Novela dupla mitocondrial e nanopartículas de direcionamento do receptor CD44 para liberação desencadeada por estímulos redox

Resumo

Neste trabalho, novas nanopartículas multifuncionais (micelas) sensíveis a redox mitocondriais e de receptor CD44 de duplo direcionamento baseadas em ácido hialurônico oligomérico (oHA) foram propostas. O nanocarreador anfifílico foi preparado por brometo de (5-carboxipentil) trifenilfosfônio (TPP), ácido hialurônico oligomérico (oHA), ligação dissulfeto e curcumina (Cur), denominado como TPP-oHA-S-S-Cur. O TPP tinha como alvo as mitocôndrias, a droga antitumoral Cur servia como um núcleo hidrofóbico, o receptor CD44 direcionado para oHA funcionava como uma concha hidrofílica e a ligação dissulfeto agia como um braço de conexão. A estrutura química de TPP-oHA-S-S-Cur foi caracterizada por ¹ Tecnologia HNMR. Cur foi carregado nas micelas TPP-oHA-S-S-Cur por automontagem. Algumas propriedades, incluindo a preparação de micelas, morfologia, sensibilidade redox e direcionamento mitocondrial, foram estudadas. Os resultados mostraram que as micelas TPP-oHA-S-S-Cur tinham um diâmetro médio de 122,4 ± 23,4 nm, potencial zeta - 26,55 ± 4,99 mV. O estudo de liberação in vitro e o teste de captação celular mostraram que as micelas TPP-oHA-S-S-Cur tinham sensibilidade redox, duplo direcionamento para o receptor mitocondrial e CD44. Este trabalho forneceu uma plataforma nanocarreadora multifuncional inteligente e promissora para aumentar a solubilidade, diminuir os efeitos colaterais e melhorar a eficácia terapêutica de medicamentos anticâncer.

Histórico

Nos últimos anos, a fim de alcançar o tratamento eficaz do câncer, muitos sistemas de distribuição de drogas [1] foram estudados para preparar portadores de drogas poliméricas de macromoléculas multifuncionais com modificações estruturais que poderiam ter muitas vantagens, como aumentar a biodisponibilidade de drogas, reduzindo sua taxa de degradação , melhorando a captação celular, permitindo o direcionamento e controle da liberação do medicamento e reduzindo os efeitos colaterais [2, 3].

A curcumina (Cur), um composto difenólico, foi isolada de uma medicina tradicional chinesa Curcuma longa . Comparado com drogas antitumorais gerais, Cur teve amplos efeitos antitumorais em muitos tumores, como câncer de próstata, mama e cólon, e citotoxicidade relativamente baixa [4]. Mas sua solubilidade inadequada, instabilidade e baixa biodisponibilidade limitam extremamente sua aplicação clínica [5, 6]. A fim de melhorar a solubilidade e biodisponibilidade de drogas hidrofóbicas, muitos nanomateriais bem desenhados foram fabricados pela incorporação de drogas hidrofóbicas e ácido hialurônico oligomérico de material hidrofílico (oHA) [7]. Projetamos um tipo de conjugado anfipático polímero-droga como nanocarreador, carregando curcumina em micelas de polímero por meio de automontagem, que tinha boa estabilidade e pode prolongar a meia-vida da droga na circulação sanguínea. Micelas com tamanho de partícula pequeno podem se acumular passivamente em tumor sólido através do efeito EPR da angiogênese do tumor de forma eficaz para alcançar um melhor efeito de tratamento [8, 9].

oHA, uma pequena molécula derivada da degradação do HA, possui propriedades únicas, como boa hidrofilicidade, biocompatibilidade, estabilidade no plasma e direcionamento para o receptor CD44 na superfície da célula [7, 10, 11], enquanto os receptores CD44 são superexpressos em células de câncer de pulmão e células de câncer de mama, em comparação com a expressão mais baixa nas células normais [12]. As células tumorais têm sinais celulares únicos, incluindo glutationa (GSH, 2–10 mM), baixo pH e algumas enzimas, em contraste com as células humanas normais [13,14,15,16,17,18,19,20 ], enquanto as ligações dissulfeto têm sensibilidade à redução e podem fraturar sob a ação de GSH reduzido no citoplasma [21, 22].

As mitocôndrias são as organelas vitais para a sobrevivência celular e desempenham um papel importante na produção de energia e nas vias apoptóticas [23,24,25,26,27]. Portanto, as mitocôndrias têm sido consideradas os alvos subcelulares aplicados para o tratamento do câncer nos relatórios anteriores [28]. Devido ao maior potencial de membrana da mitocôndria entre as organelas celulares, trifenilfosfina, trifenilmetilfosfônio e outros tipos de cátions lipofílicos podem ser facilmente enriquecidos nas mitocôndrias através de sua barreira hidrofílica de bicamada lipídica [29, 30].

Neste trabalho, a fim de aumentar a solubilidade de Cur e aumentar a especificidade para células cancerosas, conjugados polímero-droga, compostos de oHA, TPP, ligações dissulfeto e Cur, foram projetados e sintetizados, os quais têm como alvo específico o receptor CD44 e as mitocôndrias . Além disso, apresentou sensibilidade à redução e pode ser usado como marcador de fluorescência. Este novo nanocarreador multifuncional recebeu o nome de brometo de (5-carboxipentil) trifenilfosfônio, ácido hialurônico oligomérico, ligação dissulfeto e curcumina (TPP-oHA-S-S-Cur). Cur foi carregado em micelas TPP-oHA-S-S-Cur via auto-montagem em água [1, 31]. As micelas poliméricas TPP-oHA-S-S-Cur encapsuladas Cur (doravante denotadas como micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur) podem aumentar a eficácia terapêutica e a carga de droga de curcumina, bem como reduzir os efeitos colaterais. Após alvejar os tecidos tumorais, as micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur penetraram nas células por meio de endocitose mediada por CD44, seguido por alvejar as mitocôndrias e as ligações dissulfeto quebraram em resposta a GSH elevado (2-10 mM) levando ao liberação rápida da droga (Fig. 1). Aqui, podemos propor uma hipótese de que este novo receptor de CD44 mitocondrial e nanopartículas multifuncionais sensíveis a redox serão uma nova plataforma para o sistema de entrega de drogas de direcionamento a tumor. Após a preparação das micelas, algumas investigações preliminares sobre as características das micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur foram realizadas neste estudo.

Ilustração esquemática de nanopartículas sensíveis a redox de alvo duplo mitocondrial e de receptor CD44

Métodos

Materiais

Curcumina (Cur, Shanghai Zhanyun Chemical Co. Ltd); ácido hialurônico oligomérico (oHA, Mn =10 kDa, Shandong Freda Biological Engineering Co. Ltd.); O ácido 3,3′-ditiodipropiônico foi fornecido pela Adamas Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). (5-carboxipentil) trifenilfosfônio (TPP), tetrahidrofurano anidro (THF), dimetilsulfóxido (DMSO), trietilamina (TEA), 1-etil- (3-dois metil amino propil) cloridrato de carbodiimida carbonizada (EDC) e 4-dimetilaminopiridina (DMAP) foram obtidos de Aladdin Chemistry Co. Ltd. Todos os outros reagentes eram de grau analítico e fornecidos por Sinopharm Group Chemical Reagent Corp.

Síntese e caracterização de TPP-oHA-S-S-Cur

Os nanocarreadores multifuncionais foram sintetizados em três etapas, conforme mostrado na Fig. 2.

Via sintética de TPP-oHA, S-S-Cur e TPP-oHA-S-S-Cur

Etapa 1

TPP foi combinado com oHA via ligação éster usando um método relatado anteriormente [32]. Primeiro, TPP, EDC e DMAP foram dissolvidos em DMSO para reagir por 1 h a 60 ° C. Em seguida, oHA foi dissolvido em DMSO:H ₂ O ( v / v =1:1) e adicionou-se a reação acima durante 8 h à temperatura ambiente. A mistura de reação foi dialisada com um saco de diálise (MWCO 2000 Da) em água desionizada por 48 h para remover as impurezas e liofilizada para obter polímeros TPP-oHA.

Etapa 2

Resumidamente, o ácido 3,3′-ditiodipropiônico foi dissolvido em THF e ativado por cloreto de oxalila. Em seguida, a mistura foi reagida com Cur catalisado por TEA. O produto obtido foi isolado por cromatografia em coluna de sílica gel para obter o produto puro S-S-Cur.

Etapa 3

S-S-Cur, EDC e DMAP foram dissolvidos em DMSO e ativados a 60 ° C por 2 h, e então TPP-oHA foi adicionado na solução acima e feito reagir por 24 h em temperatura ambiente. A mistura foi dialisada em água destilada com tubo de diálise (MWCO 2.000 Da) por 48 h, seguido de liofilização para obter o produto final TPP-oHA-S-S-Cur.

As estruturas de TPP-oHA, S-S-Cur e TPP-oHA-S-S-Cur foram confirmadas com ¹ HNMR (Advance Bruker 400M; Switzerland Bruker Company, Madison, WI, EUA) usando DMSO-d deuterado ₆ , CD ₃ Cl e DMSO-D ₆ :D ₂ O (DMSO-d ₆ :D ₂ O =1:1, v / v ) como solvente, respectivamente.

Preparação e caracterização de micelas

As micelas TPP-oHA-S-S-Cur e micelas oHA-Cur foram preparadas por métodos de diálise [33]. Em primeiro lugar, TPP-oHA-S-S-Cur (10 mg) e curcumina (1,5 mg) foram dissolvidos em formamida (6 mL). Em seguida, a mistura foi dialisada em água deionizada com bolsa de diálise (MWCO 2000 Da) no escuro por 24 horas para remoção dos solventes orgânicos. Depois disso, a solução dialisada foi centrifugada a 2500 rpm por 10 min para remover Cur descarregado. Finalmente, a suspensão de micelas foi filtrada através de membranas de filtro de seringa de 0,45 μm. As micelas oHA-Cur funcionais simples foram obtidas pelo mesmo método.

O tamanho de partícula, potencial zeta e índice de polidispersidade (P.I.) de micelas carregadas com Cur foram observados por Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.). A morfologia das micelas carregadas com Cur foi monitorada por microscópio eletrônico de transmissão (TEM, H-600; Hitachi, Tóquio, Japão). A estabilidade de micelas carregadas com Cur foi realizada em PBS contendo 20% de FBS pelo Delsa Nano C.

A eficiência de aprisionamento (EE) e carga de droga (DL) foram medidos pelo método de filtração por membrana. Após filtração por membrana de 0,45 μm, a solução obtida foi medida por cromatografia líquida de alta performance (HPLC, Agilent Technologies) a 425 nm para obtenção de EE e DL. As equações para calcular EE e DL das micelas foram as seguintes:
$$ \ mathrm {EE} \ left (\% \ right) =\ mathrm {Quantidade} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {drug} \ \ mathrm {in} \ \ mathrm {micelles} / \ mathrm {total } \ \ mathrm {quantidade} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {alimentação} \ \ mathrm {droga} \ vezes 100 $$ $$ \ mathrm {DL} \ esquerda (\% \ direita) =\ mathrm {Quantidade } \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {drug} \ \ mathrm {in} \ \ mathrm {micelles} / \ mathrm {quantidade} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {drug} \ \ mathrm {carregado} \ \ mathrm {micelas} \ times 100 $$

Liberação de droga in vitro na presença de GSH

A responsividade redox de GSH intracelular de micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur foi avaliada usando o método de diálise. Quatro mililitros das suspensões de micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur (50 μg curcumina / mL) foram colocados em um saco de diálise (MWCO 7000 Da) e dialisados ​​contra 45 mL de PBS (pH 7,4, contendo 45% de soro fetal bovino e 0,5% de Tween 80) com diferentes níveis de GSH (0, 10, 2 e 10 mM). As amostras em tubos de centrifugação foram mantidas a 37 ° C em incubadora com agitação (BS-2F, Changzhou, China) com 100 rpm. Em intervalos de tempo predefinidos (0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h), 2 mL de meio de liberação foram retirados dos tubos de centrífuga e reabastecidos com um volume igual de os meios frescos correspondentes e as concentrações de Cur foram analisados ​​por HPLC. Cada experiência foi executada em triplicado.

Cultura de células

Células de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Hyclone) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Os receptores de CD44 foram altamente expressos em células MDA-MB-231, então as linhas celulares MDA-MB-231 foram selecionadas e cultivadas em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO ₂ atmosfera suplementada.

Ensaios de citotoxicidade in vitro

O ensaio de citotoxicidade in vitro de TPP-oHA-S-S-Cur foi avaliado pelo método MTT [32]. Células MDA-MB-231 (receptor de CD44 de alta expressão) foram cultivadas a uma densidade de 1 × 10 ⁴ células / poço em placas de 96 poços. Cem microlitros de Cur livre, Cur / oHA-Cur micelas e Cur / TPP-oHA-SS-Cur incluindo diferentes concentrações de Cur (0,5, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 μg / mL) foram adicionado a diferentes poços, enquanto PBS como controle foram adicionados. Após incubação por 24 h, 100 μL de solução de MTT (5 mg / mL) foram adicionados a cada poço e a seguir incubados por 4 h. Em seguida, o MTT foi substituído por 100 μL de DMSO e colocado em uma incubadora de agitação para dissolver o cristal de formazan. Após incubação durante 20 min, a absorvância foi medida utilizando um leitor de microplacas (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) a 570 nm.

Captação celular in vitro e localização mitocondrial

Análises qualitativas de captação celular de micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur e micelas Cur / oHA-Cur foram observadas usando microscopia de fluorescência (Eclipse E400; Nikon Corporation, Tóquio, Japão). As células MDA-MB-231 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5000 células por poço e incubadas com DMEM (1 mL) contendo 10% de FBS e depois cultivadas por 24 h a 37 ° C em 5% de CO ₂ . Depois disso, meio de cultura fresco (1 mL) com micelas carregadas com droga (micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur e micelas de Cur / oHA-Cur) foi adicionado a cada poço. As células foram cultivadas com Cur livre atuando como controle; a concentração final de Cur foi de 20 μg / mL. Além disso, as células foram incubadas com o fármaco por diferentes intervalos de tempo. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído 4% por 15 min.

Além disso, para avaliar a capacidade de direcionamento de CD44 de micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur, HA (2 mg / mL) foi adicionado ao meio como um grupo de controle para se ligar aos receptores de CD44.

Além disso, para marcar a mitocôndria celular para localizar micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur e micelas de Cur / oHA-Cur dentro das células, as células foram incubadas adicionalmente com um rastreador mitocondrial (Mito-rastreador Red CMXROS) por 15 min. Por fim, as células foram lavadas três vezes e observadas por microscopia de fluorescência.

Citometria de fluxo

As análises quantitativas foram medidas por citometria de fluxo. As células MDA-MB-231 foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 10 ⁵ células / poço em 2 mL de meio com FBS a 10% e tratado como a descrição acima. Após a incubação com micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur e micelas de Cur / oHA-Cur (20 μg Cur / mL) para diferentes intervalos de tempo, as células foram lavadas três vezes com PBS e tripsinizadas por tripsina 0,25%. Em seguida, as células foram centrifugadas a 1500 rpm por 5 min. Após ressuspensão em PBS (0,5 mL), as células foram analisadas por citometria de fluxo (EPICS XL, Beckman, EUA).

Análise estatística

Os dados foram apresentados como médias ± DP ( n =3). Além disso, o software SPSS (versão 20, EUA) foi usado; os dados foram analisados ​​quanto a diferenças significativas nos níveis de probabilidade de * p <0,05 (significativo) usando análise de variação unilateral (ANOVA).

Resultados e discussão

Caracterização de materiais transportadores TPP-oHA-S-S-Cur

As rotas de síntese de TPP-oHA, S-S-Cur e TPP-oHA-S-S-Cur foram apresentadas na Fig. 2.

Além disso, o ¹ Os espectros de HNMR de oHA, TPP-oHA, S-S-Cur e TPP-oHA-S-S-Cur foram observados na Fig. 3. TPP-oHA foi sintetizado por TPP e oHA. Picos característicos de três anéis de benzeno em TPP foram vistos em 7,570-7,717 ppm no ¹ Espectro HNMR de TPP-oHA, que confirmou que TPP-oHA foi sintetizado com sucesso. Além disso, S-S-Cur foi sintetizado por ácido 3,3′-ditio-dipropiônico e Cur. Além disso, TPP-oHA-S-S-Cur foi sintetizado por TPP-oHA e S-S-Cur. O TPP em TPP-oHA-S-S-Cur foi observado na região entre 7,570 e 7,717 ppm. Os picos característicos de Cur foram observados no ¹ Espectro HNMR de S-S-Cur e TPP-oHA-S-S-Cur em 6,795-7,467 ppm, e o pico de próton (-CH ₂ -S-S-CH ₂ -) de ácido 3,3-ditiodipropiônico foi observada a 2,502 ppm de acordo com TPP-oHA-S-S-Cur. Estes resultados confirmaram a síntese bem-sucedida de TPP-oHA-S-S-Cur.

¹ Espectros de HNMR de oHA, TPP-oHA, S-S-Cur e TPP-oHA-S-S-Cur

Preparação e avaliação de TPP-oHA-S-S-Cur Micelles

O tamanho de partícula, índice de polidispersidade, potenciais zeta, DL e EE das micelas carregadas com a droga são vistos na Tabela 1. Os tamanhos médios de micelas de Cur / oHA-Cur e micelas de Cur / TPP-oHA-SS-Cur foram 145,5 ± 2,1 e 122,4 ± 4,6 nm, respectivamente. Isso pode ser porque o TPP alterou as propriedades físico-químicas da superfície das micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur que levam às diferenças de duas micelas. E a DL e EE de micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur foram maiores do que as micelas comuns preparadas por TPP-oHA. Além disso, as micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur tinham potencial zeta negativo mais forte (- 21,56 ± 1,46 mV) do que as micelas Cur / oHA-Cur (- 19,17 ± 0,55 mV), o que indicou estabilidade aprimorada de TPP-oHA -SS-Cur devido à agregação de micelas causada principalmente pela presença de TPP.

Além disso, a aparência, distribuição de tamanho de partícula, potencial zeta e caracterização de imagem TEM de micelas TPP-oHA-SS-Cur foram mostradas na Fig. 4. Os resultados revelaram micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur eram aproximadamente esféricas ( Fig. 4d), distribuído homogeneamente (Fig. 4b), e tinha um diâmetro médio de aproximadamente 122,4 ± 4,6 nm. Além disso, o índice de polidispersidade das micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur foi 0,132 menor que 0,2, indicando o tamanho uniforme das micelas, que eram consistentes com TEM (Fig. 4c).

Aparência ( a ), distribuição de tamanho de partícula ( b ), potencial zeta ( c ) e imagem TEM ( d ) caracterização de micelas TPP-oHA-S-S-Cur

Como mostrado na Tabela 1, o tamanho de partícula de micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur era menor em PBS do que PBS contendo FBS. De 2 a 24 h, o tamanho mudou de 133,45 ± 6,8 para 160,27 ± 7,1 nm em PBS contendo FBS. Este fenômeno indicou que as micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur poderiam manter uma melhor estabilidade in vivo.

Estudo sobre liberação de drogas de micelas in vitro

A sensibilidade redox de TPP-oHA-S-S-Cur foi estudada por micelas em diferentes concentrações de GSH. A liberação de Cur a partir de micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur na presença ou ausência de GSH foi conduzida para simular os ambientes de tumor. Conforme mostrado na Fig. 5, no meio sem GSH, apenas 32,5% de Cur foi liberado do TPP-oHA-SS-Cur em 120 h, e a adição de 10 μM de GSH ao meio resultou apenas em um ligeiro aumento (37%) . Em contraste, a liberação da droga dos grupos com GSH 2 mM e GSH 10 mM foi de 57,5 ​​e 75,3%, respectivamente. Verificou-se que a liberação do fármaco aumentou com a concentração de GSH. Este resultado foi atribuído à ruptura da ligação dissulfeto de TPP-oHA-S-S-Cur, o que indicou que as micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur tinham sensibilidade à redução.

Liberação in vitro de micelas TPP-oHA-S-S-Cur carregadas com Cur em diferentes concentrações de GSH ( n =3)

Estudos de Citotoxicidade

A citotoxicidade de diferentes formulações de curcumina em células MDA-MB-231 foi estudada pelo ensaio MTT. Como mostrado na Fig. 6, diferentes concentrações de formulações de curcumina tiveram diferentes viabilidade celular em 24 h. As micelas carregadas com Cur foram menos tóxicas que o Cur livre, o que poderia ser explicado que o material polimérico diminuiu bastante a citotoxicidade celular. Enquanto isso, a Fig. 6b mostrou um perfil de viabilidade celular dependente da concentração, enquanto as micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur tinham a viabilidade celular mais baixa do que as micelas Cur / oHA-Cur e outras formulações, o que poderia ser explicado que Cur / TPP- As micelas oHA-SS-Cur entraram facilmente nas células e liberaram a droga sob o efeito GSH. O IC ₅₀ os valores das micelas livres de Cur, Cur / oHA-Cur e Cur-TPP-oHA-SS-Cur em células MDA-MB-231 foram 6,534, 5,092 e 3,871 μg / mL, respectivamente, que exibiram melhor citotoxicidade celular de Cur Micelas -TPP-oHA-SS-Cur em células MDA-MB-231.

a Citotoxicidade de formulações de curcumina após incubação por 24 h. Os dados representam a média ± SD ( n =6). * p <0,05, em comparação com o Cur. b Citotoxicidade de micelas carregadas com Cur com diferentes concentrações de Cur (0,5, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 μg / mL). O IC ₅₀ os valores das micelas de Cur livre, Cur / oHA-Cur e Cur-TPP-oHA-SS-Cur foram 6,534, 5,092 e 3,871 μg / mL, respectivamente

Além disso, as micelas em branco tinham certa toxicidade (Fig. 6) porque o Cur estava ligado ao polímero por um método químico. Isso aumentaria a capacidade de carga da droga nas micelas e, então, aumentaria o efeito antitumoral.

Imagens de microscopia de fluorescência de captação celular

A absorção celular de Cur livre, micelas de Cur / oHA-Cur e micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur foi estudada por microscópio de fluorescência. Neste trabalho, o Cur em si não era apenas um medicamento anticâncer, mas também uma sonda de fluorescência verde. Como pode ser visto na Fig. 7, ambas as micelas Cur / oHA-Cur e Cur / TPP-oHA-SS-Cur mostraram boa absorção celular em linhas celulares e a intensidade de fluorescência estava em proporção direta ao tempo, enquanto a intensidade de fluorescência foi mais forte em 4 h. Enquanto isso, a intensidade de fluorescência do grupo tratado com micelas de Cur / oHA-Cur foi mais forte do que o grupo Cur livre nos mesmos pontos de tempo. Isso pode ser porque oHA-Cur com a capacidade de direcionar o receptor CD44 promoveu a entrada de drogas nas células. Além disso, talvez graças à capacidade de sensibilidade redox das micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur, seus sinais de fluorescência eram obviamente mais elevados do que as micelas de Cur / oHA-Cur. Ao aumentar o acúmulo de Cur, ele seria induzido pela citotoxicidade e apoptose das células cancerosas, que foram consistentes com os resultados dos estudos de citotoxicidade.

Imagens de microscopia de fluorescência da captação celular de Cur livre ( a ), oHA-Cur / Cur-micelles ( b ), e TPP-oHA-S-S-Cur / Cur-micelas ( c ) em um momento diferente. d Células tratadas com TPP-oHA-S-S-Cur / Cur-micelas na presença de HA livre (2 mg / mL), mostrando o efeito de conclusão de HA em células MDA-MB-231

Além disso, a intensidade de fluorescência do grupo de micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur com HA foi menor do que sem o grupo HA, muito provavelmente devido ao fato de que as moléculas de HA livres ocupavam os receptores CD44, o que demonstrou ainda mais capacidade de direcionamento do TPP-oHA-SS-Cur contra CD44.

Além disso, a localização mitocondrial de TPP-oHA-S-S-Cur foi confirmada em linhas de células MDA-MB-231 por coloração com Mito-tracker Red CMXRos (Fig. 8). As imagens revelaram que a fluorescência verde de micelas de Cur / TPP-oHA-SS-Cur se sobrepõe bem à fluorescência vermelha do rastreador mitocondrial, o que indica que a droga pode se acumular na mitocôndria das células cancerosas, e o TPP-oHA-SS -Cur tinha direcionamento mitocondrial.

Localização mitocondrial. A localização mitocondrial foi determinada por coloração com rastreadores mitocondriais em células MCF-7 com o tratamento de Cur livre ( a ), oHA-Cur ( b ), e TPP-oHA-S-S-Cur ( c ); barra de escala:100 μm

Citometria de fluxo

A intensidade média de fluorescência (MFI) foi medida com citometria de fluxo. Como visto na Fig. 9, o MFI de células MDA-MB-231 incubadas com micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur e micelas de Cur / oHA-Cur foi diretamente proporcional ao tempo de administração. Consistente com a observação microscópica confocal, o MFI de células tratadas com micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur foi significativamente maior do que o grupo de micelas Cur / oHA-Cur nos mesmos pontos de tempo ( p <0,05).

Intensidade de fluorescência de células MDA-MB-231 incubadas com diferentes formulações de Cur (20 μg Cur / mL). Dados representados como média ± DP ( n =3). * p <0,05, ANOVA unilateral

Conclusões

Neste estudo, para aumentar a solubilidade e o efeito do tratamento de Cur, reduzir os efeitos colaterais da terapia tradicional e aumentar o direcionamento do medicamento ao tumor, tomamos dissulfidebond responsivo a redox como um braço de conexão e construímos um receptor de CD44 mitocondrial e duplo direcionamento conjugados polímero-droga responsivos a redox (TPP-oHA-SS-Cur). O TPP tinha como alvo as mitocôndrias, o fármaco antitumoral Cur servia como fração hidrofóbica e o receptor CD44 que tinha como alvo oHA agia como frações hidrofílicas. Cur, como um modelo de droga, foi carregado no blockcopolymer anfifílico e formou micelas por meio de automontagem.

Este sistema de entrega de drogas encapsulando Cur por um método químico e um método físico não apenas melhora sua DL / EE, mas também aumenta sua estabilidade e tempo de circulação sanguínea, e pode alcançar um melhor direcionamento do tumor. Os testes de liberação de drogas in vitro mostraram que a ligação dissulfeto de TPP-oHA-SS-Cur quebrou pelo efeito de alto GSH (2–10 mM) nas células tumorais, seguido pela rápida liberação da droga e, em seguida, demonstrou sua redução. confidencial. Os resultados de captação celular, localização mitocondrial e citotoxicidade mostraram que as micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur tinham capacidade de direcionamento do receptor CD44 e capacidade de direcionamento mitocondrial. A próxima etapa, avaliaremos a atividade antitumoral de micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur in vivo.

Além disso, esta plataforma nanocarreadora multifuncional inteligente desenvolvida neste estudo exibiu potencial para ser usada para drogas hidrofóbicas com solubilidade, estabilidade e eficácia terapêutica significativamente melhoradas. Enquanto isso, esse método forneceu uma nova ideia para o tratamento de tumores.

Abreviações

oHA:

Ácido hialurônico oligomérico

S-S-Cur:

Ácido ditiodipropiônico-curcumina

TPP:

Brometo de (5-carboxipentil) trifenil-fosfônio

Modificação do cocatalisador da liga PtNi do híbrido g-C3N4 / GO sensibilizado com Eosina Y para evolução eficiente do hidrogênio fotocatalítico com luz visível Evolução de hidrogênio fotocatalítico aprimorada carregando Cd0.5Zn0.5S QDs em nanofolhas Ni2P porosas