Efeitos do fulereno C60 na interação de difenil-N- (tricloroacetil) -amidofosfato com DNA em silico e sua atividade citotóxica contra linha celular leucêmica humana in vitro

Resumo

Novo representante de carbacilamidofosfatos - difenil-N- (tricloroacetil) -amidofosfato (HL), que contém dois substituintes fenoxi perto do grupo fosforil, foi sintetizado, identificado por análise elementar e espectroscopia IR e NMR, e testado como um agente citotóxico em si e em combinação com C ₆₀ fulereno.

De acordo com os resultados da simulação molecular, C ₆₀ fulereno e HL podem interagir com DNA e formar um complexo rígido estabilizado por empilhamento de interações de grupos fenil HL com C ₆₀ fulereno e nucleotídeo G de DNA, bem como por interações de HL CCl ₃ agrupar por ligações íon-π com C ₆₀ molécula e por ligações eletrostáticas com o DNA G nucleotídeo.

Com o uso do teste de MTT, a atividade citotóxica de HL contra células leucêmicas CCRF-CM humanas com IC ₅₀ valor detectado na concentração de 10 μM em 72 h de tratamento de células foi mostrado. Sob ação combinada de 16 μM C ₆₀ fulereno e HL, o valor de IC ₅₀ foi detectado na concentração inferior de 5 μM de HL e no período anterior de incubação de 48 h, além do efeito citotóxico do HL foi observado em uma concentração baixa de 2,5 μM na qual o HL por si só não teve influência na viabilidade celular. Vinculação de C ₆₀ fulereno e HL com sulco de DNA menor com formação de um complexo estável é considerado uma das possíveis razões de sua inibição sinérgica da proliferação de células CCRF-CЕM.

Aplicação de C ₆₀ O fulereno em combinação com 2,5 μM HL demonstrou não ter efeito prejudicial na estabilidade estrutural da membrana dos eritrócitos sanguíneos. Assim, ação combinada de C ₆₀ o fulereno e o HL em uma baixa concentração potencializaram o efeito citotóxico do HL contra as células leucêmicas humanas e não foram seguidos pelo efeito hemolítico.

Histórico

O representante da nanoestrutura de carbono C ₆₀ o fulereno apresenta propriedades físico-químicas únicas e atividade biológica não apenas como antioxidante ou fotossensibilizador, mas também como modificador do efeito tóxico de drogas anticâncer devido à sua capacidade de penetrar no interior da célula e funcionar como transportador de drogas [1,2,3,4 ] C ₆₀ molécula pode interagir com drogas quimioterápicas, como doxorrubicina, cisplatina e paclitaxel e pode formar complexos com eles aumentando o efeito terapêutico [5,6,7,8].

Os carbacilamidofosfatos (CAPh) são moléculas orgânicas que têm chamado a atenção por sua estrutura particular, atividade biológica e perspectivas de aplicação biomédica [9,10,11,12]. A presença de grupos peptídicos e fosforamida combinados no fragmento C (O) N (H) P (O) da molécula determina sua interação com moléculas biológicas e membranas celulares. A variação de substituintes perto dos grupos fosforil e carbonil dá a possibilidade de modular as propriedades estereoquímicas e farmacológicas de CAPh. Em particular, foi demonstrado que diferentes representantes do CAPh possuem atividade antineoplásica [13, 14].

Recentemente, confirmamos que o dimetil-N- (benzoil) -amidofosfato representativo do CAPh usado na faixa de concentrações milimolares diminuiu a viabilidade das células leucêmicas L1210 e que seu efeito tóxico foi facilitado por C ₆₀ fulereno [15]. Mostramos também que a introdução de substituintes aromáticos adicionais e CCl eletronegativo ₃ grupo na estrutura CAPh resultou no aumento de sua toxicidade [16]. Assim, o efeito tóxico significativo de dimorfolido-N-tricloroacetilfosforamida foi demonstrado contra células leucêmicas humanas de origem diferente, mas sua concentração efetiva ainda era alta e nenhum aumento de toxicidade após ação combinada com C ₆₀ fulereno foi observado. Na continuação dessas investigações, sintetizamos um novo representante do CAPh difenil-N- (tricloroacetil) -amidofosfato (HL) que possui dois substituintes fenoxi em vez de grupos morfolido próximos ao grupo fosforil (Fig. 1).

O objetivo da pesquisa foi estimar a atividade biológica de difenil-N- (tricloroacetil) -amidofosfato (HL) sozinho ou em combinação com C ₆₀ fulereno com o uso de análise in silico de sua interação com DNA e estudo in vitro de efeitos citotóxicos contra linhagem de células leucêmicas humanas.

Métodos / Experimental

Químicos

RPMI 1640 meio líquido, soro fetal bovino (FBS), penicilina / estreptomicina e L-glutamina (Biochrom, Alemanha), dimetilsulfóxido (DMSO) (Carl Roth GmbH + Co, Alemanha), MTT [3- (4,5-dimetiltiazol- Brometo de 2-il) -2,5-difenil tetrazólio] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., EUA), HCl (Kharkivreachim, Ucrânia).

Caracterização de Composto Químico

Para aumentar a solubilidade, obtivemos o sal de sódio de difenil-N- (tricloroacetil) -amidofosfato (HL) de acordo com as seguintes reações (Fig. 2).

A solução de triclorofosfazotricloroacetil (0,035 M) em 200 ml de clorofórmio foi lentamente adicionada a uma suspensão de fenolato de sódio bem agitada (0,106 M, 12,3 g) em 150 ml de clorofórmio (Fig. 2; estágio 1). Não foi permitido que a temperatura da mistura subisse acima de 40–50 ° C. A agitação continuou durante cerca de 1 h e, em seguida, a solução foi aquecida até 70 ° C e agitada durante 20 min nestas condições. O produto resultante trifenoxifosfazotricloroacetilo foi evaporado. Em seguida, 40 mL de NaOH 1 M foram adicionados e refluxados por 90 min (Fig. 2; estágio 2). A mistura resultante foi evaporada. O precipitado sólido de HL de sódio foi lavado três vezes com éter dietílico e recristalizado de i -propanole como um pó cristalino branco (80% de rendimento). Cristais incolores de NaL · 3H ₂ O adequados para análise de raios-X foram obtidos por i -PrOH:H ₂ O (9:1 v / v ) solução evaporação lenta. O composto é estável ao ar, altamente solúvel em água e álcoois. M.p. 215 ° С.

O HL foi identificado por análise elementar e espectroscopia de IV e RMN:as análises elementares (C, H, N) foram realizadas usando o analisador elementar EL III Universal CHNOS. Medições espectrais de IV foram realizadas para amostras como pelotas de KBr em um espectrômetro Perkin – Elmer Spectrum BX FT-IR com resolução de 2 cm ^{- 1} e acúmulos de 8 varreduras, que são combinadas para calcular a média de artefatos de absorção aleatórios na faixa espectral de 4000–400 cm ^{- 1} . ¹ Os espectros de H NMR em soluções de DMSO-d6 foram registrados em um espectrômetro de NMR AVANCE 400Bruker à temperatura ambiente.

HL:IR (cm ⁻¹ ):1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Amida II); 1194 s, sh (vPO); 941 s, sh (νPN).

¹ H NMR (DMSO-d ₆ ):7,05 (t, 2H, γ-CH ₂ ); 7,205, 7,255 (dt, 8H, α- e β-CH ₂ )

Para CCl ₃ C (O) N (Na) P (O) (OC ₆ H ₅ ) ₂ a composição elementar foi determinada,%:C 40,58, H 2,35, N 3,15; e calculado,%:C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Síntese e caracterização de C ₆₀ Fulereno

Uma solução colóide aquosa altamente estável de C ₆₀ fulereno (200 μM, pureza> 99,5%, tamanho médio das nanopartículas de até 50 nm) foi sintetizado na Universidade Técnica de Ilmenau (Alemanha), conforme descrito em [17, 18].

Cultura Сell

Os experimentos foram realizados na linha de células CCRF-CM de leucemia aguda de células T humanas. A linha celular foi adquirida no Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures:CCRF-CM (ACC 240). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e 2 mM de glutamina, usando 25 cm ² frascos a 37 ° C com 5% CO ₂ em incubadora umidificada.

As células em meio RPMI 1640 foram incubadas com C ₆₀ fulereno (16 μM) ou HL (2,5, 5 e 10 μM) separadamente e juntos durante 24, 48 e 72 h. Sobrevivência celular sem adição de HL ou C ₆₀ o fulereno foi recebido como 100% (a amostra de controle continha 0,05 M de DMSO).

Ensaio de viabilidade celular (MTT)

A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de redução do MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio] [19]. Nos pontos de incubação indicados, alíquotas de 100 μl (0,5 × 10 ⁴ células) foram colocadas nas microplacas de 96 poços Sarstedt (Nümbrecht, Alemanha), 10 μl de solução de MTT (5 mg / ml em PBS) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas por mais 2 h a 37 ° C. O meio de cultura foi então substituído por 100 μl de DMSO; a formação de diformazan foi determinada medindo a absorção a 570 nm com um leitor de microplacas Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Suíça).

Animais

O estudo foi realizado em ratos brancos, machos, da linha “Wistar” com peso de 170 ± 5 g. Os animais foram mantidos em condições padrão no biotério do ESC “Instituto de Biologia e Medicina”, Taras Shevchenko National University of Kyiv. Os animais tinham livre acesso a comida e água. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com os princípios internacionais da Convenção Europeia para a Proteção de Animais Vertebrados, sob controle do Comitê de Bioética da referida instituição.

Estimativa de hemólise de eritrócitos

Os eritrócitos foram obtidos do sangue heparinizado de rato da linha “Wistar” e diluídos em solução de NaCl 0,85% a 0,700 o.u. a 630 nm no espectrofotômetro Scinco (Alemanha). A hemólise dos eritrócitos foi causada por HCl 0,001 N. A cinética da hemólise foi medida espectrofotometricamente ( λ =630 nm) a cada 10 s durante 2 min. A porcentagem de eritrócitos hemolisados foi calculada conforme apresentado em [20]. Os eritrócitos foram incubados em solução de NaCl a 0,85% com C ₆₀ fulereno (16 μM) ou HL (2,5 e 10 μM) separadamente e juntos durante 1 h. Eritrócitos sem adição de HL ou C ₆₀ o fulereno foi recebido como 100% (a amostra de controle continha 0,05 M de DMSO).

In Silico Study

A molécula de DNA de dupla hélice foi usada como molde da base do PDB (Protein Data Bank). A interação da molécula de DNA com HL separadamente e em combinação com C ₆₀ fulereno foi estudado. Levamos em consideração as seguintes estruturas da molécula de DNA:2MIW (CCATCGCTACC - intercalação do composto em um pequeno sulco da hélice de DNA), 1XRW (CCTCGTCC - intercalação do composto em um pequeno sulco da hélice de DNA) e 2M2C (GCGCATGCTACGCG - ligação de composto com sulcos grandes e pequenos de hélice de DNA). Aplicamos o algoritmo de docking sistemático (SDOCK +), embutido no pacote QXP (este método demonstra todas as conformações possíveis das estruturas estudadas com o valor mínimo de Root mean square deviation (RMSD)) [21]. Geramos 300 complexos potencialmente possíveis com DNA, os dez melhores dos quais foram selecionados para o próximo estágio, usando uma função de pontuação, embutida no pacote QXP [22].

As interações da molécula de DNA com HL separadamente e em combinação com o C ₆₀ o fulereno foi caracterizado pelos seguintes parâmetros:(1) o número de ligações de hidrogênio, (2) a área das superfícies de contato do DNA e a estrutura correspondente, (3) a distância entre o DNA e a estrutura ancorada e (4) a energia total da estrutura de ligação.

Para avaliar a estabilidade dos complexos de composto químico com C ₆₀ fulereno, conduzimos a dinâmica molecular curta (MD, 100 ps) usando a ferramenta de software Gromacs [23] de acordo com um algoritmo Nosé-Poincaré-Anderson (NPA) [24, 25] baseado no campo de força OPLS-AA [26, 27] .

Os cálculos foram realizados nos seguintes parâmetros:temperatura (em Kelvin) - 300; pressão (em quilopascal) - 100; a ligação envolvendo o átomo de hidrogênio ou ligante foi limitada pelo algoritmo [25].

Análise estatística

Os dados foram representados como média ± DP de mais de quatro experimentos independentes. Média (M) e desvio padrão (DP) foram calculados para cada grupo. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de dois fatores, seguida de testes pós-Bonferroni. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. O processamento e plotagem dos dados foram realizados em IBM PC, utilizando aplicativos especializados GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., EUA).

Resultados e discussões

In Silico Study

Interação de HL com DNA

Foi demonstrado que HL pode intercalar em DNA e formar complexo estável quando ligado a um sulco de DNA menor via nucleotídeos AGC-GCTA (Fig. 3a). Neste caso, a interação de empilhamento entre a base nitrogenada do nucleotídeo A e o grupo fenil HL, bem como a interação eletrostática entre CCl ₃ grupo e o nucleotídeo C foi formado. Após a simulação MD, os valores RMSD para a dupla hélice de DNA e HL foram 3,3 e 1,62 Å, respectivamente. O ambiente de nucleotídeo de HL (GCA-CTA) foi parcialmente alterado e a interação de empilhamento foi perdida, enquanto uma ligação de hidrogênio foi formada entre o nucleotídeo G e o grupo CO de HL.

A ligação de HL com um sulco de DNA principal ocorreu via nucleotídeos TCG-AT (Fig. 3b). Neste caso, uma ligação de hidrogênio entre o grupo CO de HL e a base nitrogenada do nucleotídeo A foi formada e a interação de empilhamento entre os fenilos HL e as bases nitrogenadas dos nucleotídeos C e G ocorreu. Além disso, uma probabilidade de ligação eletrostática entre HL CCl ₃ grupos e bases nitrogenadas de nucleotídeos AT apareceram.

Após a simulação de MD, nenhuma alteração no ambiente de nucleotídeos de HL foi detectada. Os valores RMSD para DNA e HL foram 2,77 e 1,58 Å, respectivamente. Devido a isso, a interação de empilhamento entre o nucleotídeo C e o grupo fenil desapareceu.

No caso da intercalação de HL em DNA, seu ambiente consistia em nucleotídeos CG-CG (Fig. 3c). A interação de empilhamento com nucleotídeos CG apareceu:um grupo fenil foi preso entre as bases nitrogenadas e o outro formou uma interação de empilhamento com o nucleotídeo C.

Após a simulação de MD, os valores de RMSD para a dupla hélice de DNA e HL foram 1,71 e 1,89 Å, respectivamente. O ambiente de nucleotídeos de HL não foi alterado. Um dos grupos fenil formou uma interação íon-π com a base nitrogenada do nucleotídeo G, que parecia estar deslocada em 1,12 Å.

Os parâmetros de energia obtidos atestaram que a energia dos choques estéricos entre DNA e HL, bem como dentro do próprio HL, era insignificante (Tabela 1).

Fizemos a análise comparativa dos parâmetros de energia da ligação de HL com sulcos de DNA menores e maiores ou sua intercalação em sulcos de DNA menores. Os valores de aumento mostraram ser de 6,2 kJ / mol no caso de intercalação de HL em DNA e 2,5 kJ / mol no caso de sua ligação com sulcos de DNA menores e maiores (Tabela 1). Os valores Int foram 8,7 kJ / mol no caso de intercalação de HL no DNA, 6,3 kJ / mol no caso de sua ligação com um sulco de DNA principal e 3,6 kJ / mol no caso de sua ligação com um sulco de DNA menor. Esses dados mostraram que a ligação de HL com um sulco menor de DNA era a mais estável.

Interação combinada de HL e C ₆₀ Fulereno com DNA

Anteriormente, com o uso de simulação de computador, demonstramos que C ₆₀ molécula poderia interagir com o DNA e formar um C ₆₀ estável + Complexo de DNA quando se liga ao sulco menor de DNA [15]. Como é mostrado na Fig. 4, C ₆₀ fulereno também pode formar ligações íon-π com CCl ₃ grupos da molécula HL.

Usamos duas versões de modelagem molecular de HL, C ₆₀ Fulereno e interação de DNA, que foram propostas em [16] e provaram ser úteis para a interpretação de resultados de simulação de DM. Nós usamos a estrutura 1XRW PDB da molécula de DNA na versão, quando inicialmente HL e depois C ₆₀ molécula intercalada em DNA (HL + C ₆₀ ) e estrutura 2MIW PDB da molécula de DNA - na versão, quando inicialmente C ₆₀ molécula e, em seguida, intercalam HL em DNA (C ₆₀ + HL).

A ligação com um sulco de DNA menor no caso de HL + C ₆₀ versão ocorreu via nucleotídeos GCTA-GCAT (Fig. 4a). Os grupos fenil preencheram um sulco menor e entraram em interações de empilhamento:um grupo com C ₆₀ o fulereno e o outro com a base nitrogenada do nucleotídeo G. As interações eletrostáticas surgiram entre CCl ₃ grupo de HL e a base nitrogenada do nucleotídeo G e C ₆₀ fulereno.

De acordo com os resultados da simulação de MD, uma dupla hélice de DNA, neste caso, foi caracterizada por mobilidade considerável (o valor RMSD é 3,08 Å), o valor RMSD para HL foi 2,04 Å, enquanto C ₆₀ o fulereno permaneceu virtualmente imóvel. Como resultado, o ambiente de nucleotídeo de HL + C ₆₀ a estrutura foi alterada por TGC-GCATG. Além disso, uma ligação de hidrogênio entre o grupo amino de HL e DNA e as interações de empilhamento entre os nucleotídeos das bases GC nitrogenadas e C ₆₀ fulereno apareceu.

A ligação de HL + C ₆₀ com um sulco de DNA principal ocorreu via nucleotídeos C-ATCC (Fig. 4b). As ligações de hidrogênio foram formadas entre o grupo HL CO e a base nitrogenada do nucleotídeo A. Os grupos fenil preencheram uma fenda principal do DNA e entraram em interação de empilhamento com C ₆₀ fulereno.

De acordo com os resultados da simulação MD, o ambiente de nucleotídeos de HL + C ₆₀ a estrutura não foi alterada:os valores de RMSD para DNA e HL foram 3,14 e 2,24 Å, respectivamente, C ₆₀ o fulereno permaneceu virtualmente imóvel. Neste caso, todas as interações entre HL e C ₆₀ o fulereno desapareceu e o HL interagiu estericamente apenas com o DNA. Supõe-se que como resultado C ₆₀ o fulereno, assim como o HL, seriam empurrados para fora do sulco principal do DNA.

Quando HL + C ₆₀ foram intercalados em um sulco de DNA menor (Fig. 4c), a ligação com os nucleotídeos CGT-GAG ocorreu. C ₆₀ o fulereno foi construído em um sulco menor de DNA e interagiu com ele estericamente. Os grupos fenil HL formaram interações de empilhamento com as bases nitrogenadas dos nucleotídeos CG-CG. De acordo com a simulação MD, os valores de RMSD para DNA e HL foram 2,29 e 2,13 Å, respectivamente, C ₆₀ fulereno permaneceu virtualmente imóvel, e CC1 ₃ o grupo de HL entrou em interação eletrostática com a base nitrogenada do nucleotídeo G.

No caso de C ₆₀ + Versão HL, a ligação com um sulco de DNA menor (Fig. 4d) ocorreu via nucleotídeos CGC-GCC. Um dos grupos fenil HL formou um empilhamento com C ₆₀ fulereno e outro com G nucleotídeo. O CC1 ₃ grupo de HL pareceu formar ligação eletrostática com a base nitrogenada do nucleotídeo C. De acordo com a análise de MD, os valores de RMSD para DNA e HL neste caso foram 2,35 e 2,75 Å, respectivamente, C ₆₀ o fulereno permaneceu imóvel, e o ambiente de nucleotídeo de C ₆₀ + A estrutura de HL foi alterada por CGCT-GC. Além disso, o C ₆₀ molécula penetrou mais profundamente no DNA e formou uma interação de empilhamento com a base de nitrogênio do nucleotídeo C.

De acordo com os parâmetros de energia calculados, o complexo formado no caso de C ₆₀ A intercalação + HL em um sulco de DNA menor foi a mais rígida (o valor de Bump 20,0 kJ / mol) (Tabela 1). Em contraste, no caso de HL + C ₆₀ interação com DNA, este parâmetro foi de apenas 6,2 kJ / mol quando HL + C ₆₀ foi intercalado em um sulco de DNA menor, 7,8 kJ / mol quando foi ligado a um sulco de DNA menor e 8,8 kJ / mol quando foi ligado a um sulco de DNA principal. Além disso, os parâmetros de energia mostraram que a formação de fortes ligações de hidrogênio dentro de HL + C ₆₀ O complexo + DNA só foi possível no caso de ligação com um sulco maior de DNA, quando o valor de Hbnd era - 2,3 kJ / mol, nos outros tipos de interação era igual a zero ou - 1,0 kJ / mol (Tabela 1). Além disso, de acordo com os resultados de MD, neste caso, ambos C ₆₀ o fulereno e o HL pareciam ter sido deslocados de um sulco principal de DNA.

Portanto, C ₆₀ + A ligação de HL com um sulco de DNA menor é sugerida como a versão mais provável de C ₆₀ interação combinada de fulereno, HL e DNA.

Estudo in vitro de efeitos biológicos HL

Viabilidade de células CCRF-CЕM

Em experimentos in vitro, a influência de longo prazo do difenil-N (tricloroacetil) -amidofosfato (HL) na faixa de 2,5–10 μM na viabilidade de células leucêmicas humanas CCRF-CЕM foi estimada pelo teste MTT. As células foram incubadas por 24, 48 e 72 h em meio RPMI 1640 com 16 μM C ₆₀ fulereno ou HL sozinho ou sua combinação. Viabilidade de células incubadas sem C ₆₀ ou HL foi considerado 100%.

Às 24 horas de incubação, nenhum efeito de HL na viabilidade das células CCRF-CЕM foi observado (Fig. 5). Ainda em incubação mais prolongada, a atividade citotóxica de HL na concentração de 5 e 10 μM tornou-se óbvia, a viabilidade celular em 48 h foi inibida em 25 e 33%, respectivamente, e continuou a cair em 72 h.

Deve-se notar que 50% de diminuição da viabilidade das células CCRF-CЕM (IC ₅₀ ) foi detectado em 72 h sob a ação de HL na concentração de 10 μM (Fig. 5). Recentemente, demonstramos que outro dimorfolido-N-tricloroacetilfosforilamida representativo do CAPh causou redução de 50% na viabilidade das células CCRF-CЕM em 72 h na concentração de 1 mM [16]. A análise comparativa desses dados demonstra que a introdução de grupos fenoxi em vez de morfolido na estrutura do derivado CAPh permitiu diminuir em duas ordens sua concentração tóxica efetiva contra células leucêmicas. Assumimos que a flexibilidade conformacional de –P (O) (OC ₆ H ₅ ) core garantiu uma interação mais eficaz deste composto com o DNA.

Sem influência de C ₆₀ fulereno usado sozinho na viabilidade celular durante o período de incubação foi detectado (dados não apresentados). Ao mesmo tempo, os resultados mostrados na Fig. 6 demonstram que C ₆₀ o fulereno intensificou a atividade citotóxica de HL contra células CCRF-CЕM. Sob ação combinada de C ₆₀ Fulereno e HL, redução de 50% da viabilidade celular foi observada na concentração de HL mais baixa (5 μM) e no período anterior (48 h) de incubação do que sob a ação de HL por si só. Além disso, às 72 h de ação combinada de C ₆₀ fulereno e HL, o efeito citotóxico de HL foi detectado em uma concentração baixa de 2,5 μM em que HL por si só não teve influência na viabilidade celular (Fig. 6).

Assim, C ₆₀ O fulereno demonstrou potencializar os efeitos citotóxicos do HL e aumentar significativamente a sensibilidade das células leucêmicas à sua ação em baixa concentração. Levando em consideração que C ₆₀ o fulereno é capaz de se acumular dentro das células leucêmicas ao longo de 24 h [28] e se localizar em compartimentos intracelulares [29,30,31], particularmente no núcleo [32, 33], sua interação com o DNA nuclear de células cancerosas ativamente proliferadas não deve ser excluído.

Assim, os dados obtidos in vitro estão de acordo com os resultados do estudo in silico e demonstram que a ligação inicial de C ₆₀ molécula e depois de HL com sulco de DNA menor com formação de um complexo estável poderia ser uma das possíveis razões de sua inibição sinérgica da proliferação de células CCRF-CЕM.

Resistência dos eritrócitos à hemólise

Na estimativa do potencial anticâncer de HL e C ₆₀ combinação de fulereno, é importante levar em consideração seus possíveis efeitos nas células não malignas, em particular nas células do sangue.

O estudo da resistência dos eritrócitos à hemólise ácida permite elucidar a influência do agente farmacológico ao nível da membrana. A dinâmica da hemólise reflete a dinâmica da ruptura da membrana plasmática dos eritrócitos e, portanto, a estabilidade de sua organização estrutural. Na Fig. 7, a dependência da porcentagem de hemólise eritrócitos foram incubados por 1 h em solução de NaCl sem adições (controle) e com HL ou C ₆₀ fulereno sozinho ou em combinação. Sem influência de 16 μM C ₆₀ fulereno em hemólise de eritrócitos foi detectado (não mostrado). HL em concentração de 2,5 μM sozinho ou em combinação com C ₆₀ afetou a resistência dos eritrócitos à hemólise (Fig. 7). Enquanto isso, sob a ação do HL em concentração de 10 μM foi detectada aceleração da hemólise com máximo em 20 s. Ação combinada de 10 μM HL e C ₆₀ o fulereno foi seguido por mais intensificação da hemólise com 60% dos eritrócitos hemolisados em 20 s.

Os dados obtidos mostraram que a aplicação de C ₆₀ o fulereno em combinação com 2,5 μM HL não teve efeito prejudicial sobre a estabilidade estrutural da membrana dos eritrócitos sanguíneos e ao mesmo tempo permite aumentar significativamente a atividade citotóxica do HL nesta baixa concentração contra as células leucêmicas. Apesar do efeito citotóxico sinérgico de C ₆₀ fulereno e HL na concentração de 10 μM contra células leucêmicas, a aplicação de sua combinação pareceu ser limitada pela intensificação do efeito hemolítico.

Finalmente, no contexto do estudo in vitro acima, é importante enfatizar que uma interface água / sólido tem água confinada, o que também pode afetar tanto o transporte, as propriedades termodinâmicas das nanoestruturas [34, 35] e sua interação com as membranas celulares [36].

Existem dados da literatura sobre a localização intracelular de derivados de carbacilamidofosfatos, em particular, a penetração de fosforamidatos nas células. Assim, os derivados de fosforamidato podem penetrar através da membrana de linhas celulares de câncer de mama MDA-231 e câncer de pulmão (H460, H383 e H2009) [37]. As mostardas de nitrobenzil fosforamida mostraram permear através das membranas celulares e estar localizadas na mitocôndria de NTR ⁺ células de mamíferos [10]. Não está excluído que C ₆₀ o fulereno, que é capaz de penetrar na membrana da célula cancerosa devido à difusão passiva ou endocitose [28, 30, 32] com acúmulo no núcleo e mitocôndria [30, 32, 33], poderia ser um transportador de pequenas moléculas antitumorais [ 38,39,40].

Conclusões

Um novo representante de derivados de carbacilamidofosfatos que têm dois substituintes fenoxi próximos ao grupo fosforil difenil-N- (tricloroacetil) -amidofosfato (HL) foi sintetizado e testado como um agente citotóxico em si e em combinação com C ₆₀ fulereno. De acordo com os resultados da simulação molecular, quando C ₆₀ fulereno e, em seguida, HL foram ligados com um sulco de DNA menor, um complexo rígido foi formado estabilizado por empilhamento de interações de grupos fenil HL com C ₆₀ fulereno e nucleotídeo G de DNA, bem como por interações de HL CCl ₃ agrupar por ligações íon-π com C ₆₀ molécula e por ligações eletrostáticas com o DNA G nucleotídeo.

Com o uso do teste de MTT, mostramos a atividade citotóxica de HL contra células leucêmicas humanas CCRF-CM com IC ₅₀ valor detectado na concentração de 10 μM em 72 h de tratamento de células. O efeito citotóxico do HL foi facilitado por C ₆₀ fulereno. Sob ação combinada de 16 μM C ₆₀ fulereno e HL, o valor de IC ₅₀ foi detectado em uma concentração inferior de 5 μM de HL e no período de incubação de 48 h anteriores e, além disso, o efeito citotóxico de HL foi observado em uma concentração baixa de 2,5 μM na qual o HL por si só não teve influência na viabilidade celular.

Anteriormente, mostramos um efeito tóxico significativo da dimorfolido-N-tricloroacetilfosforamida contra células leucêmicas humanas de origem diferente, mas sua concentração efetiva era alta e nenhum aumento de toxicidade após ação combinada com C ₆₀ fulereno foi observado [16]. Assumimos que a introdução de flexível de –P (O) (OC ₆ H ₅ ) grupos em vez de grupos morfolido em derivado de CAPh contribuíram para a redução de sua concentração tóxica contra células leucêmicas humanas, garantindo sua interação efetiva com C ₆₀ molécula e DNA. Vinculação de C ₆₀ fulereno e HL com sulco de DNA menor com formação de um complexo estável é considerado uma das possíveis razões de sua inibição sinérgica da proliferação de células CCRF-CЕM.

Nós revelamos que a aplicação de C ₆₀ fulereno em combinação com 2,5 μM HL não teve efeito prejudicial na estabilidade estrutural da membrana dos eritrócitos sanguíneos, enquanto a combinação de C ₆₀ o fulereno com 10 μM HL pareceu ser limitado pela intensificação do efeito hemolítico.

Assim, C ₆₀ O fulereno demonstrou potencializar o efeito citotóxico do HL e aumentar significativamente a sensibilidade das células leucêmicas humanas à sua ação em baixa concentração. Uma combinação de C ₆₀ fulereno com HL em uma baixa concentração de 2,5 μM pode ser promissor para futuros estudos biomédicos.