Avaliação da Modulação do Fullereno C60 na Ligação Diphenil-N-(Tricloroacetil)amidofosfato-DNA e Citotoxicidade em Células de Leucemia Humana

Resumo

Novo representante de carbacilamidofosfatos — difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL), contendo dois substituintes fenoxi próximos ao grupo fosforil, foi sintetizado, identificado por análise elementar e espectroscopia IR e NMR, e testado como agente citotóxico por si só e em combinação com fullereno C₆₀.

Segundo resultados de simulação molecular, fullereno C₆₀ e HL poderiam interagir com DNA e formar complexo rígido estabilizado por interações de empilhamento dos grupos fenil de HL com fullereno C₆₀ e nucleotídeo G do DNA, bem como por interações do grupo CCl₃ de HL por ligações íon-π com molécula de C₆₀ e por ligações eletrostáticas com nucleotídeo G do DNA.

Com uso de teste MTT, atividade citotóxica de HL contra células leucêmicas humanas CCRF-CM com valor IC₅₀ detectado em concentração de 10 µM a 72 h de tratamento foi mostrada. Sob ação combinada de 16 µM de fullereno C₆₀ e HL, o valor de IC₅₀ foi detectado em menor concentração de 5 µM HL e em período anterior de 48 h de incubação, além do efeito citotóxico de HL observado em baixa concentração de 2,5 µM na qual HL por si só não tinha influência na viabilidade celular. Ligação de fullereno C₆₀ e HL com sulco menor do DNA com formação de complexo estável é assumida como uma das possíveis razões de sua inibição sinérgica da proliferação de células CCRF-CEM.

Aplicação de fullereno C₆₀ em combinação com 2,5 µM HL mostrou não ter efeito prejudicial na estabilidade estrutural da membrana de eritrócitos sanguíneos. Assim, ação combinada de fullereno C₆₀ e HL em baixa concentração potencializou efeito citotóxico de HL contra células leucêmicas humanas e não foi seguida por efeito hemolítico.

Introdução

O representante de nanoestrutura de carbono C₆₀ fullereno mostrou possuir propriedades físico-químicas únicas e atividade biológica não apenas como antioxidante ou fotossensibilizador, mas também como modificador do efeito tóxico de drogas anticancerígenas devido à sua capacidade de penetrar dentro da célula e funcionar como transportador de fármacos. Molécula de C₆₀ pode interagir com drogas quimioterápicas como doxorrubicina, cisplatina e paclitaxel e formar complexos com elas aumentando o efeito terapêutico.

Carbacilamidofosfatos (CAPh) são moléculas orgânicas que atraíram atenção devido à sua estrutura particular, atividade biológica e perspectivas de aplicação biomédica. A presença de grupos peptídeo e fosforamida combinados no fragmento C(O)N(H)P(O) da molécula determina sua interação com moléculas biológicas e membranas celulares. Variação de substituintes próximos aos grupos fosforil e carbonil dá possibilidade de modular propriedades estereoquímicas e farmacológicas de CAPh. Em particular, diferentes representantes de CAPh mostraram possuir atividade antineoplásica.

Recentemente, confirmamos que representante de CAPh dimetil-N-(benzoil)-amidofosfato usado na faixa de concentração milimolar diminuiu viabilidade de células leucêmicas L1210 e que seu efeito tóxico foi facilitado por fullereno C₆₀. Mostramos também que introdução de substituintes aromáticos adicionais e grupo eletronegativo CCl₃ na estrutura de CAPh resultou em aumento de sua toxicidade. Assim, efeito tóxico significativo de dimorfolido-N-tricloroacetilfosforamida foi mostrado contra células leucêmicas humanas de diferentes origens, mas sua concentração efetiva ainda era alta e nenhum aumento de toxicidade após ação combinada com fullereno C₆₀ foi observado. Em continuação destas investigações, sintetizamos novo representante de CAPh difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL) que tem dois substituintes fenoxi em vez de grupos morfolido próximos ao grupo fosforil.

O objetivo da pesquisa foi estimar atividade biológica de difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL) sozinho ou em combinação com fullereno C₆₀ com uso de análise in silico de sua interação com DNA e estudo in vitro de efeitos citotóxicos contra linhagem de células leucêmicas humanas.

Métodos/Experimental

Químicos

Meio líquido RPMI 1640, Soro Bovino Fetal (FBS), Penicilina/Estreptomicina e L-glutamina (Biochrom, Alemanha), Dimetilsulfóxido (DMSO) (Carl Roth GmbH+Co, Alemanha), MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio brometo] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., EUA), HCl (Kharkivreachim, Ucrânia).

Caracterização do Composto Químico

Para aumentar solubilidade, obtivemos sal de sódio de difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL) segundo reações a seguir. A solução de triclorofosfazotricloroacetil (0,035 M) em 200 ml de clorofórmio foi lentamente adicionada a uma suspensão bem agitada de fenolato de sódio (0,106 M, 12,3 g) em 150 ml de clorofórmio. A temperatura da mistura não foi permitida subir acima de 40-50 °C. Agitação continuou por cerca de 1 h, então a solução foi aquecida a 70 °C e agitada por 20 min nestas condições. O produto resultante trifenoxifosfazotricloroacetil foi evaporado. Então, 40 ml de NaOH 1 M foi adicionado e refluxado por 90 min. A mistura resultante foi evaporada. O precipitado sólido de HL de sódio foi lavado três vezes com éter dietílico e recristalizado de i-propanol como pó cristalino branco (rendimento 80%). Cristais incolores de NaL·3H₂O adequados para análise de raios-X foram obtidos por evaporação lenta de solução i-PrOH:H₂O (9:1 v/v). O composto é estável ao ar, altamente solúvel em água e álcoois. P.f. 215 °C.

HL foi identificado por análise elementar e espectroscopia IR e NMR: análises elementares (C, H, N) realizadas usando analisador elementar universal EL III CHNOS. Medidas espectrais IR realizadas para amostras como pastilhas de KBr em espectrômetro FT-IR Perkin-Elmer Spectrum BX com resolução de 2 cm⁻¹ e acumulações de 8 varreduras, combinadas para média de artefatos de absorção aleatórios na faixa espectral 4000-400 cm⁻¹. Espectros ¹H NMR em soluções DMSO-d6 registrados em espectrômetro NMR AVANCE 400 Bruker a temperatura ambiente.

HL: IR (cm⁻¹): 1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Amida II); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sh (νPN).

¹H NMR (DMSO-d₆): 7,05 (t, 2H, γ-CH₂); 7,205, 7,255 (dt, 8H, α- e β-CH₂).

Para CCl₃C(O)N(Na)P(O)(OC₆H₅)₂ a composição elementar foi determinada, %: C 40,58, H 2,35, N 3,15; e calculada, %: C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Síntese e Caracterização do Fullereno C₆₀

Solução coloidal aquosa altamente estável de fullereno C₆₀ (200 µM, pureza > 99,5%, tamanho médio de nanopartícula até 50 nm) foi sintetizada na Universidade Técnica de Ilmenau (Alemanha) conforme descrito em referências.

Cultura Celular

Experimentos foram feitos em linhagem de leucemia aguda de células T humanas CCRF-CM. Linhagem foi comprada do Leibniz Institute DSMZ: CCRF-CM (ACC 240). Células cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS, 1% Penicilina/Estreptomicina, e 2 mM Glutamina, usando frascos de 25 cm² a 37 °C com 5% CO₂ em incubadora umidificada.

Células em meio RPMI 1640 foram incubadas com fullereno C₆₀ (16 µM) ou HL (2,5, 5 e 10 µM) separadamente e juntos durante 24, 48 e 72 h. Sobrevivência de células sem adição de HL ou fullereno C₆₀ foi recebida como 100% (amostra controle continha 0,05 M DMSO).

Ensaio de Viabilidade Celular (MTT)

Viabilidade celular avaliada pelo ensaio de redução de MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio brometo]. Nos pontos de tempo indicados de incubação, alíquotas de 100 µl (0,5×10⁴ células) foram colocadas em microplacas de 96 poços Sarstedt, 10 µl de solução MTT (5 mg/ml em PBS) adicionados a cada poço, e placas incubadas por mais 2 h a 37 °C. Meio de cultura então substituído por 100 µl de DMSO; formação de diformazano determinada medindo absorção a 570 nm com leitor de microplacas Tecan Infinite M200 Pro.

Animais

Estudo conduzido em ratos machos brancos da linhagem "Wistar" pesando 170±5 g. Animais mantidos sob condições padrão no vivário do ESC "Instituto de Biologia e Medicina," Universidade Nacional Taras Shevchenko de Kyiv. Animais tiveram acesso livre a comida e água. Todos experimentos conduzidos de acordo com princípios internacionais da Convenção Europeia para proteção de animais vertebrados sob controle do Comitê de Bioética da instituição supracitada.

Estimativa de Hemólise de Eritrócitos

Eritrócitos obtidos de sangue heparinizado de ratos "Wistar" e diluídos em solução NaCl 0,85% a 0,700 o.u. a 630 nm no espectrofotômetro Scinco (Alemanha). Hemólise de eritrócitos causada por HCl 0,001 N. Cinética de hemólise medida espectrofotometricamente (λ=630 nm) a cada 10 s durante 2 min. Porcentagem de eritrócitos hemolisados calculada conforme apresentado em referência. Eritrócitos incubados em solução NaCl 0,85% com fullereno C₆₀ (16 µM) ou HL (2,5 e 10 µM) separadamente e juntos durante 1 h. Eritrócitos sem adição de HL ou fullereno C₆₀ recebidos como 100% (amostra controle continha 0,05 M DMSO).

Estudo In Silico

Molécula de DNA de dupla hélice usada como molde do banco PDB (Protein Data Bank). Interação de molécula de DNA com HL separadamente e em combinação com fullereno C₆₀ estudada. Consideramos as seguintes estruturas de DNA: 2MIW (CCATCGCTACC - intercalação de composto em sulco menor de hélice de DNA), 1XRW (CCTCGTCC - intercalação em sulco menor), e 2M2C (GCGCATGCTACGCG - ligação de composto com sulcos maior e menor de DNA). Aplicamos algoritmo de docking sistemático (SDOCK+), embutido no pacote QXP (este método demonstra todas conformações possíveis das estruturas estudadas com valor mínimo de desvio quadrático médio RMSD). Geramos 300 complexos potencialmente possíveis com DNA, os dez melhores selecionados para próxima etapa, usando função de scoring embutida no QXP.

Interações da molécula de DNA com HL separadamente e em combinação com fullereno C₆₀ caracterizadas pelos parâmetros: (1) número de ligações de hidrogênio, (2) área de superfícies de contato de DNA e estrutura correspondente, (3) distância entre DNA e estrutura acoplada, e (4) energia total da estrutura de ligação.

Para avaliar estabilidade dos complexos de composto químico com fullereno C₆₀, conduzimos dinâmica molecular curta (MD, 100 ps) usando ferramenta Gromacs segundo algoritmo Nosé-Poincaré-Anderson (NPA) baseado em campo de força OPLS-AA. Cálculos realizados nos parâmetros: temperatura 300 K; pressão 100 kPa; ligação envolvendo átomo de hidrogênio ou ligante limitada pelo algoritmo.

Análise Estatística

Dados representados como média ± DP de mais de quatro experimentos independentes. Média (M) e desvio padrão (DP) calculados para cada grupo. Análise estatística realizada usando ANOVA de duas vias seguido de testes post-hoc Bonferroni. Valor p<0,05 considerado estatisticamente significativo. Processamento de dados e plotagem realizados por IBM PC usando aplicações especializadas GraphPad Prism 7.

Resultados e Discussões

Estudo In Silico

Interação de HL com DNA

Mostrou-se que HL poderia intercalar no DNA e formar complexo estável quando ligado em sulco menor do DNA via nucleotídeos AGC-GCTA. Neste caso, interação de empilhamento entre base nitrogenada de nucleotídeo A e grupo fenil de HL, bem como interação eletrostática entre grupo CCl₃ e nucleotídeo C foi formada. Após simulação MD, valores RMSD para hélice dupla de DNA e HL foram 3,3 e 1,62 Å, respectivamente. Ambiente nucleotídico de HL (GCA-CTA) foi parcialmente alterado e interação de empilhamento perdida, enquanto ligação de hidrogênio foi formada entre nucleotídeo G e grupo CO de HL.

Ligação de HL com sulco maior do DNA ocorreu via nucleotídeos TCG-AT. Neste caso, ligação de hidrogênio entre grupo CO de HL e base nitrogenada de nucleotídeo A foi formada e interação de empilhamento entre ambos fenis de HL e bases nitrogenadas de nucleotídeos C e G ocorreu. Além disso, probabilidade de ligação eletrostática entre grupo CCl₃ de HL e bases nitrogenadas de nucleotídeos AT apareceu.

Após simulação MD, nenhuma mudança no ambiente nucleotídico de HL detectada. Valores RMSD para DNA e HL foram 2,77 e 1,58 Å, respectivamente. Devido a isso, interação de empilhamento entre nucleotídeo C e grupo fenil desapareceu.

No caso de intercalação de HL no DNA, seu ambiente consistia de nucleotídeos CG-CG. Interação de empilhamento com nucleotídeos CG apareceu: um grupo fenil foi clampado entre bases nitrogenadas e o outro formou interação de empilhamento com nucleotídeo C.

Após simulação MD, valores RMSD para hélice dupla de DNA e HL foram 1,71 e 1,89 Å, respectivamente. Ambiente nucleotídico de HL não foi alterado. Um dos grupos fenil formou interação íon-π com base nitrogenada de nucleotídeo G, que apareceu deslocada por 1,12 Å.

Parâmetros de energia obtidos testificaram que energia de choques estéricos entre DNA e HL bem como dentro do próprio HL foi insignificante. Análise comparativa de parâmetros de energia de ligação de HL com sulcos menor e maior do DNA ou sua intercalação em sulco menor mostrou que ligação de HL com sulco menor do DNA foi a mais estável.

Interação Combinada de HL e Fullereno C₆₀ com DNA

Previamente com uso de simulação computacional, demonstramos que molécula de C₆₀ poderia interagir com DNA e formar complexo C₆₀+DNA estável quando ligado com sulco menor do DNA. Como mostrado na Fig. 4, fullereno C₆₀ também poderia formar ligações íon-π com grupos CCl₃ de molécula de HL.

Usamos duas versões de modelagem molecular de interação HL, fullereno C₆₀ e DNA, propostas em referência e provadas úteis para interpretação de resultados de simulação MD. Usamos estrutura PDB 1XRW de DNA na versão quando inicialmente HL e então molécula de C₆₀ intercalam no DNA (HL+C₆₀) e estrutura PDB 2MIW - na versão quando inicialmente molécula de C₆₀ e então HL intercalam no DNA (C₆₀+HL).

Ligação com sulco menor do DNA no caso de versão HL+C₆₀ ocorreu via nucleotídeos GCTA-GCAT. Grupos fenil preencheram sulco menor e entraram em interações de empilhamento: um grupo com fullereno C₆₀ e o outro com base nitrogenada de nucleotídeo G. Interações eletrostáticas surgiram entre grupo CCl₃ de HL e tanto base nitrogenada de nucleotídeo G quanto fullereno C₆₀.

Segundo resultados de simulação MD, hélice dupla de DNA neste caso caracterizada por mobilidade considerável (valor RMSD 3,08 Å), valor RMSD para HL 2,04 Å, enquanto fullereno C₆₀ permaneceu virtualmente imóvel. Como resultado, ambiente nucleotídico da estrutura HL+C₆₀ foi alterado por TGC-GCATG. Além disso, ligação de hidrogênio entre grupo amino de HL e DNA e interações de empilhamento entre nucleotídeos de bases GC nitrogenadas e fullereno C₆₀ apareceram.

Ligação de HL+C₆₀ com sulco maior do DNA ocorreu via nucleotídeos C-ATCC. Ligações de hidrogênio formadas entre grupo CO de HL e base nitrogenada de nucleotídeo A. Grupos fenil preencheram sulco maior e entraram em interação de empilhamento com fullereno C₆₀.

Segundo resultados MD, ambiente nucleotídico da estrutura HL+C₆₀ não foi alterado: valores RMSD para DNA e HL foram 3,14 e 2,24 Å, respectivamente, fullereno C₆₀ permaneceu virtualmente imóvel. Neste caso, todas interações entre HL e fullereno C₆₀ desapareceram e HL interagiu estericamente apenas com DNA. Supõe-se que como resultado fullereno C₆₀ bem como HL seriam empurrados para fora do sulco maior do DNA.

Quando HL+C₆₀ foram intercalados em sulco menor do DNA, ligação com nucleotídeos CGT-GAG ocorreu. Fullereno C₆₀ ocorreu construído em sulco menor e interagiu com ele estericamente. Grupos fenil de HL formaram interações de empilhamento com bases nitrogenadas de nucleotídeos CG-CG. Segundo simulação MD, valores RMSD para DNA e HL foram 2,29 e 2,13 Å, respectivamente, fullereno C₆₀ permaneceu virtualmente imóvel, e grupo CC1₃ de HL entrou em interação eletrostática com base nitrogenada de nucleotídeo G.

No caso de versão C₆₀+HL, ligação com sulco menor do DNA ocorreu via nucleotídeos CGC-GCC. Um dos grupos fenil de HL formou empilhamento com fullereno C₆₀ e o outro com nucleotídeo G. Grupo CC1₃ de HL apareceu formar ligação eletrostática com base nitrogenada de nucleotídeo C. Segundo análise MD, valores RMSD para DNA e HL neste caso foram 2,35 e 2,75 Å, respectivamente, fullereno C₆₀ permaneceu imóvel, e ambiente nucleotídico da estrutura C₆₀+HL foi alterado por CGCT-GC. Além disso, molécula de C₆₀ penetrou mais profundamente no DNA e formou interação de empilhamento com base nitrogenada de nucleotídeo C.

Segundo parâmetros de energia calculados, complexo formado no caso de intercalação C₆₀+HL em sulco menor do DNA foi o mais rígido (valor Bump 20,0 kJ/mol). Em contraste, no caso de interação HL+C₆₀ com DNA, este parâmetro foi apenas 6,2 kJ/mol quando HL+C₆₀ intercalado em sulco menor, 7,8 kJ/mol quando ligado com sulco menor, e 8,8 kJ/mol quando ligado com sulco maior. Além disso, parâmetros de energia mostraram que formação de fortes ligações de hidrogênio dentro do complexo HL+C₆₀+DNA foi possível apenas no caso de ligação com sulco maior do DNA, quando valor de Hbnd foi -2,3 kJ/mol, em outros tipos de interação foi zero ou -1,0 kJ/mol. Além disso, segundo resultados MD neste caso tanto fullereno C₆₀ quanto HL apareceram deslocados de sulco maior do DNA.

Portanto, ligação C₆₀+HL com sulco menor do DNA é sugerida como versão mais provável de interação combinada de fullereno C₆₀, HL e DNA.

Estudo In Vitro dos Efeitos Biológicos de HL

Viabilidade de Células CCRF-CEM

Em experimentos in vitro, influência de longo prazo de difenil-N(tricloroacetil)-amidofosfato (HL) na faixa 2,5-10 µM na viabilidade de células leucêmicas humanas CCRF-CEM foi estimada por teste MTT. Células incubadas por 24, 48 e 72 h em meio RPMI 1640 com 16 µM fullereno C₆₀ ou HL sozinho ou sua combinação. Viabilidade de células incubadas sem C₆₀ ou HL considerada 100%.

A 24 h de incubação, nenhum efeito de HL na viabilidade de células CCRF-CEM observado. Ainda em incubação mais prolongada, atividade citotóxica de HL em concentrações 5 e 10 µM tornou-se óbvia, viabilidade celular a 48 h inibida em 25 e 33%, respectivamente, e continuou a cair a 72 h.

Deve-se notar que diminuição de 50% da viabilidade de células CCRF-CEM (IC₅₀) foi detectada a 72 h sob ação de HL em concentração 10 µM. Recentemente, mostramos que outro representante de CAPh dimorfolido-N-tricloroacetilfosforamida causou diminuição de 50% da viabilidade de células CCRF-CEM a 72 h em concentração 1 mM. Análise comparativa destes dados demonstra que introdução de grupos fenoxi em vez de morfolido na estrutura de derivado CAPh permitiu diminuir em duas ordens sua concentração tóxica efetiva contra células leucêmicas. Assumimos que flexibilidade conformacional do núcleo -P(O)(OC₆H₅) assegurou interação mais efetiva deste composto com DNA.

Nenhuma influência de fullereno C₆₀ usado sozinho na viabilidade celular durante período de incubação detectada. Ao mesmo tempo, resultados mostram que fullereno C₆₀ intensificou atividade citotóxica de HL contra células CCRF-CEM. Sob ação combinada de fullereno C₆₀ e HL, diminuição de 50% da viabilidade celular observada em menor concentração de HL (5 µM) e em período anterior (48 h) de incubação que sob ação de HL por si só. Além disso a 72 h de ação combinada de fullereno C₆₀ e HL, efeito citotóxico de HL detectado em baixa concentração de 2,5 µM na qual HL por si só não tinha influência na viabilidade celular.

Assim, fullereno C₆₀ mostrou potencializar efeitos citotóxicos de HL e aumentar significativamente sensibilidade de células leucêmicas à sua ação em baixa concentração. Levando em conta que fullereno C₆₀ é capaz de acumular dentro de células leucêmicas por 24 h e localizar em compartimentos intracelulares, particularmente no núcleo, sua interação com DNA nuclear de células cancerígenas ativamente proliferadas não deve ser excluída.

Portanto, dados obtidos in vitro estão de acordo com resultados de estudo in silico e demonstram que ligação inicial de molécula de C₆₀ e então de HL com sulco menor do DNA com formação de complexo estável poderia ser uma das possíveis razões de sua inibição sinérgica da proliferação de células CCRF-CEM.

Resistência de Eritrócitos à Hemólise

Na estimativa do potencial anticancerígeno de combinação HL e fullereno C₆₀, é importante levar em conta seus possíveis efeitos em células não malignas, em particular em células sanguíneas.

Estudo de resistência de eritrócitos à hemólise ácida permite elucidar influência de agente farmacológico no nível de membrana. Dinâmica de hemólise reflete dinâmica de disrupção da membrana plasmática de eritrócito e portanto estabilidade de sua organização estrutural. Na Fig. 7, dependência da porcentagem de hemólise de eritrócitos incubados por 1 h em solução NaCl sem adições (controle) e com HL ou fullereno C₆₀ sozinhos ou em combinação. Nenhuma influência de 16 µM fullereno C₆₀ na hemólise de eritrócitos detectada. HL em concentração 2,5 µM sozinho ou em combinação com C₆₀ não afetou resistência de eritrócitos à hemólise. Enquanto isso, sob ação de HL em concentração 10 µM aceleração de hemólise com máximo a 20 s detectada. Ação combinada de 10 µM HL e fullereno C₆₀ seguida por intensificação adicional de hemólise com 60% de eritrócitos hemolisados a 20 s.

Dados obtidos mostraram que aplicação de fullereno C₆₀ em combinação com 2,5 µM HL não teve efeito prejudicial na estabilidade estrutural da membrana de eritrócitos sanguíneos e ao mesmo tempo permitiu aumentar significativamente atividade citotóxica de HL nesta baixa concentração contra células leucêmicas. Apesar do efeito citotóxico sinérgico de fullereno C₆₀ e HL em 10 µM contra células leucêmicas, aplicação de sua combinação pareceu limitada por intensificação de efeito hemolítico.

Finalmente, no contexto do estudo in vitro acima, é importante enfatizar que interface água/sólido tem água confinada que também pode afetar tanto o transporte, propriedades termodinâmicas de nanoestruturas, quanto sua interação com membranas celulares.

Há dados literários sobre localização intracelular de derivados de carbacilamidofosfatos, em particular, penetração de fosforamidatos nas células. Assim, derivados de fosforamidato podem penetrar através da membrana de câncer de mama MDA-231 e linhas de câncer de pulmão (H460, H383, H2009). Fosforamida mostarda nitrobenzílica mostrou permear através de membranas celulares e localizar em mitocôndrias de células mamíferas NTR⁺. Não se exclui que fullereno C₆₀, capaz de penetrar membrana de célula cancerígena devido a difusão passiva ou endocitose com acumulação no núcleo e mitocôndrias, poderia ser transportador de pequenas moléculas antitumorais.

Conclusões

Novo representante de derivados de carbacilamidofosfatos que têm dois substituintes fenoxi próximos ao grupo fosforil difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL) foi sintetizado e testado como agente citotóxico por si só e em combinação com fullereno C₆₀. Segundo resultados de simulação molecular, quando fullereno C₆₀ e então HL ligaram com sulco menor do DNA, complexo rígido foi formado estabilizado por interações de empilhamento de grupos fenil de HL com fullereno C₆₀ e nucleotídeo G do DNA, bem como por interações de grupo CCl₃ de HL por ligações íon-π com molécula de C₆₀ e por ligações eletrostáticas com nucleotídeo G do DNA.

Com uso de teste MTT, mostramos atividade citotóxica de HL contra células leucêmicas humanas CCRF-CM com valor IC₅₀ detectado em concentração 10 µM a 72 h de tratamento. Efeito citotóxico de HL foi facilitado por fullereno C₆₀. Sob ação combinada de 16 µM fullereno C₆₀ e HL, valor de IC₅₀ detectado em menor concentração 5 µM HL e em período anterior 48 h de incubação e além disso efeito citotóxico de HL observado em baixa concentração 2,5 µM na qual HL por si só não tinha influência na viabilidade celular.

Previamente, mostramos efeito tóxico significativo de dimorfolido-N-tricloroacetilfosforamida contra células leucêmicas humanas de diferentes origens, mas sua concentração efetiva era alta e nenhum aumento de toxicidade após ação combinada com fullereno C₆₀ observado. Assumimos que introdução de grupos flexíveis -P(O)(OC₆H₅) em vez de grupos morfolido em derivado CAPh contribuiu para redução de sua concentração tóxica contra células leucêmicas humanas assegurando sua interação efetiva com molécula de C₆₀ e DNA. Ligação de fullereno C₆₀ e HL com sulco menor do DNA com formação de complexo estável assumida como uma das possíveis razões de sua inibição sinérgica da proliferação de células CCRF-CEM.

Revelamos que aplicação de fullereno C₆₀ em combinação com 2,5 µM HL não teve efeito prejudicial na estabilidade estrutural da membrana de eritrócitos sanguíneos, enquanto combinação de fullereno C₆₀ com 10 µM HL pareceu limitada por intensificação de efeito hemolítico.

Assim, fullereno C₆₀ mostrou potencializar efeito citotóxico de HL e aumentar significativamente sensibilidade de células leucêmicas humanas à sua ação em baixa concentração. Combinação de fullereno C₆₀ com HL em baixa concentração 2,5 µM pode ser promissora para futuros estudos biomédicos.

Abreviações

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DNA:

Ácido desoxirribonucleico

FBS:

Soro bovino fetal

HL:

Difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato

IR:

Espectroscopia infravermelha

MD:

Dinâmica molecular

MTT:

3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazólio brometo

NMR:

Ressonância magnética nuclear

RPMI - 1640 meio:

Meio Roswell Park Memorial Institute