O estudo de pesquisa aqui tenta avaliar in vitro a viabilidade de aniquilar células de câncer hepático HepG2 cultivadas em uma placa de Petri com diâmetro de 5,2 cm utilizando concentração de NPs não citotóxica e densidade de potência óptica bem dentro do limite de foto-exposição de tecido de pele enquanto mantém a temperatura do meio de cultura celular na temperatura corporal humana normal de 36,5 °C. Em detalhe, NPs de Cs_0.33WO₃ com tamanho médio de característica centrado em torno de 120 nm foram sintetizadas usando uma sequência de processos redox, recozimento térmico e moagem úmida, e caracterizadas com sua morfologia de superfície, cristalinidade, e propriedades fototérmicas ópticas e temporais. Além disso, os efeitos fototérmicos de parâmetros de dose variáveis, duração de irradiação, concentração das NPs e densidade de potência óptica de irradiação NIR operando no comprimento de onda central de 980 nm, sobre a taxa de sobrevivência das células de câncer HepG2, foram examinados e julgados para conceber uma combinação de dose de tratamento segura.

Métodos

Nesta pesquisa, a 102ª geração de linhagem de células de câncer hepático HepG2 derivada de tumor primário humano foi cultivada como modelo experimental para avaliar citotoxicidade imposta por NPs de Cs_0.33WO₃ caseiras irradiadas por NIR e avaliar as eficácias terapêuticas de várias doses térmicas bem dentro do limite de segurança para exposição de tecido de pele e em concentração de NPs não tóxica.

Síntese de NPs de Cs_0.33WO₃

O painel esquerdo da Fig. 1 ilustra o fluxograma diagramático do procedimento de síntese para material de nanopartículas de óxido de tungstênio de césio (Cs_0.33WO₃). Em resumo, os produtos químicos precursores, ((NH₄)₂WO₄) (Alfa Aesar, 99,9% pureza) e CsCl (Alfa Aesar, 99,9% pureza) foram dissolvidos separadamente em 100 ml de água DI e então misturados juntos a 25 °C sob agitação constante a 250 rotações por minuto (rpm) utilizando um agitador magnético por uma hora (hr). Após a agitação terminar, a temperatura do béquer contendo a mistura de solução foi ajustada para 180 °C e assada até que o conteúdo de água da solução fosse completamente evaporado. O pó branco seco resultante foi o precursor final do material Cs_0.33WO₃. Com o resfriador ligado, o barco de quartzo contendo o pó precursor foi carregado no centro de um tubo de forno de alta temperatura, e a pressão dentro do tubo do forno foi trazida para 0,08 torr. Em seguida, o precursor é aquecido a 500 °C junto com a introdução de uma entrada de uma combinação de gases, H₂ e N₂, em uma proporção de 90 a 10 centímetros cúbicos padrão por minuto (SCCM) para facilitar a reação redox. Após 1 h, a entrada de gás H₂ é desligada, o fluxo de gás N₂ é ajustado para 100 SCCM, e a temperatura do forno é elevada para 800 °C para recozimento térmico por uma hora. Após a conclusão dos processos, o resfriador e o forno controlado por temperatura foram desligados, e o barco de quartzo foi resfriado até atingir temperatura ambiente e foi removido do tubo do forno. O pó azul escuro resultante obtido do barco de quartzo é o pó de Cs_0.33WO₃ de tamanho mícron (µ). Para reduzir ainda mais o tamanho de característica dos grãos de pó, 150 g de uma solução de mistura composta de 15 g do pó µ, 3,8 g de um agente dispersante à base de copolímero para prevenir agregação de partículas, 10 μl de agente antiespumante e água D.I foi preparada, despejada em uma tigela de amostra que continha 600 g de esferas de zircônia e foi montada na câmara de um equipamento de nanomoagem (Justnanotech Co., Taiwan). Com a velocidade e temperatura definidas para 2400 rotações por minuto (RPM) e 15 °C, as NPs são produzidas moendo o pó µ com esferas de ZrO₂ de 0,1 mm por 4 h, e com esferas de ZrO₂ de 0,05 mm por mais 4 h. A duração total de cada processo de moagem não excede 4 h para evitar viscosidade excessiva do fluido, bem como qualquer mudança errática dos tamanhos físicos do material. A solução final após o processo de moagem foi peneirada através de um filtro de poro de 0,22 μm para toda caracterização e experimento subsequentes. A versão fluorescente de NPs de Cs_0.33WO₃ (fNPs) foi feita usando o seguinte protocolo. Uma solução feita de 2 ml de fluoresceína na concentração de 28 mg/ml e 2 ml de solução de NPs de Cs_0.33WO₃ a 1,5 mg/ml foi preparada em um béquer e colocada na tigela de um agitador ultrassônico por 15 min. Subsequentemente, a solução de NPs e o dispersante foram misturados em uma proporção de 1:1,25 e passaram por agitação ultrassônica por 15 min. A solução resultante foi então lavada com água D.I. e centrifugada a 10.000 rpm por 15 min. e repetida duas vezes antes de qualquer uso.

Caracterização do Material

Posteriormente, a caracterização de NPs de Cs_0.33WO₃ incluindo tamanhos de característica estatísticos das NPs, estrutura cristalina, morfologia estrutural, forma de contorno, foto-absorbância VIS-NIR foi conduzida usando análise de potencial zeta (ZS90, Malvern, UK), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Alemanha), SEM (SU-5000, Hitachi, Japão) em conjunto com espectrometria de energia dispersiva embutida (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Japão), espalhamento dinâmico de luz (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, EUA), espectrômetro UV-VIS-NIR (V-750, Jasco, Japão), respectivamente. Os espectros de XRD foram adquiridos varrendo o raio X sobre as amostras dentro de um intervalo angular de 20° a 80° na taxa de varredura de 4° por min. O sinal de difração dependente do ângulo de varredura da amostra foi determinado e comparado com o espectro XRD padrão de Cs_0.32WO₃ do cartão No. 83-1334 do Comitê Conjunto sobre Padrões de Difração de Pó (JCPDS). Para confirmar a dependência temporal da propriedade fototérmica das NPs, um aparato experimental simples composto de laser NIR de 980 nm de comprimento de onda e uma sonda de medição de temperatura foi configurado para sondar o estado de temperatura engendrado pela solução irradiada por NIR. As soluções de exame incluem a solução de NPs diluída em água D.I. e a mistura de solução de NPs em meio de cultura celular. O diâmetro do feixe óptico para amostras nas placas de Petri foi expandido para cobrir toda a superfície da placa de Petri, produzindo 0,05 W/cm² em densidade de potência óptica estimada, caso contrário permaneceu intacto a 2 W/cm². Uma configuração óptica mostrada no painel direito da Fig. 1 é utilizada para realizar irradiação NIR. No coração do sistema óptico está um feixe de laser NIR direcionado para uma lente bi-côncava que expande o diâmetro do feixe de 4 mm para 5,2 cm, equivalente ao diâmetro de superfície de uma placa de Petri colocada em uma chapa quente definida a 36,8 °C, que é uma temperatura fisiológica para crescimento celular; também, a placa de Petri é cercada por um invólucro cilíndrico de plástico para ajudar a equilibrar a temperatura do ambiente e do meio. Arquivo Adicional 1: Fig. S1 ilustra o mapeamento de intensidade óptica do feixe de laser NIR medido na saída da abertura do feixe que é indicado por uma seta vermelha próxima ao feixe de laser na Fig. 1. O perfil do feixe apresenta distribuição 3D de intensidade óptica e verifica a uniformidade do campo de luz sobre toda a abertura da placa de Petri.

Ensaios de Citotoxicidade e Fototérmicos

Para começar os ciclos de cultura celular, 500 ml de solução de meio composta por 440 ml de mistura nutritiva Ham's F-12 e meio essencial modificado de Dulbecco's Eagle (HDMEM), 50 ml de soro fetal bovino (FBS), 5 ml de L-glutamina e 5 ml de P/S (Penicilina-Estreptomicina), que foi esterilizado por um filtro de malha com tamanho de poro de 0,22 μm, foi preparado. As placas de Petri contendo células, 10 cm ou 5,2 cm de diâmetro, correspondentemente preenchidas com 8 ml e 2 ml do meio foram usadas para cultura primária e sub-cultura e incubadas em uma incubadora condicionada com 5% CO₂ e na temperatura de 37 °C. A observação do crescimento celular e uma renovação do meio de cultura foram feitas a cada dois dias.

Para obter as taxas de sobrevivência para os casos de ensaios celulares que incluem (1) controle sem entrada externa, (2) irradiação NIR isolada, (3) incubação com NPs, e (4) incubação com NPs junto com irradiação NIR subsequente, o meio de cultura na placa de cultura foi aspirado, e 0,4 ml de tripsina é adicionado à placa de cultura e colocado na incubadora por cerca de 10 min. Uma vez confirmada a desprendimento das células das paredes da placa, 10 μl do meio contendo células foi retirado da placa de cultura e adicionado a 10 μl de solução de azul de tripano em um microtubo de centrífuga, e uma remoção das NPs flutuantes remanescentes foi feita através de várias lavagens com solução tampão fosfato (PBS). Após isso, a contagem celular foi realizada preenchendo uma placa de contagem com 10 μl da solução celular corada através de um orifício de injeção, e as células podem ser observadas no plano focal de um estereomicroscópio e contadas por um contador manual; cada ponto de dados apresentado em todas as figuras concernentes à taxa de sobrevivência celular foi uma média de três ensaios experimentais (N = 3) mais a margem de desvio padrão.

Para preparar a avaliação da citotoxicidade das NPs e seus efeitos fototérmicos na taxa de sobrevivência celular, o meio na placa de 5,2 cm foi removido, re-preenchido com quantidade adequada de solução de NPs no novo meio para fazer uma matriz de concentração de teste, 2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml e 0,5 mg/ml, e então incubado por um dia antes do experimento.

Antes do ensaio fototérmico, a avaliação de citotoxicidade foi realizada para examinar a resposta das células a uma matriz de concentração de NPs e foi feita da seguinte forma. O meio contendo as células e NPs foi retirado da incubadora e aspirado. Um mililitro de PBS pré-aquecido foi usado para lavar as células cancerígenas e aspirar NPs remanescentes de CsWO₃ que não passaram por endocitose, o procedimento do qual é repetido várias vezes para garantir que qualquer mortalidade celular potencial não seja causada pelo aumento de temperatura induzido por NPs no novo meio. Após o tratamento fototérmico, o procedimento de contagem foi então implementado para o ensaio de citotoxicidade e fototérmico nas células.

Resultados

A absorbância óptica e propriedades fototérmicas de nanomateriais de Cs_0.33WO₃ são altamente dependentes de estrutura cristalina, temperatura de pós-recozimento, estequiometria atômica e tamanhos de característica particulada [28, 29].

Para caracterizar a morfologia de superfície do pó µ de Cs_0.33WO₃, imagens de SEM com ampliação de 10.000X foram adquiridas para confirmação visual da estrutura icônica de hexágono colunar indicada por uma seta vermelha na Fig. 2a. Além disso, as imagens de TEM exibem a forma de contorno e tamanhos de característica do grão de pó µ na Fig. 2b onde seu tamanho de característica é de cerca de 1 μm ou menos. A geometria em forma de bastão das NPs e o histograma de distribuição DLS de tamanho de característica nanométrica centrado em torno de 120 nm também foram verificados e são apresentados na Fig. 2c e na imagem de TEM correspondente no inseto. Também, a caracterização cristalina do pó µ e NPs com XRD é apresentada na Fig. 2d. Como pode ser observado no espectro de XRD do pó µ no painel superior, os planos icônicos de cristalização ao longo de (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220), (222), (204), (400) e (224) coincidem bem com o espectro padrão de Cs_0.32WO₃ do cartão No. 83-1334 do Comitê Conjunto sobre Padrões de Difração de Pó (JCPDS). Quando o tamanho de característica do pó µ reduz para 120 nm, as intensidades de todos os picos de difração são reduzidas monotonamente, e alguns picos característicos indicando forte absorção NIR, como planos (102) e (220), são encolhidos invisivelmente no espectro. Da mesma forma, a identificação dos constituintes atômicos, césio (Cs), tungstênio (W) e oxigênio (O), mostrada na Fig. 2e, não só confirma sua presença atômica, mas também autentica a razão de porcentagens atômicas de Cs para W, 0,315, assemelhando-se de perto à estequiometria inicialmente projetada.

Além da caracterização do material, os espectros de absorbância óptica das NPs e a modulação fototérmica temporal em temperatura foram medidos e são apresentados na Fig. 3. Em (a, b), a dependência de absorbância NIR e os perfis de elevação de temperatura induzidos por solução de NPs irradiada por NIR como função de concentração de NPs são representados, onde o gráfico de temperatura temporal de 1 mg/ml, por exemplo, atinge 40 °C, e permanece estável por pelo menos 1 h confirmando a estabilidade e durabilidade fototérmica dos materiais. Da mesma forma, o perfil de temperatura temporal na Fig. 3c ilustra 5 ciclos repetitivos dentro de 190 min, verificando a responsividade fototérmica do material de NPs. Na Fig. 3d, os perfis de temperatura temporal do meio de cultura e meio de cultura incorporado com NPs, retirados da incubadora, colocados na chapa quente e submetidos a irradiação NIR, estabilizam em torno de 37 °C ao longo de 10 min., e a temperatura da solução pura de NPs irradiada por NIR sobe de 24,6 °C até 33,6 °C após 10 min. Com isso, em consideração da funcionalidade fototérmica das NPs, a irradiação NIR para o experimento seguinte foi conduzida por 10 min, 30 min e 60 min, mantendo robustez das NPs durante a sessão experimental e sendo potencialmente aplicável a estudos pré-clínicos.

Subsequentemente, a dose não tóxica de parâmetros experimentais incluindo duração de irradiação NIR e concentração de NPs foi determinada irradiando as células por 1 h e 2 h a 50 mW/cm² e através de interação direta com NPs de 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml e 2 mg/ml em concentração, que são representados na Fig. 4a, b, respectivamente. A taxa de sobrevivência celular permanece bem acima de 95% ao longo de 2 h de irradiação NIR, confirmando não toxicidade das células para exposição de longo prazo ao fóton de 980 nm, e também, a concentração não tóxica de NPs abaixo de 1,5 mg/ml foi determinada.

O propósito de dosar as células cancerígenas a 1,5 mg/ml ou menos, que tem efeito danoso quase nulo às células HepG2, é examinar os efeitos de dose fototérmica nas células cancerígenas sem a implicação da toxicidade inerente das NPs. Para examinar se as NPs irradiadas por NIR podem ser uma solução viável para eliminar células cancerígenas, as células foram incubadas com NPs a 1,5 mg/ml por um dia, e subsequentemente, submetidas à radiação NIR por 1 h. Como pode ser visto nas imagens ópticas de campo claro (BF) da Fig. 5d-f o número de células é claramente reduzido quando o tempo de exposição dura 1 h (e) ou 2 h (f). Quantitativamente, a taxa de sobrevivência diminui monoticamente de 84,2% para 58,4% à medida que a duração de irradiação aumenta de 10 min. a 1 h, e uma linha de tendência linear se ajusta bem entre os pontos de dados dispersos, o que prevê 20% de taxa de sobrevivência quando a irradiação dura 2 h. Além disso, a Fig. 5h indica que para 1 h de irradiação, a taxa de sobrevivência diminui de 73 para 58% à medida que a densidade de potência óptica aumenta de 12,5 a 50 mW/cm², verificando a funcionalidade das NPs irradiadas por NIR como um gatilho fototérmico na destruição de células cancerígenas.

Além disso, a incerteza sobre se tal ação fototérmica ocorreu de maneira intra-celular ou extra-celular foi abordada preparando as fNPs, realizando o mesmo procedimento de lavagem e incubação, e observando qualquer presença intracelular das fNPs. A Figura 6 ilustra imagens confocal BF (b, e) e fluorescência (a, d) e seus compostos sobrepostos (c, f) das células incubadas com e sem as fNPs. Evidentemente, as células sem incubação de fNPs como controle exibem fluorescência verde negligenciável, que é principalmente atribuída à autofluorescência celular, em contraste nítido com o experimental onde a distribuição de fluorescência verde é onipresente dentro de todo citoplasma encontrado na imagem. As intensidades médias de fluorescência nas imagens de controle e amostras experimentais também foram quantificadas e são apresentadas no histograma da Fig. 6g onde a fluorescência de fNPs que passaram por endocitose é pelo menos nove vezes mais forte que o controle.

Discussão

O conceito de hipertermia terapêutica usando ondas eletromagnéticas no cura de doenças cancerígenas remonta ao início dos anos 1900 e teve sucesso em retroceder algumas formas de malignidades, mas no entanto, declinou devido à utilidade de agentes antibacterianos indutores de febre e a falta de acessibilidade precisa a tumor local de interesse in situ [30]. Não até os anos 1980, o interesse foi revivido com vários estudos in vitro que descobriram muitos aspectos de mudanças metabólicas, alteração de microcirculação tumoral e acidólise após tratamento de hipertermia produzindo efeitos letais nas células cancerígenas [31]. Mecanicamente, além de citotoxicidade direta na qual células cancerígenas passam por necrose com apoptose decrescente quando a temperatura aplicada é > 42 °C, a taxa de fluxo sanguíneo reduzida em associação com menor capacidade de resfriamento e pH baixo (< 6,8) tornam as células cancerígenas mais suscetíveis ao aquecimento e consequentemente, uma taxa maior de morte celular [32, 33]. No entanto, clinicamente, devido à desvantagem centenária de localização imprecisa não específica, a hipertermia só encontrou eficácia terapêutica aprimorada quando aplicada concomitantemente com quimio- ou radioterapias [34, 35].

Materiais baseados em NPs que permitem direcionamento e monitoramento precisos, e têm uma ampla gama de propriedades físicas como carga de superfície, fluorescência, conversão fototérmica, encaixam-se perfeitamente no nicho de tal imprecisão na aplicação de hipertermia. No entanto, apesar da utilidade comprovada de muitos materiais de NPs irradiados por NIR em estudos de células cancerígenas, o limite de segurança de foto-exposição muitas vezes não é bem examinado como no caso de NPs de CsWO₃. NPs de CsWO₃, embora, como mostrado na Fig. 4b, tenha citotoxicidade relativamente baixa a 1,5 mg/ml quando comparado a um punhado de materiais de NPs populares, como Ag, Au, grafeno, cujos limiares estão na escala de 1 μg/ml [18, 36, 37], ainda requer 0,7 W/cm² para destruição efetiva de células Hela apesar de sua forte absorção NIR na faixa de comprimento de onda de 800 nm até 2400 nm [15, 25, 26].

Este estudo de pesquisa pretende conceber uma fórmula de dosagem térmica acionada por irradiação NIR, baseada em NPs de Cs_0.33WO₃, para células de câncer HepG2 in vitro como função de concentração de NPs, duração de irradiação e densidade de potência óptica bem dentro do limite de exposição NIR para tecido de pele.

O experimento começa com a síntese das NPs, onde um procedimento sintético passo a passo incluindo reação redox, processo de recozimento e método de moagem úmida é delineado na Fig. 1. A reação redox incorpora grandes elementos ternários, Cs neste caso, em anéis de estrutura octaédrica de WO₆ em um ambiente físico adequado, permitindo formação de estrutura cristalina peculiar e incorporação de elétron livre no composto molecular metálico, que é a razão intrínseca para forte conversão fototérmica sob absorção NIR [26, 27]. Também, os subsequentes processos de recozimento e moagem úmida ajudaram a refinar a formação cristalina e reduzir o tamanho de característica particulada que aprimoram ainda mais a conversão fototérmica NIR. Após isso, a solução de NPs sintetizada prosseguiu com uma série de caracterização física e material que verifica um tamanho médio de característica de 120 nm, uma otimização crítica de absorção NIR, e autentica a composição atômica (Fig. 2). Além disso, a medição correspondente de potencial zeta para 0,5 mg/ml, 1 mg/ml e 1,5 mg/ml são -53,2 mV, -54,3 mV, -60,1 mV. Geralmente, o processo de endocitose é o principal caminho de entrada para a maioria dos tipos de NPs, e a taxa de captação de NPs catiônicas e iônicas para células não fagocíticas é maior que entidades neutras, embora o primeiro tenha desempenho melhor que o último [38]. Também, muitos relatórios anteriores encontraram NPs carregadas negativamente menos tóxicas para células não fagocíticas [39, 40], que é um mérito benéfico quando uma acumulação intracelular excessiva de NPs para dose fototérmica acompanhada de baixa toxicidade é considerada.

Para estabelecer um tom para o ensaio fototérmico sobre as células HepG2, a avaliação da robustez das NPs como aquecedor fototérmico, sua estabilidade de longo prazo em temperatura saturada em equilíbrio com o ambiente ambiente por mais de uma hora e a repetibilidade para 5 ciclos consecutivos dentro de 3 h foram demonstradas (Fig. 3b, c). Também, para quantificar a eficácia da hipertermia das NPs per se na dosagem das células cancerígenas descartando a influência da temperatura ambiente (nominalmente a 25 °C), uma calibração do aparato experimental foi implementada definindo uma chapa quente a 37 °C, sobre a qual todos os ensaios celulares foram realizados, e as características fototérmicas temporais do meio de cultura puro e meio de cultura incorporado com NPs permaneceram a 37,1 °C (Fig. 3d). Posteriormente, a dependência de citotoxicidade na duração de irradiação e concentração de NPs foi examinada separadamente e é apresentada na Fig. 4 indicando menos de 5% de morte celular por mais de 2 h de irradiação NIR e 1,5 mg/ml como ponto crucial em direção à concentração letal. Fixando a concentração de NPs a 1,5 mg/ml, que foi usada durante o resto do ensaio fototérmico, a dose térmica para hipertermia médica foi definida como funções de duração de dosagem variável e densidade de potência óptica. A Figura 5 ilustra a ação de morte celular com baixa (a-c) e alta (d-f) ampliação quando irradiação NIR por 0 h, 1 h e 2 h foi implementada, o número aparentemente reduzido de células reflete bem a análise quantitativa de taxa de sobrevivência celular como mostrado em (g), e a linha de tendência linear prevê 80% de morte celular para 2 h de irradiação. Da mesma forma, a diminuição na taxa de sobrevivência celular sobre a densidade de potência óptica incremental também é demonstrada em (h). Por fim, como claramente representado pelas imagens BF, fluorescência e compostas sobrepostas na Fig. 6, na qual um histograma de análise de fluorescência foi apresentado, a endocitose das fNPs foi verificada.

Conclusão

Em resumo, este estudo apresenta síntese e caracterização de materiais de NPs de Cs_0.33WO₃, examina ensaios de citotoxicidade in vitro da interação direta das NPs, e separadamente, com irradiação NIR, e prova a endocitose das NPs bem como a eficácia das NPs irradiadas por NIR na destruição das células de câncer HepG2. Além disso, este estudo sugere uma dose combinada da solução de NPs de Cs_0.33WO₃ irradiadas por NIR para células de câncer HepG2, 1,5 mg/ml de concentração de NPs, duração de irradiação entre 30 min. a 1 h, e densidades de potência óptica de irradiação NIR sob 50 mW/cm² que está bem abaixo do limite de segurança de exposição NIR para tecido de pele enquanto permite taxa de mortalidade de células cancerígenas próxima a 40% e pode ser potencialmente aplicável ao desenvolvimento de medicina personalizada e amigável ao paciente. Tais estudos em ambiente clínico exigirão medidas adicionais como modificação de superfície com moléculas que reconhecem receptores de superfície de tipos específicos de células cancerígenas.