Tetraedros de DNA modificados por Gint4.T carregados com doxorrubicina inibem a proliferação de células de glioma por segmentação PDGFRβ

Resumo

O glioma é um dos tumores cerebrais intrínsecos mais mortíferos devido ao seu crescimento invasivo. O efeito do tratamento do glioma é fraco devido à presença da barreira hematoencefálica e da barreira hematológica do tumor e direcionamento insuficiente do medicamento. Os tetraedros de DNA (TDN) apresentam grande potencial para entrega de drogas e podem ser uma nova estratégia terapêutica para glioma. Neste estudo, usamos TDN para entregar doxorrubicina (DOX) para a terapia de glioma. Gint4.T, um aptâmero que poderia reconhecer o receptor β do fator de crescimento derivado de plaquetas em células tumorais, foi usado para modificar o TDN (Apt-TDN) para a entrega de drogas direcionadas. Os TDN foram automontados por síntese em uma etapa, que apresentou tamanho pequeno (10 nm) e carga negativa. O teste de soro fetal bovino mostrou estabilidade como veículo de liberação do fármaco. O Apt-TDN pode ser efetivamente absorvido pelas células U87MG. Comparado com DOX e DOX @ TDN (TDN carregado com DOX), o DOX @ Apt-TDN (Gint4.T-TDN modificado carregado com DOX) mostrou maior taxa de apoptose precoce, maior parada do ciclo celular e maior citotoxicidade para células U87MG. Em conclusão, nossos resultados indicaram que DOX @ Apt-TDN fornece uma nova terapia com aplicação clínica promissora para pacientes com gliomas.

Introdução

O glioma, um tumor derivado do neuroepitélio, é a malignidade intracraniana mais comum. Quase 1/3 de todos os tumores cerebrais são gliomas e aproximadamente 4/5 dos tumores cerebrais malignos primários são gliomas [1,2,3,4]. Atualmente, o tratamento mais eficaz para o glioma é a ressecção cirúrgica e a quimiorradioterapia concomitante no pós-operatório, mas, infelizmente, o prognóstico para os pacientes permanece ruim. A quimioterapia tradicional para glioma não mostra um bom resultado devido ao direcionamento insuficiente do tumor, complicações devido à barreira hematoencefálica (BBB) e barreira do tumor sanguíneo (BTB) e direcionamento insuficiente do medicamento. A BBB é o fator mais importante que impede a entrega de quase todas as macromoléculas (incluindo drogas e genes) ao parênquima cerebral e seu funcionamento adequado. Os medicamentos que não podem cruzar a BBB devem ser administrados em doses suficientemente altas para atingir uma concentração de tratamento eficaz na área de interesse. No entanto, o excesso de drogas pode causar efeitos colaterais sistêmicos graves e acúmulo de drogas indesejadas em tecidos não afetados. Além disso, os medicamentos anti-glioma convencionais existentes têm capacidade insuficiente de direcionamento [3, 4]. Nanopartículas surgiram como a ferramenta de transporte de drogas mais promissora. Por causa de sua vantagem de tamanho, as nanopartículas podem cruzar a BBB e exercer um efeito antitumor. Kafa et al. [5] projetaram nanotubos de carbono de paredes múltiplas funcionalizados quimicamente (f-MWNTs) visando ANG e confirmaram sua capacidade de cruzar a BBB por meio de experimentos in vivo e in vitro. Porém, esses nanomateriais podem ser distribuídos para vários órgãos do corpo ou até mesmo entrar no sistema nervoso central (SNC), onde podem causar neurotoxicidade [6].

O DNA é um material ideal para a construção de nanoestruturas porque sua montagem pode ser controlada com precisão pelo emparelhamento de bases de Watson-Crick [7]. Até o momento, uma série de nanoestruturas de DNA bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) foram projetadas e demonstradas [8,9,10]. As nanoestruturas tetraédricas de DNA (TDN) têm atraído atenção significativa devido à sua biocompatibilidade, estabilidade, locais de modificação funcionalizados abundantes e baixa imunogenicidade [11,12,13]. Turberfield et al. nanoestruturas tetraédricas de DNA sintetizadas com alto rendimento usando um método de síntese em uma etapa [14]. Walsh et al. descobriram que um tetraedro de DNA contendo uma sonda de ácido nucléico poderia entrar em células de mamíferos sem a necessidade de reagente de transfecção [15]. Lee et al. demonstraram que nanopartículas tetraédricas automontadas podem ser usadas para entrega de siRNA direcionada in vivo [16]. A TDN tem mostrado excelentes perspectivas de aplicação em diagnóstico molecular, distribuição molecular e terapia com drogas direcionadas. Eles também são amplamente utilizados na pesquisa de tumores em vários órgãos, como o câncer de mama [17]. Da mesma forma, o TDN também tem sido usado no estudo de doenças do sistema nervoso. Tian et al. [18] usaram tetraedros de DNA como base e os modificaram com angiopep-2 (ANG) para construir com sucesso a nanossonda ANG-TDN, que poderia ter como alvo a proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP-1) para imagens direcionadas. A pesquisa mostrou que ANG-TDN pode cruzar o BBB. Ma et al. [19] sugeriram que nanoestruturas tetraédricas de DNA podem entrar nas células-tronco neurais (NSCs) sem a necessidade de agentes de transfecção, onde promovem a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco neurais [20] e têm grande potencial para regeneração e reparo do tecido neural . Portanto, investigamos a possibilidade do uso de TDN na terapia de glioma e aumentando sua capacidade de direcionamento.

O receptor β do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRβ) é um membro importante da família da proteína tirosina quinase que está envolvida na proliferação celular, migração e angiogênese. Vários estudos demonstraram que o PDGFβ é um alvo promissor para terapias antitumorais devido ao seu papel na angiogênese [21, 22]. Aptâmeros são oligonucleotídeos de DNA ou RNA de fita simples curtos que são produzidos pela evolução sistemática de ligantes pelo método de enriquecimento exponencial (SELEX). Os aptâmeros são semelhantes aos anticorpos, que possuem alta afinidade e especificidade em relação aos seus alvos [23]. Devido às suas propriedades únicas, os aptâmeros desempenham um papel importante na distribuição direcionada de agentes quimioterápicos, siRNAs e nanopartículas carregadas de drogas. Gint4.T, um aptâmero de RNA que pode se ligar especificamente a PDGFRβ, também é um antagonista específico de PDGFRβ [24]. Monaco et al. [25] sugeriu que os aptâmeros Gint4.T podem cruzar a barreira hematoencefálica (BBB) e reconhecer especificamente PDGFRβ. Nanopartículas poliméricas conjugadas com Gint4.T (PNPs) podem ser prontamente absorvidas por células de glioblastoma (GBM). Neste estudo, relatamos um novo sistema carregado de droga que combina o aptâmero Gint4.T e o TDN. O TDN modificado por Gint4.T (Apt-TDN) carregado com DOX (DOX @ Apt-TDN) exibiu captação celular específica aumentada e citotoxicidade contra células U87MG.

Métodos

Materiais

Todos os oligonucleotídeos de DNA e oligonucleotídeos de RNA 2'F-Py foram adquiridos da Sangon Biotech (Shanghai, China), e todas as sequências de oligonucleotídeos estão listadas na Tabela 1. A solução de coloração de gel de DNA GelRed foi adquirida da Sangon Biotech. Tanto o soro fetal bovino (FBS) quanto o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) foram adquiridos da Thermo Fisher (Nova York, EUA). A doxorrubicina (DOX) foi adquirida da Mengbio Technology (Chongqing, China). As células U87MG foram adquiridas na Biblioteca de Células da Academia de Ciências de Xangai (Xangai, China). O DAPI foi adquirido da Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Pequim, China).

Preparação de nanoestruturas de DNA

Para montar o tetraedro de DNA (Tabela 1), 2 μL de cada oligonucleotídeo (S1, S2, S3 e S4) foram adicionados a 42 μL de tampão TM (Tris-HCl 10 mM, MgCl 5 mM ₂ , pH =8). A solução de DNA foi então aquecida a 95 ° C por 5 min e subsequentemente resfriada a 4 ° C por 2 min usando uma máquina de PCR Bio-Rad (Califórnia, EUA) [26, 27]. A concentração final de TDN foi de 2 μM. TDN 'foi preparado da mesma maneira, exceto S1 foi substituído por S1'. Para sintetizar o Apt-TDN, o aptâmero Gint4.T foi adicionado ao TDN em uma razão molar igual, e a mistura foi incubada a 37 ° C durante 60 min. Antes da síntese, o aptâmero foi submetido a uma curta etapa de desnaturação-renaturação (85 ° C por 5 min, resfriamento rápido por 2 min e subsequente aquecimento a 37 ° C por 10 min) [25].

Eletroforese em gel de agarose

Um gel de agarose (3%) foi executado em 0,5 × tampão TEB a 100 V por 30 min. A temperatura do aparelho de eletroforese foi mantida a 0 ° C colocando o aparelho em um banho de gelo. Antes da eletroforese, GelRed foi adicionado ao gel de agarose para corar as fitas de DNA. Quando o processo foi concluído, um scanner de fluorescência Bio-Rad (Califórnia, EUA) foi usado para capturar uma imagem do gel.

Difusão dinâmica de luz

Um Malvern Zetasizer ZS90 (Malvern, Reino Unido) foi usado para medir o tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta do TDN. Um total de 1 mL do TDN (100 nM) foi submetido a análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS).

Imagens de microscopia de força atômica

O TDN foi diluído para 100 nM com tampão TM (tampão Tris-HCl contendo MgCl ₂ ) Em seguida, 10 μL de cada amostra de TDN foram adicionados à mica recém-clivada e incubados por 10 min. As amostras foram posteriormente fotografadas em um instrumento de microscopia de força atômica (AFM) no modo AC (Agilent 5500, EUA).

Medição da capacidade de carga de drogas do TDN preparado

A doxorrubicina foi dissolvida em água desionizada para fazer uma solução de armazenamento de 500 μM. A doxorrubicina em diferentes concentrações (1 a 20 μM) foi misturada com TDN (100 nM) ou Apt-TDN (100 nM) por 6 h em temperatura ambiente (24-26 ° C). As soluções misturadas foram então centrifugadas a 12.000 × g por 10 min para obter o TDN carregado com a droga. Em seguida, 50 μL dos sobrenadantes foram removidos e misturados com PBS na proporção de 1:1. Um leitor de microplaca Varioskan LUX (Califórnia, EUA) foi usado para medir a intensidade de fluorescência da doxorrubicina ( λ _ex =480 nm e λ _em =590 nm) para determinar a quantidade de doxorrubicina nos sobrenadantes [28]. A concentração de doxorrubicina carregada no TDN foi calculada pela curva padrão e intensidade de fluorescência. Também misturamos a doxorrubicina com o TDN em proporções molares crescentes.

Estabilidade sérica do TDN in vitro

Os TDN foram misturados com meio completo e incubados a 37 ° C durante 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 24 h. As soluções de TDN foram misturadas com FBS na proporção de 1:1 e incubadas a 37 ° C por 1, 3, 5 ou 7 h. Após a incubação, as misturas foram corridas em gel de agarose a 3%.

Citotoxicidade do TDN in vitro

Para determinar a citotoxicidade do TDN, células U87MG a uma concentração de 1 × 10 ⁴ células / poço foram semeadas em uma placa de 96 poços. O meio de cultura de células foi removido e meio fresco contendo 0-500 nM de TDN foi adicionado e incubado por mais 24 horas e 48 horas após a incubação durante a noite. Em seguida, 10 μL de solução de CCK-8 foram adicionados a cada poço e a mistura foi incubada por 1 h. A absorbância a 450 nm foi então medida usando um leitor de microplacas.

Imagem de fluorescência

A absorção celular de DOX e TDN foi estudada por microscopia de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão). As células U87MG foram semeadas em lamelas em placas de 24 poços com meio contendo 10% de soro fetal bovino inativado por calor e 1% de penicilina e estreptomicina e cultivadas por pelo menos 1 dia a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO ₂ até que as células atingissem pelo menos 75% de confluência. Após a incubação, os meios de cultura foram removidos. Meios completos contendo 100 nM Cy3-TDN e Cy3-Apt-TDN foram adicionados e incubados por 3 h. TDN e Apt-TDN foram marcados com Cy3 para detectar a absorção intercelular de nanopartículas. Para avaliar a absorção celular de DOX, DOX (DOX 2 μM), DOX @ TDN (DOX 2 μM) e DOX @ Apt-TDN (DOX 2 μM) foram adicionados às células U87MG e incubados por 3 h. Após 3 h de tratamento, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 min no escuro e subsequentemente coradas com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 min. As células foram lavadas com PBS três vezes e observadas em microscópio de fluorescência.

Citometria de fluxo

Um total de 1 × 10 ⁶ As células U87MG foram implantadas em placas de 6 poços. Após a incubação durante a noite, os meios de cultura foram removidos e os meios suplementados com 100 nM Cy3-TDN, 100 nM Cy3-Apt-TDN ou 100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 μM de Apt livre foram adicionados e incubados por 3 h. Em seguida, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% por 20 min, e a citometria de fluxo foi utilizada para analisar os percentuais de células Cy-3-positivas.

Ciclo celular e apoptose

Após o tratamento com DOX, DOX @ TDN ou DOX @ Apt-TDN por 24 h, 5 × 10 ⁵ as células foram recolhidas e fixadas em etanol gelado a 75% durante a noite. Em seguida, as células foram incubadas com RNase e iodeto de propídio por 30 min a 37 ° C no escuro. O ciclo celular foi investigado por citometria de fluxo. Além disso, após os diferentes tratamentos, as células foram coradas com Anexina V-FITC / DAPI, e a apoptose precoce foi explorada.

Ensaios CCK-8

Para determinar a viabilidade celular, células U87MG (5 × 10 ³ ) foram semeados em placas de 96 poços com 100 μL de meio e cultivados durante a noite a 37 ° C sob uma atmosfera contendo 5% de CO ₂ . O meio foi subsequentemente removido e meio fresco contendo DOX, DOX-TDN ou DOX-Apt-TDN foi adicionado. Após 24 h de incubação, 10 μL de solução de CCK-8 foram adicionados e as células foram cultivadas por mais 1 h. Um leitor de microplaca foi usado para medir a absorbância a 450 nm.

Análise estatística

Todos os experimentos neste estudo foram realizados em triplicata e todos os dados são apresentados como o valor médio com seu desvio padrão (média ± DP). A análise estatística foi realizada por meio do programa SPSS 24.0 (IBM, EUA). Diferenças significativas foram determinadas usando t de Student teste, com P <0,05 indicando diferenças significativas entre os grupos.

Resultados

Síntese e caracterização do TDN e Apt-TDN

O TDN foi automontado a partir de quatro oligonucleotídeos (Tabela 1) por meio de síntese de uma única etapa, conforme relatado anteriormente [18, 29]. O aptâmero de direcionamento de tumor Gint4.T foi usado para modificar o TDN por meio do emparelhamento de bases de Watson-Crick. O tetraedro de DNA contém quatro faces, com cada face formada por um oligonucleotídeo. Assim, quatro oligonucleotídeos hibridizaram entre si para formar um tetraedro de DNA (Fig. 1a). A análise de eletroforese em gel mostrou uma única banda proeminente nas pistas 4 e 5, sugerindo que o TDN e o Apt-TDN foram construídos com sucesso. A mobilidade do Apt-TDN foi diminuída em comparação com a do TDN, sugerindo que o aptâmero Gint4.T modificou com sucesso o TDN.

a Síntese do tetraedro de DNA e Gint4.T-TDN. Pista 1:S1; pista 2:S1 + S2; pista 3:S1 + S2 + S3; pista 4:S1 + S2 + S3 + S4 (TDN); pista 5:TDN misturado com cauda Apt (Gint4.T); Apt-TDN. A pista 1 não era visível porque os corantes de ácido nucléico não podem corar adequadamente o DNA de fita simples. b As imagens AFM mostraram que as alturas do TDN e do Apt-TDN eram de ~ 2 nm. c Determinação do tamanho de partícula e potencial zeta do TDN e Apt-TDN por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Os tamanhos médios de partícula do TDN e Apt-TDN foram de 10,10 nm (A) e 13,54 nm (B), respectivamente. Os potenciais zeta médios do TDN e Apt-TDN foram - 5,69 mV (C) e - 7,3 mV (D), respectivamente

Os tamanhos do TDN e do Apt-TDN foram determinados por DLS e AFM. O TDN e o Apt-TDN mostraram tamanhos de partícula de 10,1 nm e 13,5 nm, respectivamente, refletindo a adição do ligante Gint4.T (Fig. 1c (A), (B)). Como o diâmetro hidrodinâmico inclui moléculas de água, as partículas eram maiores do que seus tamanhos teóricos. As alturas de TDN e Apt-TDN determinadas por imagens AFM foram ~ 2 nm (Fig. 1b), indicando que a modificação do aptâmero não alterou a estrutura 3D. Os potenciais zeta médios do TDN e Apt-TDN foram - 5,69 mV (C) e - 7,3 mV (D), respectivamente (Fig. 1c (C) (D)). Com base nesses parâmetros, concluímos que o TDN e o Apt-TDN foram montados com sucesso.

Estabilidade e citotoxicidade do TDN in vitro

A análise de eletroforese em gel mostrou que o TDN permaneceu intacto quando incubado em meio completo por 24 h a 37 ° C (Fig. 2a (A)). Além disso, quando a concentração de soro fetal bovino foi aumentada para 50%, o NDT permaneceu estável por pelo menos 7 h (Fig. 2a (B)), o que é consistente com relatórios anteriores [18, 26]. Para determinar a citotoxicidade da nanoestrutura, o ensaio CCK-8 foi usado para avaliar a viabilidade celular de células U87MG após o tratamento com o TDN em várias concentrações. Conforme mostrado na Fig. 2b, nenhuma citotoxicidade significativa foi observada em células U87MG tratadas com TDN a 0–500 nM por 24 he 48 h. Portanto, as nanopartículas de DNA podem ser usadas como transportadores estáveis e biosseguros para a entrega de drogas.

a A eletroforese em gel mostrou que o TDN permaneceu estável por 24 h em meio completo a 37 ° C (A); o NDT permaneceu estável por 7 h quando a concentração de soro fetal bovino foi aumentada para 50% (B). b As células U87MG foram co-cultivadas com o TDN em diferentes concentrações (10–500 nM) por 24 he 48 h. O ensaio CCK-8 mostrou que a atividade das células U87MG não foi afetada, o que indicou a biossegurança do TDN

Capacidade de carga de drogas do TDN e Apt-TDN

A doxorrubicina é uma droga quimioterápica de amplo espectro que pode se intercalar em fitas duplas de DNA. Calculamos uma curva padrão de doxorrubicina (Fig. 3a) e, em seguida, investigamos a intercalação da doxorrubicina no NDT. A quantidade de doxorrubicina intercalada no TDN e no Apt-TDN aumentou gradualmente com o aumento da concentração de doxorrubicina. Quando a concentração de doxorrubicina era de 14 μM, a quantidade de doxorrubicina intercalada no TDN e Apt-TDN atingiu o pico em 5,5 μM e 6,0 μM, respectivamente, e subsequentemente atingiu um platô (Fig. 3b), indicando que as fitas de DNA estavam totalmente ocupadas. Enquanto isso, misturamos a doxorrubicina com o TDN em proporções molares crescentes. O espectro de fluorescência da doxorrubicina foi varrido para análise. Conforme mostrado na Fig. 3c, o espectro de fluorescência da doxorrubicina foi extinto com a doxorrubicina a uma razão molar de 0,05. Com base nessas descobertas, concluímos que aproximadamente 55 moléculas de doxorrubicina estavam contidas em um único TDN, enquanto 60 moléculas estavam contidas em um único Apt-TDN.

a Uma curva padrão de concentrações de DOX em tampão PBS; λex =480 nm e λem =590 nm. A quantidade de DOX transportada pelo TDN e Apt-TDN. b DOX intercalado no DNA de fita dupla do TDN e Apt-TDN. Quando a concentração de DOX atingiu 14 μM e a concentração de DOX intercalada no TDN e Apt-TDN atingiu o pico em 5,5 μM e 6,0 μM, respectivamente, um único tetraedro de DNA poderia carregar 55 moléculas Dox, enquanto um único tetraedro de DNA modificado por aptâmero carregava 60 DOX moléculas. c Espectros de fluorescência de DOX no sobrenadante. A doxorrubicina foi misturada com o TDN em razões molares crescentes (0, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01 e 0,05 de cima para baixo). Quando a razão molar foi de 1:20, a fluorescência foi extinta

Captação celular direcionada do Apt-TDN

O DNA é uma macromolécula carregada negativamente, o que dificulta sua entrada na membrana celular carregada negativamente. Normalmente, as moléculas de DNA individuais devem acessar as células com a ajuda do reagente de transfecção. Aqui, marcamos TDN e Apt-TDN com Cy3 para monitorar a absorção intracelular das nanopartículas. Após incubação com células U87MG por 3 h, o sinal vermelho de fluorescência Cy3 emergiu no citoplasma celular, indicando que o TDN se ligou à citomembrana e foi absorvido pela célula sem a ajuda de agentes de transfecção (Fig. 4a). O Apt-TDN apresentou maior fluorescência vermelha, o que sugere que a presença do aptâmero Gint4.T aumentou significativamente a captação de DNA tetraedro pelas células U87MG. No entanto, quando o aptâmero livre foi adicionado, a fluorescência Cy3 diminuiu para o nível observado para o TDN sozinho. Devido à inibição competitiva pelo aptâmero livre, inferimos que o aptâmero no TDN não poderia facilitar a absorção do TDN. Com base nesta inibição competitiva, provamos que o Apt-TDN pode ter como alvo células U87MG. A citometria de fluxo provou ainda que a porcentagem de células U87MG positivas para Cy3 era maior no grupo Apt-TDN do que no grupo TDN. O Apt livre diminuiu a porcentagem de células U87MG positivas para Cy3 no grupo Apt-TDN (Fig. 4b).

a Captação de células U87MG do TDN e Apt-TDN (TDN-Gint4.T). O TDN entrou nas células U87MG diretamente sem agentes de transfecção, e a absorção de Apt-TDN (ligado ao aptâmero Gint4.T) foi significativamente aumentada e inibida competitivamente por Apt livre (Gint4.T), indicando que o aptâmero Gint4.T desempenha um papel significativo na segmentação celular. A barra de escala representa 50 μm. b As curvas de citometria de fluxo mostram a absorção intracelular de TDN, Apt-TDN e Apt-TDN + Apt após incubação por 3 h

Captação celular de DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN

Utilizamos o espectro de fluorescência característico da doxorrubicina para avaliar a eficiência de absorção do medicamento. Após 3 h de tratamento, a doxorrubicina intracelular foi fotografada por microscopia de fluorescência (Fig. 5a). A doxorrubicina livre podia entrar nas células U87MG e estava localizada no núcleo. Com a adição do DOX @ TDN, a fluorescência foi superior à da doxorrubicina livre. Este resultado sugere que as nanopartículas de DNA aumentam a absorção celular da doxorrubicina. Quando DOX @ Apt-TDN foi adicionado, o sinal vermelho no núcleo foi ainda maior do que o das células às quais DOX @ TDN foi adicionado. A análise semiquantitativa da captação intracelular de DOX confirmou ainda que o Apt-TDN facilitou um aumento de mais de duas vezes na captação intracelular de DOX em comparação com aquele para o único fármaco. Inferimos que isso se deve à ligação específica do Gin4.T aos receptores, após a qual mais nanopartículas podem entrar na célula. Após a digestão nos lisossomos, a doxorrubicina pode ser liberada no citoplasma e outras funções no núcleo.

a Captação celular de DOX, DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN. Modificado com o aptâmero Gint4.T, o Apt-TDN poderia entregar mais doxorrubicina às células U87MG do que o TDN. Além disso, o TDN pode transportar mais fármaco para as células do que o fármaco sozinho. As barras de escala indicam 50 μm. b Análise semiquantitativa da intensidade de fluorescência da doxorrubicina com tratamento PBS, DOX, DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN (em comparação com o branco:* p <0,05, ** p <0,01)

Citotoxicidade de DOX, DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN

Para o estudo de citotoxicidade, três grupos de células U87MG foram tratados com diferentes concentrações de doxorrubicina (Fig. 6a). O IC ₅₀ os valores para a doxorrubicina foram 13,39 μM para o tratamento DOX, 7,826 μM para o tratamento DOX @ TDN e 4,205 μM para o tratamento DOX @ Apt-TDN. Entre os três tratamentos, o DOX @ Apt-TDN apresentou a maior citotoxicidade às 24 h, o que indicou a especificidade do Apt-TDN para células U87MG. Após 24 h, as células nos grupos DOX, DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN foram coletadas e usadas para explorar a apoptose precoce. Nossos dados demonstraram que a taxa de apoptose precoce foi maior no grupo DOX @ Apt-TDN do que nos outros dois grupos (Fig. 6b). Além disso, a proporção de células na fase G0 / G1 foi aumentada no grupo DOX-Apt-TDN em comparação com os grupos DOX e DOX-TDN ( p <0,01), e a proporção de células na fase S diminuiu no grupo DOX-Apt-TDN ( p <0,01) (Fig. 6c). A porcentagem de células na fase G2 não foi alterada (dados não mostrados).

a Citotoxicidade de DOX, DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN em várias concentrações. A taxa de inibição das células U87MG aumentou significativamente com o aumento da concentração de DOX, mas os grupos DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN exibiram citotoxicidade significativamente aumentada em comparação com o grupo DOX. A taxa de inibição celular do grupo DOX @ Apt-TDN também foi significativamente maior do que a do grupo DOX @ TDN (em comparação com DOX, ** p < 0,05; em comparação com DOX, *** p <0,01; em comparação com DOX @ Apt-TDN, ^# p <0,05). b Apoptose de células U87MG após incubação com PBS, DOX, DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN por 24 h. c Histogramas de citometria de fluxo do ciclo celular U87MG após incubação com PBS, DOX, DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN por 24 h (em comparação com o controle, ** p < 0,05; em comparação com o controle, *** p <0,01; em comparação com DOX @ Apt-TDN, ^# p <0,01)

Discussão

Seja por meio de experimentos in vitro ou in vivo, a estabilidade de um medicamento e de seu portador deve ser determinada. Após a montagem do TDN, sua estabilidade foi primeiro determinada in vitro. Este estudo mostrou que a estrutura 3D das nanopartículas de DNA pode melhorar sua estabilidade no soro, inibindo a ligação da enzima. A segurança biológica da nanoestrutura relevante é o requisito mais importante para sua aplicação. Nenhuma citotoxicidade significativa foi observada em células U87MG co-cultivadas com várias concentrações do TDN por 24 h ou 48 h. Nenhuma das sequências de DNA usadas neste estudo codifica qualquer informação genética, e nenhum efeito colateral foi relatado no teste de citotoxicidade. Portanto, o TDN pode servir como um transportador de droga seguro e estável.

A eficiência de direcionamento de uma nanoestrutura modificada por aptâmero é crucial para a entrega seletiva de drogas às células cancerosas. Ao contrário dos anticorpos, os aptâmeros são quimicamente estáveis, baratos e podem ser produzidos em massa. Além disso, ao contrário de outros materiais, aptâmeros podem facilmente ligar um tetraedro de DNA usando o princípio da base complementar. Assim, a combinação de aptâmeros e tetraedros de DNA estabelece a base para a entrega de drogas direcionadas e tratamentos de próxima geração. Nossos resultados mostraram que o TDN poderia entrar nas células sem agentes de transfecção, o que é semelhante aos resultados de Walsh et al. e Ma et al. [15, 19]. Em comparação com a do TDN, a absorção do Apt-TDN pelas células U87MG foi significativamente aumentada. Após a adição do aptâmero livre, esse aumento desapareceu. Este resultado sugere que Gint4.T é um antagonista específico de PDGFRβ [25]. Nosso estudo demonstrou que o aptâmero Gint4.T pode ter como alvo as células U87MG devido à alta expressão de PDGGRβ na superfície das células de glioma. Camorani et al. [24] também mostraram que o aptâmero Gint4.T poderia ter como alvo as células tumorais interagindo especificamente com o domínio extracelular de PDGFRβ. As vantagens do direcionamento ao aptâmero Gint4.T foram demonstradas até certo ponto por meio de estudos in vitro, mas mais testes in vivo são necessários para confirmar esses achados. Este estudo também confirmou que o DOX @ Apt-TDN é mais citotóxico do que o DOX ou o DOX @ TDN, que provavelmente se origina de dois fatores. Em primeiro lugar, o aptâmero Gint4.T pode ligar-se especificamente a domínios extracelulares de PDGFR, bloqueando a proliferação de células tumorais e inibindo o crescimento de células tumorais [24]. Isso é consistente com nossos resultados experimentais. Em comparação com o grupo de controle, o ciclo celular U87MG muda após o tratamento com DOX, DOX @ TDN e DOX @ Apt-TDN aumentou significativamente nas células tumorais da fase G0 / G1, diminuiu nas células da fase S e bloqueou as células tumorais no G0 Fase / G1, indicando que podem inibir o ciclo celular das células U87MG e inibir sua proliferação. Comparado com os grupos DOX e DOX @ TDN, o grupo DOX @ Apt-TDN tinha uma capacidade significativamente mais forte de inibir a proliferação de células U87MG. Além disso, Gint4.T liga especificamente células tumorais e aumenta o direcionamento de células do complexo DOX @ Apt-TDN. Assim, podemos aumentar a eficiência do direcionamento do medicamento e reduzir a dose de administração sistêmica de medicamentos antitumorais para prevenir seus efeitos colaterais sistêmicos.

Conclusões

A modificação com Gint4.T aumentou a especificidade e eficiência do TDN no tratamento de glioma ao direcionar o PDGFRβ que é expresso em grandes quantidades nas células de glioma. Além disso, quando carregado com Apt-TDN, pode promover significativamente os efeitos anti-glioma do DOX. Portanto, DOX @ Apt-TDN pode servir como uma estratégia terapêutica promissora contra glioma para pacientes. A deficiência deste estudo é que ele só foi verificado in vitro. No estudo posterior, exploraremos mais detalhadamente os modelos animais.

Disponibilidade de dados e materiais

Os dados relevantes estão incluídos no artigo.

Abreviações

BBB:: Barreira hematoencefalica
BTB:: Barreira de tumor de sangue
TDN:: Nanoestruturas tetraédricas de DNA / tetraedros de DNA
DOX:: Doxorrubicina
PDGFRβ:: Receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β
Apt-TDN:: TDN modificado por Gint4.T
DOX @ TDN:: TDN carregado com DOX
DOX @ Apt-TDN:: TDN modificado por Gint4.T carregado com DOX
CNS:: Sistema nervoso central
ANG:: Angiopep-2
LRP-1:: Low-density lipoprotein receptor-related protein 1
SELEX:: Exponential enrichment
PNPs:: Polymeric nanoparticles
GBM:: Glioblastoma
FBS:: Foetal bovine serum
DMEM:: Meio Eagle modificado por Dulbecco
DLS:: Espalhamento de luz dinâmico
AFM:: Força atômica microscópica
CCK-8:: Cell Counting Kit-8
Cy3:: Sulfo-Cyanine3
DAPI:: 4′,6-Diamidino-2-phenylindole

Compreendendo a atividade antibacteriana fotocatalítica estrutural-dependente:um estudo de caso de BiVO4 modificado por Ag Estudo teórico e experimental sobre AlGaN / GaN Schottky Barrier Diode em substrato de Si com dupla heterojunção

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