Nanocarregadores Inovadores de Nucleosídeo-Lipídio Melhoram a Entrega de Sorafenib e Reduzem Toxicidade

Resumo

Embora a aplicação de sorafenib, um inibidor de quinases proteicas de tirosina, em tratamentos de câncer continue sendo uma opção mundial em quimioterapia, novas estratégias são necessárias para abordar os problemas de baixa solubilidade em água (< 5 μM), toxicidade e efeitos colaterais desta droga. Neste contexto, o uso de nanocarregadores é investigado para superar essas desvantagens. Neste trabalho, relatamos um novo tipo de nanopartículas baseadas em sorafenib estabilizadas por nucleosídeo-lipídios híbridos. Nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) mostraram valores de potencial zeta negativos ou positivos dependendo da carga do nucleosídeo-lipídio. Microscopia eletrônica de transmissão de SLNs carregadas com sorafenib revelou nanopartículas paralelepípedas de cerca de 200 nm. Estudos biológicos em quatro linhagens celulares diferentes, incluindo cânceres de fígado e mama, revelaram atividades anticâncer aprimoradas de SLNs baseadas em sorafenib comparadas à droga livre. Importante, imagens de microscopia de fase de contraste registradas após incubação de células cancerígenas na presença de SLNs em alta concentração de sorafenib (> 80 μM) revelaram morte total de células cancerígenas em todos os casos. Estes resultados destacam o potencial de SLNs baseadas em nucleosídeo-lipídio como sistemas de entrega de fármacos.

Introdução

Sorafenib comercializado como Nexavar™ é um inibidor de quinase hidrofóbico aprovado para tratamento de diferentes cânceres humanos, incluindo carcinoma de células renais avançado (RCC), carcinoma hepatocelular (HCC) e carcinoma tireoidiano avançado. O sorafenib tem múltiplos alvos de quinase proteica conhecidos, incluindo receptores transmembrana e quinases intracelulares de tirosina e serina-treonina, e também induz apoptose. Em termos de mecanismo de ação, o sorafenib inibe crescimento tumoral via múltiplos alvos, atuando diretamente no tumor e/ou na angiogênese tumoral (através da inibição de sinalização VEGFR e PDGFR). Sua eficácia na inibição de crescimento de células malignas foi demonstrada em muitos tipos histológicos de câncer. No entanto, a baixa solubilidade em água, toxicidade e efeitos colaterais limitam o uso do sorafenib em muitas aplicações clínicas. Para abordar essas questões, várias formulações de sorafenib estão sob investigação, incluindo nanopartículas cristalinas líquidas, nanoemulsão, nanopartículas de silício poroso modificadas com ciclodextrina, nanocompósitos eluidores de droga, nanopartículas baseadas em polieletrólito ou nanopartículas auto-montadas de curcumina. No entanto, nanopartículas lipídicas (LNs) carregadas com sorafenib foram pouco investigadas.

Aqui, relatamos o primeiro exemplo de nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) baseadas em sorafenib estabilizadas por nucleosídeo-lipídios. Estudos cromatográficos em nucleolipídeos carregados positiva e negativamente (DOTAU e diC₁₆dT, respectivamente) indicam que esses anfifílicos possuem a estabilidade e pureza necessárias para uso em aplicações de entrega de fármacos. Um simples procedimento de nanoprecipitação permite a formação de SLNs com cargas positivas (SLN⁺) ou negativas (SLN⁻). Vale notar que todas as SLNs investigadas aumentaram o efeito citotóxico do sorafenib em diferentes carcinomas humanos, demonstrando que SLNs podem superar as limitações do sorafenib em termos de solubilidade aquosa e atividades anticâncer.

Métodos

Químicos e Reagentes

Metanol (MeOH), ácido fórmico (FA) e formiato de amônio (AFNH₄) foram comprados da VWR Chemicals (França) e eram todos de grau HPLC. Água de grau HPLC (resistividade mínima 18,2 MΩ) foi produzida internamente por sistema ELGA Millipore (França). DOTAU (Número CAS: 868226-06-6) e diC₁₆dT (Número CAS: 1160002-70-9) foram sintetizados no laboratório segundo protocolo relatado nas Referências. Sorafenib foi comprado da SynVec.

Estudos Cromatográficos

Um método UHPLC de fase reversa foi desenvolvido para quantificação de nucleolipídeo (DOTAU e diC₁₆dT) e sorafenib em SLNs. Antes da injeção no HPLC, soluções aquosas de nanopartículas foram diluídas com etanol por fatores 5 e 10, para quantificar nucleolipídeos e Sorafenib, respectivamente. O sistema cromatográfico UHPLC UltiMate 3000 da Dionex-Thermo Scientific (EUA) foi usado. A separação foi realizada com coluna Syncronis C18 50 × 2,1 mm, 1,7 μm. A fase móvel consistiu em 70/30 MeOH/acetato de amônio 25 mM (pH = 7,4) (A) e acetato de amônio 26,5 mM em MeOH (pH = 7,9) (B). Taxa de fluxo de 0,2 mL/min, gradiente 0–2 min 0–100% B; 2–20 min 100% B. Temperatura da coluna 25 °C. Detecção a 267 nm para sorafenib e diC₁₆dT e 257 nm para DOTAU. Volume injetado 1 μL, limites de quantificação 0,6 ng para sorafenib e 15 ng para ambos nucleolipídeos.

Preparação de Nanopartículas de Sorafenib

Dez miligramas de sorafenib foram dissolvidos em 1 mL de etanol, e 10 mg de NLs (diC₁₆dT ou DOTAU) solubilizados em 1 mL de etanol. Cem microlitros de NLs, 100 μL de soluções de sorafenib e 800 μL de etanol foram misturados à temperatura ambiente e adicionados gota a gota em 10 mL de água destilada sob agitação magnética. A solução foi colocada em banho ultrassônico por 90 min a 25 °C. Etanol removido sob vácuo a 30 °C, volume ajustado a 1 mL. Esta solução foi sonicada duas vezes usando sonda ultrassônica de 6 mm por 10 min a 100% de amplitude com pulso de 2 seg a cada 5 seg. Um mililitro foi dialisado contra 30 mL de água destilada por 3 × 15 min. Volume ajustado a 2 mL e conservado para caracterização, quantificação e estudos de estabilidade. Experimentos controle foram realizados com mesmo protocolo na ausência de nucleolipídeos.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM e EDX)

Nanopartículas visualizadas por microscopia de coloração negativa. Dez microlitros de nanopartículas transferidos para grade de cobre revestida de carbono por 10 min. Amostra seca e corada com 2,5% (p/p) de acetato de uranila em água por 2 min. Espécimes observados com microscópio eletrônico Hitachi H 7650. Espectroscopia de raios X dispersiva em energia realizada usando microscópio eletrônico de transmissão TECNAI acoplado com Quantax-X-Flash SVE 6.

Determinação de Tamanho de Partícula e Zeta

Zeta e tamanho de partícula determinados usando Zetasizer NanoZS, Malvern. Experimentos com 40 μL de nanopartículas diluídas em 400 μL de água, medições a 25 °C.

Análise Citotóxica

HuH7 e HepG2 cultivadas em monocamada em DMEM-Glutamax suplementado com 10% soro fetal bovino. MDA-MB-134 e T-47D cultivadas em RPMI suplementado com 10% soro fetal bovino. 10⁴ células/poço em 90 μL de meio completo foram semeadas em placa de 96 poços e incubadas por 24 h a 37 °C e 5% CO₂, antes de adicionar 10 μL de SLN ou sorafenib no meio de cultura. Sorafenib dissolvido em meio de cultura com 0,1% DMSO. Nota: nestas condições, concentração máxima de sorafenib sem precipitação foi 5 μM, enquanto para SLNs carregadas com sorafenib, concentração máxima testada foi 120 μM sem DMSO. Após 4 dias de incubação, viabilidade celular avaliada com ensaio de proliferação baseado em formazan (kit CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega), adicionando 20 μL/poço de solução de reagente. Após incubação de 30 min a 37 °C, 5% CO₂, absorbância de cada poço medida a 492 nm usando espectrofotômetro Berthold. Resultados expressos como porcentagem de (OD₄₉₂ células tratadas - OD₄₉₂ branco) / (OD₄₉₂ células não tratadas - OD₄₉₂ branco).

Estudos de Viabilidade Celular

HuH7 cultivadas como descrito. Viabilidade celular realizada após 4 dias de incubação com SLN⁺ carregado com sorafenib em diferentes concentrações (0, 1, 5, 10, 25, 50, 100 μM) usando ensaio de viabilidade live/dead (Invitrogen). Brevemente, meio de cultura removido, células aderentes lavadas com HBSS. 200 μL de HBSS contendo 2 μM calceína acetoximetil éster e 4 μM homodímero de etídio-1 adicionados a cada poço e incubados por 45 min a 37 °C, 5% CO₂. Após coloração, células lavadas com HBSS e imageadas microscopicamente em microscópio de fluorescência invertido. Porcentagem de células mortas avaliada por análise de citometria de fluxo ativada por fluorescência (FACS). Após coloração com 4 μM de solução de homodímero de etídio-1, células tratadas com tripsina e lavadas duas vezes com PBS por centrifugação a 1000 rpm por 5 min. Dados adquiridos em citômetro de fluxo LSRFortessa da Becton Dickinson, resultados analisados usando software DIVA. Amostra de células mortas preparada com 70% metanol usada como controle.

Resultados e Discussão

Síntese e Caracterização de SLNs

A não toxicidade e propriedades de auto-montagem dos nucleolipídeos os tornam adjuvantes anfifílicos ideais para encapsular drogas hidrofóbicas como sorafenib. Neste estudo, um simples procedimento de nanoprecipitação foi desenvolvido para abordar a baixa solubilidade em água do sorafenib e aumentar sua atividade anticâncer, que em muitos casos limita seu uso clínico. Quanto à solubilidade em água, hipotetizou-se que o caráter hidrofóbico, heterociclos e funções de ligação de hidrogênio do sorafenib favoreceriam interações com nucleolipídeos e formação de nanoobjetos. Também esperava-se que SLNs carregadas com sorafenib aumentassem atividades antitumorais aumentando captação celular de sorafenib. De fato, em estudo anterior nosso em nanopartículas de cisplatina, demonstramos que o aumento de atividades antitumorais do cisplatina foi devido a maior quantidade de droga internalizada em células cancerígenas.

Estudos Cromatográficos

Para avaliar capacidades de carga de fármaco das novas formulações, método UHPLC de fase reversa foi desenvolvido. Usando este método HPLC, a separação simultânea de sorafenib e nucleolipídeos foi alcançada em 12 min, permitindo quantização individual de compostos em SLNs. Razões de carga (razões de massa de sorafenib/nucleolipídeos em nanopartículas) de 50 e 80% e rendimentos de encapsulação de sorafenib em torno de 55 e 75% foram obtidos para formulações compostas de sorafenib/DOTAU (SLN⁺) e sorafenib/diC₁₆dT (SLN⁻), respectivamente. Durante experimento controle na ausência de nucleolipídeo, cerca de 90% do sorafenib foi perdido durante as diferentes etapas da formulação provavelmente devido à baixa solubilidade do sorafenib em água. Este resultado demonstra que nucleolipídeos são necessários para solubilizar sorafenib e estabilizar SLNs.

Estudos Físico-Químicos

Experimentos de espalhamento dinâmico de luz (DLS) caracterizaram formação de SLNs. Ambos nucleolipídeos negativos e positivos (diC₁₆dT e DOTAU) formam nanopartículas não esféricas similares com formas paralelepípedas em solução aquosa com monodispersidade (índice de polidispersidade PDI = 0,202 e 0,289; tamanho = 335,2 e 304,4 nm, respectivamente). Como esperado, potenciais zeta de objetos baseados em SLN dependem das cabeças polares do nucleolipídeo (ζ = +59,1 e −54,9 mV para SLN⁺ e SLN⁻). A presença de sorafenib na NP foi validada por imagem TEM e aquisições EDX de SLN⁻. Imagens TEM mostram morfologia paralelepípeda. Importante, em experimentos controle, a nanoprecipitação de sorafenib na ausência de nucleolipídeo não gerou nenhum nanoobjeto, demonstrando que nucleolipídeos permitem formação e estabilização das SLNs.

Estudos de Estabilidade

Estabilidades coloidais de SLN⁺ e SLN⁻ medidas por DLS e potencial zeta a duas temperaturas. No caso de formulações baseadas em diC₁₆dT, tamanho de SLN⁻ não foi modificado após 30 dias a 4 e 37 °C, indicando alta estabilidade. Tal estabilidade pode ser explicada pela natureza das interações (envolvendo ligações H, empilhamento π-π, interação carga/carga) entre diC₁₆dT e sorafenib. Porém, para formulações baseadas em DOTAU, SLN⁺ foram estáveis apenas a 4 °C por 30 dias conforme estudos DLS, enquanto a 37 °C observou-se aumento de tamanho e PDI. Esta instabilidade relativa a 37 °C no caso de SLN⁺ pode ser explicada por interações coulômbicas repulsivas entre cargas positivas de ambos sorafenib e DOTAU. Curiosamente, estudos de estabilidade coloidal indicam que é possível modular a estabilidade, e portanto a entrega de sorafenib das SLNs ao ambiente fisiológico, dependendo do nucleolipídeo usado. A modulação de estabilidade pode ser atraente dependendo da cinética de liberação necessária.

Em paralelo à estabilidade coloidal, a estabilidade química de sorafenib, DOTAU e diC₁₆dT nas formulações baseadas em SLN foi investigada como função do tempo a 4 e 37 °C usando novo método cromatográfico. Estudos cinéticos em ambas temperaturas mostram que sorafenib e diC₁₆dT permanecem estáveis por pelo menos 1 mês, indicando estabilidade química a longo prazo em ambas temperaturas no caso de SLN⁻. Porém, diminuição de DOTAU durante o tempo foi observada nas formulações SLN⁺. A 4 °C, perdas de ~12% em 7 dias e 20% em 30 dias. Ao aumentar temperatura, estabilidade de DOTAU diminuiu com perda de 55% em 7 dias e até 95% em 30 dias a 37 °C. Diferenças em estabilidade química entre nucleolipídeos já evidenciadas em estudos de estabilidade anteriores.

Estudos Biológicos

Citotoxicidade de SLN avaliada por atividades metabólicas e morfologias celulares. Ensaio MTT permitiu comparar sorafenib livre (em 0,1% DMSO) e SLNs carregadas com a droga em quatro linhagens celulares incluindo dois hepatocarcinomas (HuH7 e HepG2) e dois cânceres de mama luminal (MDA-MB-134 e T-47D). Primeiro, em concentrações próximas à solubilidade máxima de sorafenib livre (5 μM de sorafenib em 0,1% DMSO, 2,8 μM para NPs sorafenib/DOTAU, e 4 μM para NPs sorafenib/diC₁₆dT), ambas SLNs inibiram viabilidade celular melhor que sorafenib livre. Estudo de viabilidade celular em células MDA-MB-134 indicou que atividade de sorafenib livre é limitada por sua solubilidade em água (100% viabilidade a [sorafenib] = 5 μM), enquanto valores IC₅₀ de 15 e 50 μM observados para SLN⁺ e SLN⁻, respectivamente. Em estudo FACS em HuH7, IC₅₀ de aproximadamente 50 μM obtido. Imagens de microscopia de fase de contraste mostram densidade reduzida de camadas celulares tratadas com SLN⁻ e SLN⁺ comparado a não tratadas ou tratadas com sorafenib, sem alteração da morfologia celular. Segundo, experimentos similares em concentrações mais altas de SLNs ([sorafenib] = 120 e 84 μM para SLN⁻ e SLN⁺, respectivamente) comparados a sorafenib livre no limite de solubilidade (5 μM). Nestes condições, ambas SLNs exibem forte efeito citotóxico nas quatro linhagens de câncer. Imagens de microscopia de fase de contraste revelam detritos celulares para ambas SLN⁻ e SLN⁺ atestando morte celular, enquanto células permanecem vivas no caso de sorafenib livre. Vale notar que fortes efeitos citotóxicos para ambas SLNs observados no caso de células de câncer de mama luminal B. Tal efeito antitumoral, não relatado antes, abre novas possíveis aplicações terapêuticas de sorafenib graças às SLNs.

Conclusão

Relatamos nova abordagem baseada em nucleolipídeos permitindo encapsulação e entrega eficiente de sorafenib. Nossas investigações demonstram formação de dois tipos de nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) altamente carregadas com sorafenib. Estas SLNs, que mostram potenciais zeta negativos ou positivos, apresentam formas paralelepípedas. Conforme revelado por estudos DLS e HPLC, a estabilidade das SLNs pode ser modulada dependendo do nucleolipídeo usado. Importante, ambas formulações SLN⁺ e SLN⁻ aumentam dramaticamente a solubilidade em água do sorafenib (concentrações superiores a 120 μM). Tais SLNs exibem melhores atividades antitumorais em quatro linhagens de câncer (fígado e mama) comparado a sorafenib livre, limitado por sua falta de solubilidade em água. Imagens de microscopia de fase de contraste, registradas nas quatro linhagens, exibem mortalidade celular drástica quando incubadas com 120 μM de SLN⁻ ou 84 μM de SLN⁺. Portanto, esta droga poderia ser usada como nova opção terapêutica no caso de cânceres de fígado (uso de sorafenib em quimioterapia intra-arterial, por exemplo) ou cânceres de mama. Para nosso conhecimento, este relato é o primeiro exemplo de estudo usando sorafenib contra cânceres de mama luminal B demonstrando utilidade da abordagem SLN. Em conjunto, os resultados destacam o potencial de SLNs baseadas em nucleosídeo-lipídio como sistemas de entrega de fármacos.

Abreviações

• AFNH₄: Formiato de amônio
• DLS: Espalhamento dinâmico de luz
• FA: Ácido fórmico
• HCC: Carcinoma hepatocelular
• HPLC: Cromatografia líquida de alta performance
• LNs: Nanopartículas lipídicas
• MeOH: Metanol
• PDI: Índice de polidispersidade
• RCC: Carcinoma de células renais
• SLNs: Nanopartículas lipídicas sólidas
• UHPLC: Cromatografia líquida de ultra-alta performance