Nanocarreador de Ferritina Sensível a pH Permite Liberação Controlada de Resveratrol para Quimioterapia Tumor Direcionada

Resumo

Neste relatório, apresentamos um sistema de montagem reversível induzido por pH (PIRAS) baseado em ferritina (Ft) para terapia tumoral direcionada. Foi desenvolvido para carregar e liberar facilmente o fármaco anticancerígeno resveratrol (RV), baseando-se em sua sensibilidade natural ao pH e cavidade oca única da Ft. Um peptídeo alvo tumoral específico Arg-Gly-Asp (RGD) foi conjugado na superfície de Ft carregada com RV (RV@Ft), formando nanopartículas biocompatíveis (RV@Ft-RGD). A sensibilidade ao pH da Ft permite que ela se desnature em nanoesfera porosa oca sob condição ácida e renature em nanoesfera oca selada sob condição neutra. Usando manipulação de pH, RV@Ft-RGD, com ~21 nm de diâmetro, mostrou alta taxa de carregamento de RV de 79,6%. A liberação de RV desencadeada por pH foi medida em 50,3% a pH 5,0 ao longo de 24 h. Sob condição neutra, RV@Ft-RGD mostrou excelente estabilidade por 20 dias. Imageamento de fluorescência confocal mostrou que RV@Ft-RGD teve alta taxa de captação celular e co-localização com lisossomo, principalmente devido ao efeito alvo mediado por RGD. Baseado na alta carga de fármaco, liberação desencadeada por pH e efeito de direcionamento de células tumorais, RV@Ft-RGD mostrou grande capacidade de morte celular in vitro e in vivo. A biocompatibilidade in vitro e in vivo também foi demonstrada como excelente, sem toxicidade sistêmica. O conceito de design de PIRAS baseado em Ft inibe significativamente o crescimento tumoral e amplia a aplicação de Ft em nanomedicina.

Introdução

Câncer de pulmão é uma das neoplasias sólidas mais letais em humanos. Com a deterioração ambiental e outros fatores, a incidência aumenta anualmente, e sua taxa de sobrevivência de 5 anos é apenas 17,4%. Embora tratamentos clínicos tradicionais como ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia padrão de primeira linha estejam disponíveis, a taxa de sobrevivência global mediana ainda precisa melhorar. Portanto, tratamentos mais eficazes e seguros precisam ser desenvolvidos. Atualmente, embora baixos efeitos alvo e altos efeitos colaterais de muitos fármacos quimioterápicos limitem sua utilidade, novos agentes quimioterápicos são constantemente desenvolvidos, especialmente no campo emergente de nanofármacos. Resveratrol (RV) é extrato de plantas naturais como uvas e soja, amplamente usado clinicamente para promover agregação plaquetária, inibição de vasodilatação, redução de viscosidade sanguínea, etc. Nos últimos anos, também demonstrou forte efeito anticancerígeno. No entanto, como potencial fármaco de pequena molécula, RV tem desvantagens como outros fármacos de primeira linha — baixa solubilidade, meia-vida curta na circulação sanguínea e falta de seletividade tumoral. Nanofármacos baseados em RV foram desenvolvidos para superar esses defeitos e aumentar efeitos terapêuticos. Vários nanocarreadores foram usados para carregar RV, incluindo lipossomos, albumina sérica, materiais de carbono, dicogenetos de metais de transição bidimensionais (2D-TMDs), etc. Embora esses nanocarreadores tenham aumentado eficientemente efeitos terapêuticos do RV, ainda mostram deficiências — como capacidade de liberação gatilho ativo de alta eficiência para lipossomos e albumina, e potencial toxicidade sistêmica a longo prazo para materiais de carbono e 2D-TMDs. Portanto, ainda há demanda por nanocarreadores mais qualificados.

Ferritina é uma nanogaiola proteica natural com lúmen de ~8 nm, formada pela interação e montagem de 24 subunidades de cadeias pesadas e leves. Por ser proteína endógena, ferritina tem excelente biocompatibilidade e segurança. Além disso, há relato de que ferritina é proteína naturalmente sensível a pH que pode ser desnaturada e remontada reversivelmente conforme seu ambiente muda de condição ácida para alcalina. Quando pH é ácido, oligômeros desmontados em forma de bastão recuperam apenas a estrutura em forma de fone de ouvido, e intermediários desmontados em forma de fone recuperam apenas a estrutura esférica oca. Esse comportamento único de montagem e desmontagem gatilhado por pH torna ferritina um sistema ideal de liberação de fármacos. Recentemente, Zhang et al. relataram que moléculas de doxorrubicina (DOX) podem ser encapsuladas em ferritina e liberadas com sucesso por regulação de pH para terapia tumoral.

Neste estudo, visamos desenvolver um sistema de montagem reversível induzido por pH (PIRAS) baseado em ferritina para controlar carregamento e liberação de RV para quimioterapia tumoral direcionada aprimorada. A superfície da nanoesfera de ferritina foi ligada ao peptídeo alvo tumoral RGD. O nanofármaco resultante RV@Ft-RGD demonstrou ser estável em ambientes neutros e alcalinos (pH > 7,4), e liberar RV apenas em ambientes ácidos (pH < 7,4). Quando caracterizado, RV@Ft-RGD mostrou benefícios in vitro e in vivo: (1) alvejou células tumorais e acumulou no lisossomo (ambiente ácido), facilitando liberação de mais RV no citoplasma; (2) o carreador de ferritina aumentou significativamente a meia-vida sanguínea do RV livre, melhorando retenção do fármaco na circulação sistêmica para facilitar acúmulo em sítios tumorais; (3) estabilidade arquitetural da ferritina impediu vazamento explosivo de RV durante entrega; (4) RV@Ft-RGD mostrou grande biocompatibilidade in vitro e in vivo. Portanto, devido a esses méritos, RV@Ft-RGD exibiu esplêndidas propriedades antitumorais terapêuticas, com grande potencial para traduções clínicas futuras.

Materiais e Métodos

Materiais

Ferritina, resveratrol (RV, ≥99%) da Sigma-Aldrich. EDC, NHS e FITC da Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD da Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd. Meio DMEM, soro fetal bovino (FBS) e PBS da Invitrogen. Kit CCK-8 da Dojindo Laboratories.

Síntese de RV@Ft-RGD

Carregamento de RV preparado conforme relatório prévio com modificações. Primeiro, NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD (10 mg) disperso em solução de Ft (1,5 mg/mL) com 20 μL EDC (5 mg/mL) e 20 μL NHS (20 mg/mL). Mistura reagiu por 2 h a 4 °C com agitação leve, purificada por diálise contra água destilada (corte MW = 5 kDa) durante noite, resultando em nanopartículas Ft-RGD. Então, RV insolúvel em água dissolvido em DMSO a 2 mg/mL adicionado à solução Ft-RGD com concentração final 1,5 mg/mL. pH da mistura ajustado a 5 para desmontar subunidades polipeptídicas. Depois, pH ajustado lentamente a 7,4 com NaOH (1 M) para remontar subunidades. Solução resultante dialisada em água destilada durante noite para remover RV livre, obtendo produto final (RV@Ft-RGD). Quantidade de RV carregado detectada por espectrofotômetro UV-vis (UV3100, Shimadzu) monitorando pico de absorção a 306 nm. Taxa de carregamento = (Aa - Ab)/Ac, onde Aa, Ab, Ac representam peso de RV inicial, RV não carregado e Ft-RGD, respectivamente.

Caracterizações

Espalhamento dinâmico de luz (DLS, BI-9000AT) para tamanho e potencial zeta. Morfologia por microscópio eletrônico de transmissão (TEM, JEM-100S). Espectros de fluorescência por espectrofotômetro de luminescência Perkin-Elmer LS50B. Sinal de fluorescência celular por microscópio a laser (LSM 510, Zeiss) e citometria de fluxo (FCM, EPICS XL, Beckman).

Estudo de Liberação de RV

500 μL de solução RV@Ft-RGD em D-tubo (MWCO 6–8 kDa, Novagen), pH ajustado via diferentes tampões. Diálise a 37 °C. Após diferentes tempos de incubação, 1 mL de dialisado removido e substituído por 1 mL de meio fresco. RV liberado determinado por UV-vis. Além disso, RV@Ft-RGD dissolvido em solução de lavagem com diferentes pH (5, 6,5, 7,4, 8,5). Após incubação a 37 °C por 24 h, tamanho das nanopartículas caracterizado por DLS.

Cultura Celular

Células de câncer de pulmão humano A549 e NCI-H358 da Coleção de Células da Academia Chinesa de Ciências, cultivadas em DMEM com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina, 5% CO₂, 37 °C.

Captação e Localização Celular de RV@Ft-RGD

FITC usado para marcar nanopartículas. FITC dissolvido em etanol (2,0 mg/mL) misturado com soluções aquosas de RV@Ft e RV@Ft-RGD (1,0 mg/mL) sob agitação 4 h no escuro a temperatura ambiente. Mistura dialisada em água destilada durante noite para remover FITC e etanol redundantes, resultando em soluções RV@Ft e RV@Ft-RGD marcadas com FITC. Para confirmar localização de organelas, células tratadas com RV@Ft e RV@Ft-RGD marcados com FITC por 5 h e coradas com corante específico de lisossomo Lyso Tracker Red. Internalização celular observada por microscopia confocal a laser (CLSM). Brevemente, células A549 incubadas com RV@Ft e RV@Ft-RGD marcados com FITC (mesma concentração de FITC) por 5 h. Depois, tratadas com Lyso Tracker Red (100 nM) a 37 °C por 30 min. Após lavagem com PBS 3 vezes, observadas por microscópio a laser comercial. Software ImageJ usado para analisar intensidade de fluorescência.

Estudo de Quimioterapia Tumoral In Vitro e Apoptose

Citotoxicidade do carreador Ft-RGD avaliada por ensaio CCK-8 padrão. Células A549 e NCI-H358 (1×10⁵ células/mL, 0,5 mL) semeadas em placa de 96 poços, cultivadas 24 h. Após descartar mídia velha, mídia fresca contendo 0, 0,01, 0,1, 0,5, 1 mg/mL de Ft-RGD incubada com células por 24 h. Células lavadas 3 vezes com PBS. 100 μL de solução de trabalho CCK-8 (10% CCK-8 + 90% DMEM) adicionado a cada poço, incubado 30 min a 37 °C. Absorbância a 450 nm medida por espectrofotômetro de microplacas. Fotografias de cada grupo observadas com microscópio óptico.

Várias concentrações de RV livre, RV@Ft, RV@Ft-RGD e RV@Ft-RGD + RGD (0, 10, 20, 30, 40 μg/mL equivalentes de RV) tratadas com células A549. Após 24 h, viabilidade analisada por CCK-8. Enquanto isso, células tratadas coradas duplamente por kit de detecção de apoptose (Annexin V-FITC/PI) e analisadas por FCM.

Tempo de Circulação de RV@Ft-RGD no Sangue

RV livre ou RV@Ft-RGD (6 mg/kg equivalente RV) injetado intravenosamente em camundongos Balb/c nu saudáveis (n=5 por grupo). Após injeção, sangue venoso coletado em diferentes pontos de tempo em tubo com heparina, plasma separado. Concentração de RV no plasma extraída por reagente isopropanol acidificado, absorbância a 306 nm medida para determinar concentração.

Modelo Animal e Quimioterapia Tumoral In Vivo

Camundongos Balb/c (4-6 semanas) da Charles River Laboratories (Pequim). Todas operações com animais seguem diretrizes de cuidado e uso de animais de laboratório, aprovadas pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Zhengzhou. Para estabelecer modelo de tumor subcutâneo de A549, 2×10⁶ células injetadas subcutaneamente no dorso. Colocados em casa de animais por 7-9 dias. Fórmula de volume tumoral: comprimento × largura²/2.

Camundongos com tumores A549 divididos aleatoriamente em cinco grupos (5 camundongos cada): controle (salina), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD, RV@Ft-RGD. No início do tratamento, amostra injetada uma vez ao dia via veia da cauda por 3 dias consecutivos. Volume tumoral e peso corporal registrados a cada 5 dias. Após 45 dias, tumores coletados, fixados em formalina 10%, seccionados, corados com hematoxilina e eosina (H&E).

Biocompatibilidade In Vivo

200 μL de RV@Ft-RGD injetado em camundongos Balb/c saudáveis via veia da cauda (dose RV 15 mg/kg). Camundongos saudáveis injetados com salina fisiológica como controle. Nos dias 0, 10, 45 após injeção, sangue coletado para contagens celulares: leucócitos (WBC), eritrócitos (RBC), hemoglobina (HGB), volume plaquetário médio (MPV), hemoglobina corpuscular média (MCH), hematócrito (HCT), concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), volume corpuscular médio (MCV), plaquetas (PLT). Além disso, coração, fígado, baço, pulmão e rim coletados no dia 45 para coloração H&E.

Análise Estatística

Dados apresentados como média ± desvio padrão. Análise estatística por teste t de Student, p<0,05 considerado significativo.

Resultados e Discussão

Síntese e Caracterizações de RV@Ft-RGD

Carregamento e liberação de RV de RV@Ft-RGD realizados via desmontagem e remontagem reversível induzida por pH da Ft (Fig. 1). Primeiro, ferritina conjugada com peptídeo alvo tumoral RGD para formar Ft-RGD. Esta redissolvida em tampão acetato (pH=5) para desmontar subunidades polipeptídicas e formar esfera porosa oca. Moléculas de RV adicionadas e permitidas entrar na cavidade, após o que solução ajustada lentamente a pH≈7,4 para remontar Ft, aprisionando RV dentro da cavidade selada. Quando pH diminuído para ~5, poros da nanopartícula abrem reversivelmente e liberam RV. Figura 2a e Arquivo Adicional 1: Figura S1 mostram imagens de MEV e TEM de RV@Ft-RGD montado, exibindo estrutura esférica. Segundo DLS, partículas RV@Ft-RGD tiveram diâmetros maiores (~22,5 nm) comparado a nanopartículas brutas de Ft (~11,8 nm) (Fig. 2b) e potenciais zeta similares (-29,6 mV) (Fig. 2c). Após 20 dias, índice de polidispersão (PDI) de RV@Ft-RGD em água, FBS, meio celular e PBS não mostrou mudança significativa (Fig. 2d), indicando estabilidade coloidal notável. Figura 2e mostra espectros de absorbância de RV livre, Ft-RGD e RV@Ft-RGD. Comparado com RV e Ft-RGD, espectro de RV@Ft-RGD exibiu novo pico a 306 nm (origem do RV), indicando carregamento bem-sucedido. Além disso, RV@Ft-RGD mostrou fluorescência de emissão significativa similar a RV livre a 400 nm, quando excitado por laser 325 nm (Fig. 2f).

Carregamento e Liberação de Fármaco

Capacidade máxima de carregamento de Ft-RGD foi 252,6%, provavelmente devido à grande cavidade dentro da Ft-RGD oca. Como Ft é sensível a pH, caracterizamos capacidade de carregamento de RV sob diferentes condições de pH. Conforme Fig. 3a, com aumento de pH de 5,0 a 8,5, eficiência de carregamento de RV diminuiu drasticamente. Liberação de RV do complexo também caracterizada sob diferentes valores de pH de 5,0 a 8,5. Perfil de liberação dependente de pH e tempo construído a partir desses dados mostrado na Fig. 3b. Máxima taxa de liberação (51,6%) ocorreu a pH=5,0 por 24 h, maior que em pH=6,5, 7,4, 8,5. Segundo relatos, pH 5,0, 6,5, 7,4 correspondem a lisossomos, tecidos tumorais, sangue e ambiente fisiológico normal. Sob condição fisiológica (pH 7,4), conteúdo de RV de RV@Ft-RGD permaneceu alto mesmo após 50 h (Fig. 3c), sugerindo que RV em RV@Ft-RGD é estável e não vaza facilmente. Além disso, investigamos mudança de diâmetro de RV@Ft-RGD sob vários pH. Após incubação a 37 °C por 12 h, DLS mostrou diâmetro quase constante ~23 nm a pH 8,5 e 7,4. Quando pH caiu para 6,5 e 5,0, diâmetro aumentou para 25 nm e 28,6 nm (Fig. 3d). Resultados confirmam comportamento de desmontagem e remontagem reversível induzida por pH de RV@Ft-RGD, benéfico para carregamento controlado in vitro e liberação em tecido tumoral.

Captação e Localização Celular In Vitro

Captação e localização in vitro de RV@Ft-RGD avaliadas. Primeiro, RV@Ft e RV@Ft-RGD marcados por FITC via interação de ligação de hidrogênio e absorção física. Conforme Fig. 4a, células tratadas com FITC livre mostraram sinal de fluorescência citoplasmática desprezível. Células tratadas com RV@Ft-RGD exibiram intensa fluorescência verde FITC, maior que RV@Ft. Notavelmente, células tratadas com RV@Ft-RGD + RGD pré-tratado mostraram baixa fluorescência verde. Concluímos que RV@Ft-RGD foi captado em alta quantidade, provavelmente via efeito alvo ativo mediado por RGD. Essas células também analisadas por FCM, resultados na Fig. 4b. Resultados estatísticos de intensidade de fluorescência celular sugerem conclusão similar.

Para estudar localização organelar de RV@Ft-RGD, corante específico de lisossomo (Lyso Tracker Red) usado para corar células incubadas com nanopartículas. Conforme Fig. 4a, citoplasma mostrou forte fluorescência vermelha em todos grupos. Após fusão com fluorescência verde FITC, RV@Ft-RGD mostrou mais intensa fluorescência amarela (verde+vermelho) no citoplasma. Baseado em análise estatística, grupo RV@Ft-RGD teve maior coeficiente de co-localização entre fluorescência FITC e Lyso Tracker Red (Fig. 4c). Resultados indicam que RV@Ft-RGD entra ativamente nas células e é transferido para ambiente ácido do lisossomo (pH≈5,0). Esses méritos, junto com liberação de fármaco responsiva a pH, dotam RV@Ft-RGD de muitas aplicações potenciais para terapia tumoral in vivo.

Biocompatibilidade e Terapia Tumoral In Vitro

Antes de estudar propriedades antitumorais de RV@Ft-RGD, citotoxicidade do carreador Ft-RGD investigada. Conforme Fig. 5a e Arquivo Adicional 1: Figuras S2 e S3, Ft-RGD não mostrou supressão óbvia de viabilidade em células A549 e NCI-H358 em concentrações até 1 mg/mL. Morfologia celular também não exibiu mudança significativa quando células tratadas com 1 mg/mL comparadas a grupos controle (Fig. 5b), sugerindo que Ft-RGD como carreador tem excelente biocompatibilidade. Conforme Fig. 6a, b, RV livre, RV@Ft e RV@Ft-RGD matam células de maneira dependente de concentração. Células tratadas com RV@Ft-RGD mostraram maior diminuição de viabilidade, com apenas 11,2% viabilidade no grupo 40 μg/mL, menor que RV@Ft e RV@Ft-RGD + RGD pré-tratado. Estudo preliminar com FCM revelou que com RV sozinho, RV@Ft ou RV@Ft-RGD, maioria das mortes celulares mediada via apoptose (Fig. 6c). Resultados demonstram que efeito de morte de células tumorais do RV foi grandemente aprimorado pelo carregamento em Ft-RGD, principalmente devido ao aumento de acúmulo de RV@Ft-RGD no lisossomo, onde condição ácida de pH gatilhou liberação aumentada de RV promotor de apoptose no citoplasma.

Meia-Vida Sanguínea de RV@Ft-RGD

Concentração de RV no plasma sanguíneo em diferentes tempos pós-injeção estudada em grupos RV livre e RV@Ft-RGD. Conforme Fig. 7a, meia-vida sanguínea de RV@Ft-RGD foi 5,1 ± 0,23 h. RV livre teve eliminação mais rápida da circulação, meia-vida de apenas 0,43 ± 0,11 h. Meia-vida significativamente estendida de RV@Ft-RGD no sangue é benéfica para melhorar retenção do fármaco na circulação sistêmica e facilitar acúmulo em sítios tumorais.

Efeito Antitumoral In Vivo e Toxicidade Sistêmica de RV@Ft-RGD

Figura 7b mostra perfil de crescimento tumoral de camundongos portadores de tumor com diferentes tratamentos, expresso como volume tumoral relativo. Crescimento tumoral inibido em algum grau com RV@Ft, provavelmente devido à baixa captação de RV@Ft. No grupo tratado com RV@Ft-RGD, crescimento tumoral foi significativamente suprimido comparado aos outros grupos (controle, RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD). Durante tratamento, não houve perda notável de peso corporal em nenhum grupo (Fig. 7c), indicando alta biossegurança de RV@Ft-RGD. Após fim do tratamento, coloração H&E de tecido tumoral realizada para investigar efeitos quimioterápicos. Conforme Fig. 7d, grande área de apoptose observada em tumores tratados com RV@Ft-RGD, contraste significativo com pequena área de apoptose em tumores tratados com RV livre, RV@Ft e RV@Ft-RGD + RGD. Além disso, toxicidade sistêmica de RV@Ft-RGD avaliada em camundongos normais. Amostras de sangue total de camundongos saudáveis tratados com salina e RV@Ft-RGD coletadas nos dias 0, 10, 45 pós-injeção para análise de sangue. Conforme Fig. 8a, b, contagens sanguíneas completas (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT, MCHC) de camundongos injetados com RV@Ft-RGD não mostraram diferenças significativas do dia 0 ao 45. Órgãos principais de camundongos saudáveis tratados com salina e RV@Ft-RGD também coletados no dia 45 para coloração H&E. Nenhum efeito colateral óbvio encontrado nesses tecidos (Fig. 8c), sugerindo toxicidade adversa a longo prazo desprezível. Todos resultados demonstram potencial promissor de RV@Ft-RGD para quimioterapia anticancerígena aprimorada in vivo.

Conclusão

Em resumo, desenvolvemos com sucesso um sistema de montagem reversível induzido por pH (PIRAS) com carregamento e liberação controláveis por pH do fármaco antitumor RV para quimioterapia tumoral direcionada aprimorada. Sob condição ácida (pH=5,0), sistema pode desmontar e carregar ou liberar RV, enquanto sob condição neutra (pH=7,4), RV@Ft-RGD é altamente estável e mostra vazamento de fármaco desprezível. Através do efeito alvo mediado por RGD, RV@Ft-RGD pode ser captado em altas concentrações por células A549 e acumular no lisossomo, benéfico para liberação de RV in vitro e in vivo. Devido ao acúmulo de RV@Ft-RGD no lisossomo e liberação de RV gatilhada pelo pH ácido do lisossomo no citoplasma, RV@Ft-RGD mostrou excelente efeito de morte de células tumorais e promoção de apoptose comparado a RV livre. Além disso, após carregamento de RV em Ft-RGD, RV@Ft-RGD mostrou meia-vida sanguínea muito maior que RV livre. Resultados in vivo demonstram que RV@Ft-RGD suprime tumores notavelmente e sem toxicidade sistêmica perceptível. Este estudo sugere que PIRAS baseada em Ft é altamente eficiente em carregamento e liberação de fármaco para terapia anticancerígena aprimorada.