Um sistema de montagem reversível induzida por pH com carga e liberação controláveis por resveratrol para quimioterapia de direcionamento de tumor aprimorada

Resumo

Neste relatório, apresentamos um sistema de montagem reversível induzida por pH (PIRAS) à base de ferritina (Ft) para terapia tumoral direcionada. Ele foi desenvolvido para carregar e liberar facilmente o medicamento anticâncer resveratrol (RV), com base em sua sensibilidade ao pH natural e na cavidade oca única de Ft. Um peptídeo alvo específico de tumor Arg-Gly-Asp (RGD) foi conjugado na superfície de Ft carregado com RV (RV @ Ft), para formar nanopartículas biocompatíveis (RV @ Ft-RGD). A sensibilidade ao pH de Ft permite que ele seja desnaturado em uma nanosfera porosa oca sob condições ácidas e renaturado em uma nanosfera oca selada sob condição neutra. Usando manipulação de pH, RV @ Ft-RGD, com um diâmetro de ~ 21 nm, mostrou uma alta taxa de carregamento de RV de 79,6%. A liberação de RV desencadeada por pH foi então medida em uma proporção de 50,3% em pH 5,0 ao longo de 24 h. Em condição neutra, o RV @ Ft-RGD apresentou excelente estabilidade ao longo de 20 dias. A imagem de fluorescência confocal mostrou que RV @ Ft-RGD tinha uma alta taxa de captação de células e co-localização com o lisossoma, principalmente devido ao efeito de alvo mediado por RGD. Com base na alta carga de droga, liberação desencadeada por pH e efeito de direcionamento de células tumorais, RV @ Ft-RGD mostrou grande capacidade de matar células in vitro e in vivo. A biocompatibilidade in vitro e in vivo também se demonstrou excelente, sem toxicidade sistemática. O conceito de design do PIRAS baseado em Ft inibe significativamente o crescimento do tumor e, simultaneamente, amplia ainda mais a aplicação de Ft na nanomedicina.

Introdução

O câncer de pulmão é uma das doenças malignas sólidas mais mortíferas em humanos. Com a crescente deterioração do meio ambiente e outros fatores, a incidência de câncer de pulmão aumenta ano a ano, e sua taxa de sobrevida em 5 anos é de apenas 17,4% [1, 2]. No momento, embora os tratamentos clínicos tradicionais, como ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia de primeira linha padrão estejam disponíveis, a taxa de sobrevida global média de pacientes com câncer de pulmão ainda precisa ser melhorada [3, 4]. Portanto, tratamentos mais eficazes e seguros precisam ser desenvolvidos com urgência para curar essa doença mortal. Atualmente, embora os efeitos-alvo baixos e os efeitos colaterais elevados de muitos medicamentos quimioterápicos tenham limitado sua utilidade na quimioterapia [5, 6], novos agentes quimioterápicos estão constantemente sendo desenvolvidos, especialmente no campo emergente dos nano-medicamentos [7,8, 9,10]. O resveratrol (RV) é um extrato de plantas naturais, como uvas e soja, que tem sido amplamente utilizado em ambientes clínicos para promover a agregação plaquetária, inibição da vasodilatação, redução da viscosidade sanguínea e semelhantes [11,12,13,14,15 ] Nos últimos anos, também foi descoberto que tem um forte efeito anticâncer [16,17,18]. No entanto, como um medicamento de molécula pequena em potencial, o RV também tem algumas desvantagens como outros medicamentos quimioterápicos de primeira linha - como baixa solubilidade, meia-vida curta de circulação sanguínea e falta de seletividade do tumor [19, 20]. Nanofármacos baseados em RV foram desenvolvidos nos últimos anos para superar essas deficiências e aumentar seus efeitos terapêuticos [21]. Vários tipos de nanocarreadores têm sido usados para carregar RV, incluindo lipossomas, albumina sérica, materiais de carbono, dichalcogenetos de metais de transição bidimensionais (2D-TMDs) e outros [21,22,23,24,25]. Embora esses nanocarreadores tenham sido relatados para aumentar de forma eficiente os efeitos terapêuticos de RV, eles ainda mostram algumas deficiências - como capacidade de liberação de gatilho ativo de alta eficiência para lipossomas e albumina sérica e potencial toxicidade sistêmica de longo prazo para materiais de carbono e 2D- TMDs [26, 27]. Portanto, ainda há uma demanda por nanocarreadores mais qualificados.

A ferritina é uma proteína nanocage natural com lúmen de aproximadamente 8 nm, formada pela interação e montagem de 24 subunidades de cadeias pesadas e leves [28, 29]. Por ser uma proteína endógena, a ferritina apresenta excelente biocompatibilidade e segurança. Além disso, há um relato de que a ferritina é uma proteína naturalmente sensível ao pH que pode ser desnaturada reversivelmente e remontada conforme seu ambiente muda de ácido para alcalino [30]. Quando o pH era ácido, os oligômeros em forma de haste desmontados se recuperaram apenas na estrutura em forma de fone de ouvido e os intermediários em forma de fone de ouvido desmontados recuperaram-se apenas na estrutura esférica oca [28,29,30]. Este comportamento único de montagem e desmontagem disparado por pH torna a ferritina um sistema de liberação de drogas ideal. Recentemente, Zhang et al. relataram que as moléculas de doxorrubicina (DOX) podem ser encapsuladas em ferritina e liberadas com sucesso pela regulação do pH para terapia tumoral [28].

Neste estudo, nosso objetivo foi desenvolver um sistema de montagem reversível induzido por pH baseado em ferritina (PIRAS) para controlar o carregamento e a liberação de RV para quimioterapia direcionada a tumor intensificada. A superfície da esfera de ferritina foi ligada ao peptídeo RGD de direcionamento ao tumor. O nano-fármaco RV @ Ft-RGD resultante demonstrou ser estável em ambientes neutros e alcalinos (pH> 7,4) e liberar RV apenas em ambientes ácidos (pH <7,4). Quando ainda caracterizado, RV @ Ft-RGD mostrou os seguintes benefícios in vitro e in vivo:(1) RV @ Ft-RGD células tumorais direcionadas e acumuladas no lisossoma (ambiente ácido), onde facilitou a liberação de mais RV no citoplasma; (2) o carreador de ferritina aumentou significativamente a meia-vida do RV livre no sangue, melhorando a retenção do fármaco na circulação sistêmica para facilitar o acúmulo de fármacos nos locais do tumor; (3) a estabilidade arquitetônica da ferritina evitou o vazamento do estouro do RV durante o processo de entrega; (4) RV @ Ft-RGD mostrou grande biocompatibilidade in vitro e in vivo. Portanto, devido a esses méritos, RV @ Ft-RGD apresentou excelentes propriedades terapêuticas antitumorais, que mostram grande potencial para futuras traduções clínicas.

Materiais e métodos

Materiais

Ferritina, resveratrol (RV, ≥ 99%) eram da Sigma-Aldrich. 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N-hidroxissuccinimida (NHS) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram adquiridos de Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD (Xangai, China). NH ₂ -PEG ₂₀₀₀ -RGD foi adquirido de Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd (Hunan, China). Meio de células DMEM, soro fetal bovino (FBS) e solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). O kit-8 de contagem de células (CCK-8) foi fornecido por Dojindo Laboratories (Japão).

Síntese de RV @ Ft-RGD

O carregamento do VD foi preparado conforme descrito de acordo com o relatório anterior [21, 28] com modificações. Em primeiro lugar, NH ₂ -PEG ₂₀₀₀ -RGD (10 mg) foi disperso na solução de Ft (1,5 mg / mL) na presença de 20 μL de EDC (5 mg / mL) e 20 μL de NHS (20 mg / mL). A mistura foi reagida por 2 h a 4 ° С com leve agitação e purificada por diálise contra água destilada (MW cut off =5 kDa) durante a noite, resultando em nanopartículas de Ft-RGD. E então, RV insolúvel em água foi dissolvido em DMSO para ser 2 mg / mL e foi adicionado à solução de Ft-RGD com uma concentração final de 1,5 mg / mL. O pH da mistura foi ajustado para pH =5 para desmontar as subunidades polipeptídicas. Posteriormente, o pH da mistura foi ajustado lentamente para 7,4 com hidróxido de sódio (1 M) para se assemelhar às subunidades polipeptídicas. A solução resultante foi dialisada em água destilada durante a noite para remover as moléculas de RV livres para serem o produto final (RV @ Ft-RGD). A quantidade de RV carregado foi detectada por espectrofotômetro UV-vis (UV3100, Shimadzu, Japão) monitorando o pico de absorção em 306 nm. A taxa de carregamento de RV era ( A _a - A _b ) / A _c , onde A _a , A _b e A _c representam o peso do VR inicial sem carga e do Ft-RGD, respectivamente.

Caracterizações

O método de espalhamento dinâmico de luz (DLS) (BI-9000AT, Brookhaven, EUA) foi usado para detectar o tamanho e o potencial zeta das nanopartículas. A morfologia das nanopartículas foi observada por um microscópio eletrônico de transmissão (TEM, JEM-100S, JEOL, Japão). Os espectros de fluorescência foram detectados por um espectrofotômetro de luminescência Perkin-Elmer LS50B. O sinal de fluorescência celular foi registrado em microscópio de varredura a laser comercial (LSM 510, Zeiss, Alemanha) e citometria de fluxo (FCM, EPICS XL, Beckman, EUA).

Estudo de liberação de RV

Quinhentos microlitros de solução RV @ Ft-RGD foram colocados em um tubo D (MWCO 6–8 kDa, Novagen) e a solução foi ajustada para diferentes valores de pH por meio de diferentes tampões. A solução foi então dialisada em 37 ^o C. Após um tempo de incubação diferente, alíquotas de 1 mL de dialisado foram removidas e substituídas por 1 mL de meio fresco. O RV liberado em diferentes tempos de incubação foi determinado por espectrofotômetro UV-vis. Além disso, RV @ Ft-RGD foi dissolvido em uma solução de lavagem com diferentes condições de pH, incluindo pH 5, 6,5, 7,4 e 8,5. Após incubação a 37 ° C por 24 h, o tamanho das nanopartículas foi caracterizado por DLS.

Cultura de células

As células de câncer de pulmão humano A549 e NCI-H358 foram obtidas da Cell Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) e cultivadas em meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina (PS) em um atmosfera umidificada contendo 5% de CO ₂ em 37 ^o C.

Captação celular e localização de RV @ Ft-RGD

Como um método comum usado, o FITC foi aplicado para marcar as nanopartículas. FITC foi dissolvido em solução de etanol (2,0 mg / mL) e misturado com solução aquosa de RV @ Ft e RV @ Ft-RGD (1,0 mg / mL) sob agitação de 4 h em ambiente escuro à temperatura ambiente. A mistura foi dialisada em água destilada durante a noite para remover o FITC e etanol redundantes, resultando em solução RV @ Ft e RV @ Ft-RGD marcada com FITC. Para confirmar a localização organela de nanopartículas in vitro, as células tratadas com RV @ Ft e RV @ Ft-RGD marcados com FITC por 5 he coradas pelo corante específico de lisossoma Lyso Tracker Red (Invitrogen). Posteriormente, a internalização celular de RV @ Ft e RV @ Ft-RGD foi observada usando um CLSM. Resumidamente, as células A549 foram incubadas com RV @ Ft e RV @ Ft-RGD marcados com FITC (com a mesma concentração de FITC) durante 5 h. E então, as células foram tratadas com soluções Lyso Tracker Red (100 nM) a 37 ° C por 30 min. Após lavagem por PBS por três vezes, as células foram observadas por um microscópio comercial de varredura a laser. O software ImageJ foi usado para analisar a intensidade de fluorescência das células.

Quimioterapia tumoral in vitro e estudo de apoptose

Em primeiro lugar, a citotoxicidade do transportador Ft-RGD foi avaliada por um ensaio CCK-8 padrão (Bestbio, China). Células A549 e NCI-H358 (1 × 10 ⁵ células / mL, 0,5 mL) foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas por 24 h. Após descartar o meio antigo, meio fresco contendo 0, 0,01, 0,1, 0,5 e 1 mg / mL de Ft-RGD foi incubado com células A549 e NCI-H358 por 24 h. As células foram lavadas suavemente três vezes com PBS. Cem microlitros de solução de trabalho CCK-8 (10% CCK-8 + 90% DMEM) foram então adicionados a cada poço e incubados por 30 min a 37 ° C. Os valores de absorvância a 450 nm foram medidos usando um espectrofotômetro de microplaca (Multiskan FC, Thermo Scientific). Fotografias de cada grupo de células foram observadas em microscópio óptico (Olympus).

Várias concentrações de RV livre, RV @ Ft, RV @ Ft-RGD e RV @ Ft-RGD + RGD (0, 10, 20, 30 e 40 μg / mL RV equivalentes) foram tratadas com células A549. Após 24 h de incubação, a viabilidade das células tratadas foi analisada pelo ensaio CCK-8. Enquanto isso, essas células tratadas foram duplamente coradas pelo kit de detecção de apoptose (Anexina VFITC / PI) e analisadas por FCM.

Tempo de circulação de RV @ Ft-RGD no sangue

RV livre ou RV @ Ft-RGD (6 mg / kg de RV equivalente) foi injetado por via intravenosa em camundongos nus Balb / c saudáveis ( n =5 por grupo). Após a injeção, o sangue venoso dos camundongos foi coletado em diferentes momentos e colocado em um tubo de coleta de sangue contendo heparina, sendo então o plasma separado. A concentração de RV no plasma foi extraída pelo reagente isopropanol acidificado e, em seguida, sua absorbância a 306 nm de excitação foi medida para determinar a concentração de RV.

Modelo Animal e In Vivo Quimioterapia tumoral

Camundongos Balb / c (4–6 semanas de idade) usados neste trabalho foram adquiridos de Charles River Laboratories (Pequim, China). Todas as operações envolvendo experimentos com animais estão estritamente de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório. A diretriz foi aprovada pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade de Zhengzhou. Para estabelecer um modelo de tumor subcutâneo de A549, 2 × 10 ⁶ Células A549 foram injetadas por via subcutânea nas costas dos camundongos. Eles foram então colocados no biotério por 7 a 9 dias. A fórmula de cálculo do volume do tumor é comprimento × largura ² / 2.

Os tumores A459 com camundongos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos. Cada grupo consistia em cinco camundongos. Os agrupamentos específicos são controle (solução salina), RV, RV @Ft e RV @ Ft-RGD. No início do tratamento, a amostra foi injetada uma vez ao dia pela veia da cauda, por três dias consecutivos. O volume do tumor e o peso corporal do camundongo foram registrados a cada 5 dias. Após 45 dias de tratamento, os tumores de cada grupo foram coletados. Os tecidos tumorais foram fixados em solução de formalina a 10%, seccionados e, em seguida, submetidos à coloração com hematoxilina e eosina (H&E).

Biocompatibilidade In Vivo

Duzentos microlitros de RV @ Ft-RGD foram injetados em camundongos Balb / c saudáveis através da veia da cauda (a dose de RV foi de 15 mg / kg). Camundongos saudáveis injetados com solução salina fisiológica da mesma maneira foram usados como um grupo de controle em branco. Nos dias 0, 10 e 45 após a injeção, o sangue de camundongo foi coletado para avaliação das contagens de células, incluindo glóbulos brancos (WBC), glóbulos vermelhos (RBC), hemoglobina (HGB) e volume médio de plaquetas (MPV). , hemoglobina média dos glóbulos vermelhos (MCH), hematócrito (HCT), concentração média de hemoglobina dos glóbulos vermelhos (MCHC), volume médio dos glóbulos vermelhos (MCV) e plaquetas (PLT). Além disso, os tecidos do coração, fígado, baço, pulmão e rim de cada grupo foram coletados para coloração H&E no 45º dia.

Análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (dp.). A análise estatística das amostras foi realizada usando o t de Student teste e p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados e discussão

Síntese e caracterizações de RV @ Ft-RGD

O carregamento e a liberação de RV de RV @ Ft-RGD foram realizados por meio da desmontagem reversível induzida por pH e remontagem de Ft (Fig. 1). Em primeiro lugar, a ferritina foi conjugada com o peptídeo de direcionamento de tumor RGD para formar Ft-RGD. Este foi então redissolvido em um tampão de acetato (pH =5) para desmontar as subunidades polipeptídicas e formar uma esfera de poros ocos. Moléculas de RV foram então adicionadas e permitidas a entrar na cavidade, após o que a solução foi lentamente ajustada a pH ≈ 7,4 para remontar Ft, prendendo as moléculas de RV dentro da cavidade Ft selada. Quando o pH do tampão foi então diminuído para ~ 5, os poros das nanopartículas se abriram reversivelmente e liberaram suas moléculas de RV. Figura 2a e arquivo adicional 1:A Figura S1 mostra as imagens SEM e TEM do RV @ Ft-RGD montado, que exibiu uma estrutura esférica. De acordo com a análise DLS, as partículas RV @ Ft-RGD tinham diâmetros maiores (~ 22,5 nm) em comparação com as nanopartículas Ft brutas (~ 11,8 nm) (Fig. 2b) e tinham potenciais zeta semelhantes às nanopartículas Ft brutas (-29,6 mV) (Fig. . 2c). Após 20 dias, o índice de polidispersidade (PDI) de RV @ Ft-RGD em água, FBS, meio celular e PBS não mostrou nenhuma alteração significativa (Fig. 2d), indicando que RV @ Ft-RGD tinha notável estabilidade coloidal. A Figura 2e mostra os espectros de absorvância de RV, Ft-RGD e RV @ Ft-RGD livres. Como pode ser visto, em comparação com RV e Ft-RGD, o espectro de absorção de RV @ Ft-RGD exibiu um novo pico em 306 nm (originado de RV), indicando o carregamento bem sucedido de RV. Além disso, RV @ Ft-RGD mostrou uma fluorescência de emissão significativa semelhante ao RV livre a 400 nm, quando excitado por um laser de 325 nm (Fig. 2f).

Uma ilustração esquemática da preparação RV @ Ft-RGD e quimioterapia direcionada ao tumor

a A imagem TEM de RV @ Ft-RGD. b , c A distribuição de tamanho e a distribuição de potencial zeta de Ft-RGD e RV @ Ft-RGD. d A mudança de PDI do RV @ Ft-RGD em água, FBS, meio celular e PBS ao longo de 20 dias. e Os espectros de absorvância de RV, Ft-RGD e RV @ Ft-RGD livres. f Os espectros de absorbância de RV e RV livres @ Ft-RGD

Carregamento e liberação de drogas

A capacidade máxima de carga do Ft-RGD foi encontrada em 252,6%, provavelmente devido à grande cavidade dentro do Ft-RGD oco. Como Ft é sensível ao pH, pudemos caracterizar a capacidade de carga do RV em diferentes condições de pH. Conforme mostrado na Fig. 3a, com o aumento do pH de 5,0 para 8,5, a eficiência de carregamento do RV diminuiu drasticamente. A liberação de RV do complexo também foi caracterizada sob diferentes valores de pH de 5,0 a 8,5. Um perfil de liberação de RV dependente do valor do pH e do tempo foi construído a partir desses dados e é mostrado na Fig. 3b. A taxa máxima de liberação do fármaco (51,6%) ocorreu em pH =5,0 por 24 h, sendo maior do que em pH =6,5, 7,4 e 8,5. De acordo com relatórios relacionados, os valores de pH de 5,0, 6,5 e 7,4 são aqueles tipicamente encontrados em lisossomas celulares, tecidos tumorais, sangue e ambiente fisiológico normal, respectivamente [31]. Em condições fisiológicas (pH 7,4), o conteúdo do fármaco RV @ Ft-RGD permaneceu alto mesmo após 50 h (Fig. 3c), sugerindo que o RV em RV @ Ft-RGD é estável e não vaza facilmente. Além disso, investigamos a mudança no diâmetro de RV @ Ft-RGD sob várias condições de pH diferentes. Após incubação a 37 ° C por 12 h, a análise DLS mostrou que o diâmetro de RV @ Ft-RGD era quase constante, em torno de 23 nm em pH 8,5 e 7,4. Quando o valor do pH caiu para 6,5 e 5,0, o diâmetro do RV @ Ft-RGD aumentou para 25 nm e 28,6 nm, respectivamente (Fig. 3d). Estes resultados confirmam o comportamento da desmontagem reversível induzida pelo pH e remontagem de RV @ Ft-RGD, que é benéfica para o carregamento controlável do fármaco in vitro e a liberação do fármaco no tecido tumoral.

a Eficiência de carregamento de Ft-RGD em várias condições de pH. b Perfil de liberação de RV de RV @ Ft-RGD em várias condições de pH de 5,0 a 8,5. c O RV permanente em RV @ Ft-RGD em condição fisiológica. d A mudança de tamanho médio de RV @ Ft-RGD em várias condições de pH de 5,0 a 8,5

Localização e captação celular in vitro

A captação celular in vitro e a localização de RV @ Ft-RGD foram então avaliadas. Em primeiro lugar, RV @ Ft e RV @ Ft-RGD foram marcados por FITC via interação de ligação de hidrogênio e absorção física. Como mostrado na Fig. 4a, as células tratadas com FITC livres mostraram sinais de fluorescência citoplasmática desprezíveis. As células tratadas com RV @ Ft-RGD, pelo contrário, exibiram fluorescência verde FITC intensa, que era superior à das células tratadas com RV @ Ft. Notavelmente, as células tratadas com RV @ Ft-RGD e pré-tratadas com RGD mostraram baixa fluorescência verde. A partir desses resultados, podemos concluir que RV @ Ft-RGD foi absorvido por células em grandes quantidades, provavelmente por meio de um efeito de alvo ativo mediado por RGD. Estas células tratadas também foram analisadas por FCM, cujos resultados são mostrados na Fig. 4b. Os resultados estatísticos da intensidade da fluorescência celular sugerem uma conclusão semelhante.

a Imagens de fluorescência de células A549 após incubação com RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD e RV @ Ft-RGD marcados com FITC e FITC livres, respectivamente. Barra de escala =60 μm. b Medição de FCM de intensidades de fluorescência FITC celulares em células A549 após incubação com FITC livre e RV @ FtC marcado com FITC, RV @ Ft-RGD + RGD e RV @ Ft-RGD, respectivamente. c Coeficiente de co-localização de fluorescência celular de FITC e Lyso Tracker Red. ** P <0,01, em comparação com outros grupos, respectivamente

Para estudar a localização da organela de RV @ Ft-RGD, um corante de coloração específico de lisossoma (Lyso Tracker Red) foi usado para corar as células incubadas com as nanopartículas. Como pode ser visto na Fig. 4a, o citoplasma apresentou forte fluorescência vermelha em todos os grupos. Depois de se fundir com a fluorescência verde FITC, RV @ Ft-RGD mostrou uma fluorescência amarela (verde + vermelha) mais intensa no citoplasma entre esses grupos. Com base na análise estatística, o grupo tratado com RV @ Ft-RGD apresentou o maior coeficiente de colocalização entre FITC e fluorescência Lyso Tracker Red (Fig. 4c). Estes resultados indicam que RV @ Ft-RGD pode entrar ativamente nas células e então ser transferido para o ambiente ácido do lisossoma (pH ≈ 5,0). Estes méritos, juntamente com a liberação de droga responsiva ao pH, conferem ao RV @ Ft-RGD muitas aplicações potenciais para terapia tumoral in vivo.

Biocompatibilidade in vitro e terapia de tumor

Antes de estudar as propriedades antitumorais de RV @ Ft-RGD, foi investigada a citotoxicidade do transportador Ft-RGD. Conforme mostrado na Fig. 5a e arquivo adicional 1:Figuras S2 e S3, Ft-RGD não mostrou nenhuma supressão de viabilidade óbvia para células A549 de câncer de pulmão e células NCI-H358 em concentrações de até 1 mg / mL. A morfologia celular também não exibiu nenhuma mudança significativa quando as células tratadas com 1 mg / mL foram comparadas aos grupos de controle (Fig. 5b), sugerindo claramente que Ft-RGD como um transportador tinha excelente biocompatibilidade. Como mostrado na Fig. 6a, b, RV, RV @ Ft e RV @ Ft-RGD livres matam todas as células de uma maneira dependente da concentração. As células tratadas com RV @ Ft-RGD mostraram maior diminuição da viabilidade e apenas 11,2% da viabilidade celular nos grupos de 40 μg / mL, que foi menor do que os grupos pré-tratados com RV @ Ft e RV @ Ft-RGD + RGD. Um estudo preliminar com FCM revelou ainda que com apenas RV, RV @ Ft ou RV @ Ft-RGD, a maioria das mortes celulares foi mediada por apoptose (Fig. 6c). Estes resultados demonstram que o efeito de morte de células tumorais de RV foi bastante aumentado pelo carregamento em Ft-RGD, principalmente devido ao aumento do acúmulo de RV @ Ft-RGD no lisossoma, onde a condição de pH ácido desencadeou uma liberação aumentada de RV promotor de apoptose. no citoplasma [32, 33].

a Citotoxicidade in vitro contra células A549 tratadas com diferentes concentrações de Ft-RGD por 24 h. b A imagem do microscópio de células A549 após 24 h de tratamento com 1 mg / mL de Ft-RGD

a Viabilidade celular de diferentes concentrações de células A549 tratadas com RV. b Viabilidade celular de células tratadas com RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD e RV @ Ft-RGD com RV em várias concentrações. c Apoptose celular de células A549 tratadas com PBS (controle), RV, RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD e RV @ Ft-RGD por citometria de fluxo. ** P <0,01, em comparação com outros grupos, respectivamente

Meia-vida de sangue de RV @ Ft-RGD

A concentração de RV no plasma sanguíneo em diferentes momentos após a injeção foi estudada em grupos tratados com RV livre e RV @ Ft-RGD, respectivamente. Conforme mostrado na Fig. 7a, a meia-vida no sangue de RV @ Ft-RGD foi de 5,1 ± 0,23 h. O RV livre teve um washout mais rápido da circulação, com meia-vida do sangue de apenas 0,43 ± 0,11 h. A meia-vida significativamente estendida de RV @ Ft-RGD no sangue é benéfica para melhorar a retenção da droga na circulação sistêmica e facilita o acúmulo de drogas nos locais do tumor.

a Tempo de circulação de RV e RV livres @ Ft-RGD no sangue. b O perfil de crescimento de tumores xenoenxertados com A549 após injeção intravenosa de três vezes de solução salina (controle), RV, RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD e RV @ Ft-RGD. A seta vermelha indica o ponto de tempo de injeção. ** P <0,01, em comparação com outros grupos, respectivamente. c Peso corporal de camundongos com tumor após vários tratamentos. d Micrografias de fatias de tumor coradas com H&E coletadas de diferentes grupos de camundongos após o final do tratamento. Barras de escala são 50 μm

Efeito antitumoral in vivo e toxicidade sistêmica de RV @ Ft-RGD

A Figura 7b mostra o perfil de crescimento do tumor de camundongos com tumor com tratamento diferente, que foi expresso como o volume relativo do tumor. O crescimento do tumor foi inibido em algum grau quando tratado com RV @ Ft, provavelmente devido à baixa absorção de RV @ Ft. No entanto, no grupo tratado com RV @ Ft-RGD, o crescimento do tumor foi significativamente suprimido em comparação com os outros grupos (controle, RV, RV @ Ft e RV @ Ft-RGD + RGD). Durante o tratamento, não houve perda perceptível de peso corporal em nenhum grupo experimental (Fig. 7c), indicando a alta biossegurança de RV @ Ft-RGD. Após o final do curso de tratamento, a coloração H&E do tecido tumoral nesses grupos foi realizada para investigar os efeitos quimioterápicos. Como mostrado na Fig. 7d, uma grande área de apoptose foi observada em tumores tratados com RV @ Ft-RGD, que está em contraste significativo com apenas uma pequena área de apoptose em tumores tratados com RV livre, RV @ Ft e RV @ Ft-RGD + RGD. Além disso, a toxicidade sistêmica de RV @ Ft-RGD também foi avaliada em camundongos normais. Amostras de sangue total de camundongos saudáveis tratados com solução salina e RV @ Ft-RGD foram coletadas em 0, 10 e 45 dias após a injeção para análise de sangue. Como mostrado na Fig. 8a, b, as contagens sanguíneas completas (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT e MCHC) de ratos injetados com RV @ Ft-RGD não mostraram diferenças significativas de 0 dia a 45 dias. Os principais órgãos de camundongos saudáveis tratados com solução salina e RV @ Ft-RGD também foram coletados aos 45 dias para coloração H&E. Nenhum efeito colateral óbvio foi encontrado nestes tecidos (Fig. 8c), sugerindo toxicidade adversa de longo prazo desprezível. Todos esses resultados demonstram o potencial promissor de RV @ Ft-RGD para quimioterapia de câncer intensificada in vivo.

a Análise de sangue de camundongos saudáveis tratados com RV @ Ft-RGD por 45 dias. b Imagens de órgãos principais corados com H &E de camundongos saudáveis tratados com RV @ Ft-RGD por 45 dias. c A coloração HE imagina órgãos principais em grupos de controle e tratados com RV @ Ft-RGD. Barras de escala são 50 μm

Conclusão

Em resumo, desenvolvemos com sucesso um sistema de montagem reversível induzido por pH (PIRAS) com carga e liberação controláveis por pH do fármaco RV antitumoral para quimioterapia direcionada a tumor intensificada. Sob condição ácida (pH =5,0), o sistema pode desmontar e carregar ou liberar RV, enquanto sob condição neutra (pH =7,4), RV @ Ft-RGD é altamente estável e mostra vazamento de droga insignificante. Através do efeito alvo mediado por RGD, RV @ Ft-RGD pode ser captado em altas concentrações por células A549 e se acumular no lisossoma, o que é benéfico para a liberação de RV tanto in vitro quanto in vivo. Devido ao acúmulo de RV @ Ft-RGD no lisossoma, e liberação de RV desencadeadora de pH do lisossoma ácido no citoplasma, RV @ Ft-RGD mostrou excelentes efeitos de eliminação de células tumorais e promoção de apoptose em comparação com RV livre. Além disso, após o carregamento de RV em Ft-RGD, RV @ Ft-RGD mostrou uma meia-vida sanguínea muito mais longa do que a de RV livre. Os resultados in vivo demonstram que RV @ Ft-RGD mostra notável supressão tumoral e nenhuma toxicidade sistêmica perceptível. Este estudo sugere que o PIRAS baseado em Ft é altamente eficiente na carga e liberação de drogas para terapia anticâncer aprimorada.