Entrega de siRNA à base de micela catiônica para terapia gênica eficiente do câncer de cólon

Resumo

A terapia genética baseada em pequenos RNAs de interferência (siRNA) forneceu uma estratégia alternativa para a terapia do câncer. Um dos principais componentes do processo de terapia genética é o sistema de entrega. Como um novo vetor de gene não viral, o DMP, preparado pela modificação da micela mPEG-PCL com lipídeo catiônico DOTAP, foi preparado e aplicado com sucesso no estudo de terapia gênica de câncer de cólon baseado em DNA de plasmídeo. No entanto, seu potencial na entrega de siRNA é desconhecido. Neste estudo, o processo de preparação de DMP foi otimizado e as eficácias anticâncer dos complexos DMP / siMcl1 e DMP / siBcl-xl foram estudadas em um modelo de câncer de cólon de camundongo. Nossos resultados demonstraram que siRNAs entregues por micelas catiônicas DMP podem inibir efetivamente o crescimento de células de câncer de cólon C26 in vitro . Enquanto isso, a administração intratumoral de complexos DMP / siMcl1 e DMP / siBcl-xl suprimiu obviamente o modelo de tumor subcutâneo in vivo. Esses resultados sugerem que o complexo DMP / siRNA é um candidato potencial para a terapia gênica do câncer.

Introdução

O câncer é um importante problema de saúde pública global. O câncer de cólon é um tumor maligno comum, afetando mais de um milhão de pessoas em todo o mundo a cada ano [1]. A terapia gênica tem sido aplicada para servir como um método para o tratamento de tumores sólidos e tumores sanguíneos [2, 3]. A chave para a terapia gênica do câncer depende do sistema de entrega de genes seguro e eficaz [4, 5]. Os vetores não virais, incluindo lipídios catiônicos, nanoemulsões de lipídios, nanopartículas de lipídios sólidos e vetores baseados em polímeros, ganharam mais atenção do que vetores virais por suas vantagens potenciais na entrega de genes:facilmente sendo preparados, causando menos resposta imunológica, possuindo menor toxicidade e melhor biocompatibilidade [6, 7]. A nanotecnologia fornece um novo meio para o estudo de vetores não virais com vantagens, incluindo biocompatibilidade, biodegradabilidade, segurança e capacidade de direcionamento, e assim por diante [2, 8]. Nesse sentido, um grande número de portadores de nanopartículas com alta carga positiva pode se combinar com o fármaco ácido nucléico aniônico por efeito de carga elétrica, apresentando uma ampla e brilhante perspectiva de aplicação em terapia gênica [9, 10].

Como um tipo de copolímero polimérico, possuindo biodegradabilidade e biocompatibilidade, os copolímeros PEG / PCL apresentam aplicações promissoras em sistemas de liberação de fármacos [11,12,13]. Com base em micelas MPEG-PCL, usamos DOTAP anfifílico para modificar o copolímero MPEG-PCL em uma etapa, criando as micelas catiônicas auto-montadas DOTAP e MPEG-PCL híbridas (DMP) [14,15,16,17]. Essas micelas apresentam uma perspectiva promissora na entrega de drogas químicas e drogas gênicas com excelente estabilidade e segurança. Por exemplo, o DMP foi utilizado para entregar o gene suicida survivinT34A e curcumina para terapia de câncer de cólon [14, 18]. No entanto, estudos anteriores limitaram-se à transmissão de DNA de plasmídeo, e não houve relato sobre a entrega de micelas de DMP para outras formas de terapia gênica até o momento, o que limitou a aplicação de micelas de DMP na terapia gênica.

A interferência genética baseada em siRNA também é uma parte essencial da terapia genética, além dos genes terapêuticos do DNA plasmídico. Como um membro essencial do gene-droga, o siRNA é uma pequena molécula de RNA de fita dupla. As drogas anticâncer de siRNA utilizam mecanismos de RNAi endógenos para silenciar a expressão do oncogene. Devido às vantagens significativas, como estabilidade aprimorada e eficácia de silenciamento, o siRNA tem potencial para ser desenvolvido em aplicações terapêuticas contra o câncer [19]. Em comparação com o grande peso molecular do DNA de plasmídeo, o siRNA tem maior eficiência de transfecção, o que é particularmente adequado para o ponto de direcionamento de gene específico na terapia gênica. Portanto, pode ser uma boa escolha para terapia genética. Atualmente, vários medicamentos de tratamento de siRNA baseados em vetores não virais foram testados em ensaios clínicos, como CALAA-01 baseado em nanopartículas de polipolímero de cátion de ciclodextrina e ALN-TTR02 baseado em lipídios [2]. No entanto, a terapia gênica baseada em siRNA ainda é necessária para desenvolver um novo ponto de direcionamento de siRNA e buscar transportadores de entrega de siRNA seguros, eficazes e altamente específicos.

Neste estudo, tentamos usar micelas de DMP para entregar siRNA para estudar a eficiência e segurança das micelas de DMP para entregar siRNA. Utilizamos siRNA Bcl-xl e siRNA Mcl1 como alvo terapêutico, buscando seu efeito antitumoral para o tratamento do câncer de cólon in vitro e in vivo. O gene Bcl-xl e o gene Mcl1 são membros da família Bcl-2 do gene anti-apoptótico e desempenharam um papel vital na inibição da apoptose [20, 21]. Achamos que as micelas sintéticas de DMP podem entregar de forma eficaz e segura siRNA Bcl-xl e siRNA Mcl1. O siRNA de Bcl-xl e o siRNA de Mcl1 podem inibir a expressão do gene Bcl-xl e do gene Mcl1, induzindo a apoptose de células C26 e, em seguida, alcançando um efeito terapêutico de inibição do crescimento de células C26.

Materiais e método

Materiais

N- [1- (2,3-dioleoiloxi) propil] -N, N, N-trimetilamônio metil sulfato (DOTAP) foi adquirido em Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EUA). O copolímero dibloco MPEG-PCL com um peso molecular projetado de 4000 foi sintetizado de acordo com nossos relatórios anteriores [22]. O Mn do copolímero MPEG-PCL foi de 4050. O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e o brometo de 3- (4,5-dimetitiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT) foram obtidos da Sigma-Aldrich (EUA ) e usado sem purificação adicional. Diclorometano e outros solventes orgânicos foram adquiridos de ChengDu Kelang Chemical Co., Ltd. (Chengdu, P. R. China). Células C26 (adenocarcinoma de cólon murino) e células 293 T (HEK 293 T / 17) foram adquiridas na American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, incubando a 37 ° C com 5% de CO ₂ - atmosfera de ar umidificado.

Preparação de micelas DMP

Para selecionar um melhor processo de preparação de DMP, micelas de DMP foram preparadas em três solventes orgânicos, cada solvente com três diferentes dosagens de DOTAP. Em relação ao solvente, foram escolhidos para estudo diclorometano, clorofórmio e acetato de etila, e as dosagens de DOTAP incluíram 5 mg, 10 mg e 20 mg. DOTAP e MPEG-PCL foram co-dissolvidos no solvente orgânico e depois evaporados por uma bomba de vácuo para formar um filme seco. O filme seco foi subsequentemente reidratado em água destilada. Finalmente, as micelas de DMP preparadas foram armazenadas a 4 ° C.

Caracterização de micelas DMP

O tamanho de partícula e o potencial zeta de micelas de DMP foram determinados por um Zeta sizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) e mantidos a 25 ° C durante o processo de medição. Todos os resultados foram a média de três execuções. A estabilidade das micelas de DMP foi avaliada qualitativamente. Os agregados de micelas de DMP foram examinados a olho nu. A presença de precipitação indicou instabilidade de micelas de DMP, enquanto uma solução uniformemente transparente sugere estabilidade.

Retardador de gel

DMP-entregue Scramble siRNA (DMP / Scramble siRNA) foram misturados com 2 μL de tampão de carregamento, carregados em 1% de gel de agarose e separados por eletroforese a 140 V por 10 min. 0,2 μg de siRNA Scramble foi combinado com 1, 2, 3, 4, 5 e 6 μg de micelas de DMP. O gel foi corado com o visualizador de ouro e as bandas correspondentes ao siRNA Scramble foram visualizadas sob luz ultravioleta.

Citotoxicidade de micelas DMP

A citotoxicidade de micelas de DMP nas células 293 T e células C26 foi avaliada pelo método MTT. Resumidamente, células 293T e células C26 foram semeadas a uma densidade de 1,2 × 10 ³ células por poço em 100 μL de meio DMEM contendo 10% de FBS (soro fetal bovino) em placa de 96 poços e cultivadas por 24 h. As células foram então expostas a uma série de micelas de DMP ou PEI25K em diferentes concentrações por 72 horas. A viabilidade das células foi medida usando um ensaio MTT. Os resultados foram a média de seis execuções de teste.

Transfecção in vitro

Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células C26 foram semeadas em uma placa de 24 poços a uma densidade de 5 × 10 ⁴ células por poço em 0,5 mL de meio DMEM contendo 10% de FBS (soro fetal bovino). No momento da transfecção, o meio em cada poço foi substituído por 0,5 mL de meio contendo 0%, 10%, 20% e 30% de FBS e FAM entregue por DMP (Carboxifluoresceína) siRNA (DMP / FAM siRNA) e PEI- siRNA de FAM entregue (siRNA de PEI / FAM) contendo 1 μg de siRNA em meio sem soro foram pipetados para cada poço, e a razão de massa de siRNA de DMP / FAM e siRNA de PEI25K / FAM foi de 30:1 e 2:1. Vinte e quatro horas depois, as células transferidas foram observadas ao microscópio e a atividade da luciferase foi medida por citometria de fluxo (Epics Elite ESP, EUA)

In vivo silenciamento de genes

siRNA direcionado a camundongo Bcl-xl, Mcl1-1, Scramble siRNA e siRNA de controle negativo marcado com FAM foram adquiridos de GenePharma Co., Ltd (Shanghai, P. R. China) na forma desprotegida, dessalinizada, anelada.

Para determinar o nível de mRNA de Bcl-xl, o RNA total foi extraído de células C26 usando TRIzol ™ Reagent (Thermo Fisher Scientific, EUA), e cDNAs individuais foram sintetizados com um ensaio de transcriptase reversa SuperScript II (Invitrogen). A PCR quantitativa em tempo real foi realizada com um kit SYBR GreenER PCR quantitativo SuperMix Universal (Invitrogen). Os primers de PCR foram sintetizados por TSINGKE Biological Technology (Chengdu, P. R. China).

Estudo de anti-proliferação

As habilidades anti-proliferação de células DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 para C26 foram avaliadas pelo método MTT. Resumidamente, as células C26 foram semeadas a uma densidade de 1,2 × 10 ³ células por poço em 100 μL de DMEM contendo 10% de FBS em placas de 96 poços e cultivadas por 24 h. As células foram então expostas a uma série de DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 em diferentes concentrações por 72 h. A viabilidade das células foi medida pelo método MTT. Os resultados foram a média de seis execuções de teste.

Estudo de formação de clones

As células C26 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 10 ³ células por poço em 2 mL de meio DMEM contendo 10% de FBS. Vinte e quatro horas depois, as células foram então expostas a uma série de micelas de DMP ou DMP / SiRNA Scramble e DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 em diferentes concentrações. Quando as células crescem para um clone visível a olho nu, a cultura foi encerrada e seguida por enxágue, fixação e tingimento. O número de clones foi contado diretamente e a taxa de inibição calculada.

In vitro estudo de apoptose

A apoptose celular foi observada através da coloração com isotiocianato de fluoresceína V-Anexina (FITC) e iodeto de propídio. Resumidamente, as células C26 foram semeadas em placas de seis poços e expostas a uma série de micelas de DMP, DMP / SiRNA Scramble, DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 por 72 horas. As células foram então submetidas a Anexina V-FITC e coloração com iodeto de propídio.

Estudo de xenoenxerto de tumor in vivo

Camundongos BALB / c de 6 a 8 semanas de idade foram inoculados com 5 × 10 ⁶ Células C26 no flanco direito. Complexos DMP / siRNA equivalentes a 10 μg de siRNA foram injetados intratumoralmente a cada dois dias por 5 tratamentos, uma vez que o volume do tumor atingiu 100 mm ³ . Os camundongos que receberam uma quantidade equivalente de solução salina normal ou DMP foram considerados como grupo de controle. O tamanho do tumor foi medido e o peso do animal monitorado a cada 2 dias até que todos os animais fossem sacrificados. O volume do tumor foi calculado como (1/2 × comprimento × largura [2]).

Análise histológica

Os tecidos excisados foram fixados em solução de formalina tamponada neutra a 4% por mais de 24 horas e incluídos em parafina. Seções dos tecidos (3–5 μm) foram coradas com hematoxilina e eosina. Esta análise foi realizada seguindo o protocolo do fabricante, e as amostras foram examinadas com um microscópio de fluorescência (400 ×).

Um kit TUNEL disponível comercialmente (Promega, Madison, WI) foi usado para analisar os efeitos apoptóticos em tecidos tumorais de xenoenxerto de melanoma de camundongo C26. Esta análise foi realizada seguindo o protocolo do fabricante.

Análise estatística

Os dados foram expressos como valor médio ± DP. A análise estatística foi realizada com análise de variância unilateral (ANOVA) usando o software SPSS. Para todos os resultados, P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Estudo do processo de preparação

Para obter eficiência de transfecção efetiva e baixa citotoxicidade para entrega de siRNA, estudamos diferentes processos de preparação para micelas de DMP, conforme mostrado na Tabela 1. Em nosso estudo, em relação aos solventes, as micelas de DMP preparadas por acetato de etila eram muito instáveis, e o tempo estável das micelas de DMP não foi mais do que 10 min. E as micelas de DMP preparadas por diclorometano e clorofórmio apresentaram excelente estabilidade, podendo permanecer estáveis por 96 horas, exceto DMP preparada por clorofórmio na dosagem de 20 mg de DOTAP. Mais importante, eles também tinham o tamanho certo, potencial zeta e PDI. No entanto, comparando a eficiência de transfecção inicial, a eficiência de transfecção de micelas de DMP preparadas por diclorometano foi maior do que a de micelas de DMP preparadas por clorofórmio. Então, selecionamos diclorometano para preparar micelas DMP.

As micelas de DMP preparadas por três dosagens de DOTAP não apresentaram diferenças aparentes no tamanho, potencial zeta e PDI, mas as micelas de DMP preparadas com uma dosagem de 20 mg de DOTAP tiveram a maior eficiência de transfecção em três dosagens de DOTAP. Por meio das comparações acima, selecionamos um processo de preparação baseado em DOTAP e MPEG-PCL (Fig. 1a) para preparar micelas de DMP com excelente estabilidade e alta eficiência de transfecção. O esquema de preparação de micelas de DMP é apresentado na Fig. 1b.

a Estrutura molecular de DOTAP e MPEG-PCL. b Esquema de preparação de micelas de DMP. c Espectro de distribuição de tamanho de micelas DMP. d espectro de potencial zeta de micelas de DMP. e ensaio de retardamento de siRNA. f Citotoxicidade de micelas de DMP em células 293T. g citotoxicidade de micelas DMP em células C26

Caracterização de micelas DMP

Conforme apresentado na Fig. 1c, o espectro de distribuição de tamanho de partícula indicou que as micelas DMP foram nanométricas (PDI =0,315) com um tamanho médio de partícula de 144,8 nm, sugerindo que ele tinha uma distribuição de tamanho de partícula muito estreita. O espectro de potencial zeta de DMP foi apresentado na Fig. 1d com um potencial zeta de 46,4 mV. A estabilidade das micelas de DMP foi avaliada qualitativamente.

Para avaliar a capacidade de ligação de DMP com siRNA, um ensaio de retardamento em gel foi realizado e os resultados foram mostrados na Fig. 1e. Quando a proporção de massa de DMP para siRNA era ≥ 30, o retardo completo do siRNA Scramble foi alcançado. O siRNA aniônico Scramble foi absorvido na superfície do DMP devido à interação eletrostática, formando um complexo DMP / siRNA.

A citotoxicidade de micelas de DMP em células C26 e células 293T foi avaliada pelo método MTT. Como mostrado na Fig. 1f e g, PEI25K mostrou alta toxicidade em células 293T, com IC ₅₀ 0,83 μg / mL. As micelas DMP, no entanto, eram muito menos tóxicas, e o IC ₅₀ de DMP foi 3,7 μg / mL. O IC ₅₀ de micelas de DMP foi de 0,497 mg / mL em células C26. No entanto, PEI25K mostrou tremenda toxicidade, com IC ₅₀ <0,1 μg. Assim, as micelas de DMP tiveram menor citotoxicidade do que PEI25K e podem ser usadas para entregar siRNA às células C26 com segurança.

In vitro transfecção

Além da caracterização biofísica, comparamos a eficiência de transfecção de micelas de DMP com a de PEI25K (agente de transfecção "padrão ouro") in vitro . Como mostrado na Fig. 2, em meio contendo 0%, 10%, 20% e 30% de transfecção de FBS, as micelas de DMP tiveram uma eficiência de transfecção de 85,47 ± 1,01%, 81,57 ± 2,04%, 75,29 ± 1,20% e 71,64 ± 1,59%, e o PEI teve uma eficácia de transfecção de 86,38 ± 2,92%. Houve pouca diferença na eficiência de transfecção entre o grupo com soro e o grupo sem soro. E as eficiências de transfecção do grupo de soro e do grupo sem soro foram semelhantes à eficiência de transfecção de PEI. Além disso, as imagens na Fig. 2a apresentam uma observação direta da capacidade de transfecção de micelas de DMP com um gene repórter baseado em FAM. A partir da foto, a morfologia da adega do grupo PEI mudou em comparação com os grupos DMP, o que provou que PEI tinha alta citotoxicidade, enquanto as micelas DMP tinham baixa citotoxicidade.

Eficiência de transfecção de micelas DMP. a Imagem de células C26 transfectadas ( b , c ) eficiência de transfecção de micelas de DMP em meio contendo 0%, 10%, 20% e 30% de FBS e PEI25K, contada por citometria de fluxo

Atividade anticâncer in vitro

No processo de terapia genética, o siRNA desempenha um papel vital. Portanto, projetamos um siRNA direcionado a Bcl-xl e um siRNA direcionado a Mcl1 para estudar sua atividade anticâncer. Para avaliar a capacidade de interferência de siRNA de Bcl-xl e siRNA de Mcl1, confirmamos a capacidade de interferência de siRNA de Bcl-xl e siRNA de Mcl1 por qPCR. De acordo com nossos resultados (Fig. 3), o nível de mRNA do grupo DMP / siMcl1 foi inferior ao dos grupos de controle (Fig. 3a). E o nível de mRNA dos grupos DMP / siBcl-xl foi menor do que o dos grupos de controle (Fig. 3b). Foi bem demonstrado que DMP / siBcl-xl e DMP / siMCL1 reduziram de forma eficiente o nível de mRNA relevante.

a Nível de mRNA de Bcl-xl obviamente reduzido por DMP / siMcl1. b Nível de mRNA de Mcl1 obviamente reduzido por DMP / siBcl-xl. c Imagens da formação do clone após o tratamento com DMP / siBcl-xl ou DMP / siMcl1 em diferentes concentrações. d O número de clones após tratamento com DMP / siBcl-xl de diferentes concentrações de siRNA. e Capacidade anticâncer de DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 com concentração de 50-nM e 100-nM de siRNA em células C26 in vitro. f A taxa de inibição da formação de clones após o tratamento com DMP / siMcl1 de diferentes concentrações de siMcl1. g a taxa de inibição da formação de clones após o tratamento com DMP / siBcl-xl de diferentes concentrações de siBcl-xl

Além disso, micelas de DMP foram usadas para entregar siRNA em células C26 para estudar que DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 podem inibir o crescimento de células C26. A viabilidade das células C26 foi determinada pelo método MTT. Os resultados mostraram que as taxas de sobrevivência celular de DMP / siBcl-xl (50 nM e 100 nM) foram 69,6% ± 3,3% e 56,3% ± 1,9%, e as taxas de sobrevivência celular de DMP / siMcl1 (50 nM e 100 nM) foram 82,8 % ± 3,1% e 56,3% ± 3,2% (Fig. 3e).

Para estudar mais sobre a atividade anticâncer de DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1, o ensaio de formação de clones foi realizado. Obviamente, foi mostrado que na Fig. 3c e d, em comparação com o grupo de controle, o número de clones em DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 (50 nM e 100 nM) era menor. Estes resultados sugeriram que DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 tiveram um efeito antiproliferação óbvio nas células C26. Assim, combinando os resultados do ensaio de MTT, os resultados demonstraram que DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 podem inibir a proliferação de células C26 e ter uma atividade anticâncer proeminente nas células C26.

Para determinar se a perda de capacidade de proliferação induzida por DMP / siBcl-xl- e DMP / siMcl1 e a viabilidade celular de micelas de DMP estavam associadas à indução de apoptose, os números de células apoptóticas foram avaliados por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Fig. 3f, as taxas de apoptose do grupo DMP / siMcl1 foram 37,9% ± 4,7%, o que foi maior do que o grupo controle e grupo DMP e grupo DMP / Scramble siRNA. Conforme mostrado na Fig. 3g, a taxa de apoptose do grupo DMP / siBcl-xl foi de 33,0% ± 3,8%, que também foi maior do que a dos outros grupos controle. Estes dados de apoptose indicaram que DMP / siMcl1 e DMP / siBcl-xl tinham uma forte capacidade de indução de apoptose. Os resultados do ensaio de apoptose foram consistentes com os resultados do MTT e os resultados da formação de clones descritos anteriormente, sugerindo que a indução da apoptose é um possível mecanismo para inibir a proliferação e viabilidade das células C26.

O complexo DMP / siRNA inibe o crescimento do tumor C26 in vivo

Um modelo animal de xenoenxerto C26 também foi utilizado para testar a eficácia antitumoral do complexo DMP / siRNA in vivo. As curvas de crescimento tumoral e imagens de tumores de xenoenxerto C26 de cada grupo são apresentadas nas Fig. 4a e b. De acordo com nossos resultados, a injeção intratumoral de DMP / siMcl1 e DMP / siBcl-xl resultou em uma inibição significativa do crescimento do tumor do xenoenxerto em comparação com os grupos de controle. O peso dos tumores em cada grupo é apresentado na Fig. 4b. Comparando com o grupo de tratamento NS (0,85 ± 0,09 g) e o grupo DMP (0,76 ± 0,11 g), o complexo DMP / siMcl1 causou uma redução estatisticamente significativa no peso do tumor (0,34 ± 0,06 g, P <0,01) e, entretanto, o complexo DMP / siBcl-xl causou uma redução estatisticamente significativa no peso do tumor (0,42 ± 0,08 g, P <0,01). Estes resultados sugerem que a injeção intratumoral do complexo DMP / siRNA poderia inibir eficientemente o crescimento do xenoenxerto subcutâneo do modelo de câncer de cólon C26. Os efeitos colaterais in vivo do complexo DMP / siRNA em outros órgãos foram examinados por meio de análise HE. Conforme mostrado na Fig. 4, não foram observadas alterações patológicas significativas no coração, fígado, baço, pulmão ou rim.

Efeitos anticâncer e segurança de DMP / siRNA no modelo de xenoenxerto de camundongo C26. a Curva de desenvolvimento do tumor, calculada pelo volume do tumor. b Peso médio dos tumores em cada grupo. Em comparação com outros grupos de tratamento, o grupo DMP / siMcl1 e o grupo DMP / siBcl-xl alcançaram uma redução estatisticamente significativa no peso do tumor (*** P , 0,001). c Imagens representativas de tumores de carcinoma de cólon C26. d Apoptose em tecidos tumorais detectada pelo ensaio TUNEL. e Análise HE dos órgãos principais de cada grupo de tratamento em ambos os modelos. Nenhuma alteração patológica significativa foi observada no coração, fígado, baço, pulmão ou rim

Discussão

Neste estudo, micelas híbridas de DOTAP e MPEG-PCL auto-montadas catiônicas foram preparadas para entregar siRNA Bcl-xl e siRNA Mcl1 para o tratamento de câncer de cólon C26. Estas micelas de DMP tiveram excelente estabilidade e foram capazes de combinar e transmitir eficazmente Bcl-xl siRNA e Mcl1 siRNA para células C26. Mais importante, micelas de DMP sem precedentes entregaram siRNA (Bcl-xl siRNA e Mcl1 siRNA) e poderiam induzir efetivamente a apoptose de células C26, resultando na inibição do crescimento de células C26 in vitro e in vivo com alta segurança. Coletivamente, nosso estudo sugeriu que o DMP é um portador potencial de entrega de genes para siRNA.

Há relatos de que o lipídio catiônico DOTAP tem sido amplamente aplicado para entrega de siRNA, mas gera fortes cargas positivas que desencadeiam a hemólise e tem alta citotoxicidade. Com base em lipossomas catiônicos DOTAP com alta eficiência de transfecção, mas suas cargas positivas produziriam toxicidade, a razão pode ser que a cabeça de sal de amônio quaternário de DMP com cargas positivas foi exposta na superfície da bicamada fosfolipídica do lipossoma. No entanto, as micelas de DMP com base no lipídio DOTAP apresentaram alta transfecção e baixa citotoxicidade. Especulamos que no processo de automontagem de micelas, DOTAP foi incorporado às nanopartículas de polímero, cuja cabeça de sal de amônio quaternário não foi completamente exposta na superfície. Assim, as cargas positivas parciais foram mascaradas; entretanto, nossos resultados também mostram que a eficiência de transfecção de micelas de DMP não foi baixa em comparação com a eficiência de transfecção de PEI25K. Isso sugeriu que as cargas positivas do DOTAP após serem cobertas ainda estavam parcialmente expostas, apresentando potencial adequado, e esse nível de potencial se mostrou suficiente para combinar e transmitir o siRNA. Além disso, nossos resultados indicaram que micelas de DMP baseadas em MPEG-PCL é um portador de entrega de genes eficaz e seguro, que foi otimizado para a citotoxicidade de DOTAP e retém a capacidade de transmissão de genes de DOTAP. E um estudo semelhante relatou que a citotoxicidade do DOTAP foi reduzida após ser combinado com outros materiais [23]. Recentemente, um novo vetor que consiste em DOTAP e SWNT teve menor citotoxicidade na entrega de siRNA em comparação com a lipofectamina [8]. LPNs que são preparados micelas DOTAP-PLGA usando um método de evaporação de solvente em emulsão dupla (DESE) resultaram em nano-portadores de tamanho [24,25,26]. Esses estudos concordam bem com o descrito em nossa pesquisa e tornam nossa conjectura mais convincente até certo ponto.

A eficiência de entrega do vetor de transferência de genes é altamente influenciada pelo soro. As proteínas séricas no soro poderiam neutralizar as cargas positivas na superfície dos complexos nanocarrier / siRNA, que eram afetadas pelos efeitos eletrostáticos na superfície das células com cargas negativas [27,28,29].

Em nosso estudo, quando estudamos a eficiência de transfecção de micelas de DMP, montamos uma série de meio DMEM contendo 0%, 10%, 20% e 30% de FBS para transfecção, investigando o efeito do soro na eficiência de transfecção de Nanopartículas de siRNA de FAM. Nossos resultados mostraram que a presença de FBS teve pouco impacto na eficiência de transfecção. Neste artigo, usamos MPEG-PCL para cobrir o DOTAP, e o DOTAP foi embutido no MP com algumas partes deixadas na superfície em uma proporção adequada. Com base nessa estrutura, especulamos que as cargas positivas do DOTAP estavam parcialmente ocultas devido à cobertura do MPEG-PCL, que diminuía o nível de exposição às proteínas séricas, evitando assim o efeito do soro na transfecção. Isso implicava que, além das cargas superficiais reduzidas de transportadores catiônicos após a modificação, a presença de transfecção de soro teve pouco efeito na eficiência do transportador de polímero catiônico. Devido à excelente capacidade de transfecção em ambiente de soro demonstrada por micelas de DMP in vitro, sugeriu que o soro tinha pouca afeição para o experimento de células in vitro de entrega de siRNA mediada por DMP.

Conclusão

Neste estudo, as micelas DMP preparadas tinham a capacidade de entregar siRNA. E micelas de DMP foram usadas para entregar Bcl-xl siRNA e Mcl1 siRNA em células C26 para estudo de atividade anticâncer in vitro. Nós investigamos o processo de preparação para micelas de DMP e selecionamos um excelente processo de preparação para preparar micelas de DMP com tamanho estreito, bom potencial zeta e excelente estabilidade. Além disso, as micelas de DMP preparadas não foram afetadas pela presença de experimento de transfecção in vitro de soro. Mais importante ainda, DMP / siBcl-xl e DMP / siMcl1 podem inibir a expressão do gene Bcl-xl e do gene Mcl1, induzindo a apoptose de células C26 e, em seguida, alcançando um efeito terapêutico de inibição do crescimento de células C26. A injeção intratumoral do complexo DMP / siRNA pode inibir de forma eficiente o crescimento do xenoenxerto subcutâneo do modelo de câncer de cólon C26. Não foram observadas alterações patológicas significativas no coração, fígado, baço, pulmão ou rim. Acredita-se que as micelas de DMP podem ser consideradas como um transportador eficaz para entregar siRNA para o tratamento do câncer de cólon.

Abreviações

DOTAP:: N- [1- (2, 3-dioleoiloxi) propil] -N, N, N-trimetilamônio metil sulfato
mPEG-PCL:: Metoxipoli (etilenoglicol) Poli (caprolactona)
MTT:: Brometo de 3- (4, 5-dimetitiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio
siRNA:: RNA de interferência pequeno

Impedância de Superfície de Metasurfaces / Estruturas Híbridas de Grafeno Propriedades eletrônicas e magnéticas de WSe2 de monocamada defeituosa com vagas

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias