Terapia Direcionada de Glioma: Tetraedros de DNA Modificados com Gint4.T Entregam Doxorrubicina para Inibir Proliferação Celular Impulsionada por PDGFRβ

Resumo

O glioma é um dos tumores cerebrais intrínsecos mais letais devido ao seu crescimento invasivo. O efeito do tratamento de glioma é ruim devido à presença da barreira hematoencefálica e barreira hemato-tumor e direcionamento insuficiente de fármacos. Tetraedros de DNA (TDN) mostram grande potencial para entrega de fármacos e podem ser uma nova estratégia terapêutica para glioma. Neste estudo, usamos TDN para entregar doxorrubicina (DOX) para terapia de glioma. Gint4.T, um aptâmero que pode reconhecer receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β em células tumorais, foi usado para modificar TDN (Apt-TDN) para entrega direcionada de fármacos. Os TDN foram auto-montados por síntese em uma etapa, que mostrou tamanho pequeno (10 nm) e carga negativa. Teste de soro fetal bovino mostrou sua estabilidade como veículo de entrega de fármacos. Apt-TDN pode ser efetivamente captado por células U87MG. Comparado com DOX e DOX@TDN (TDN carregado com DOX), o DOX@Apt-TDN (TDN modificado com Gint4.T carregado com DOX) mostrou maior taxa de apoptose precoce, maior parada de ciclo celular e maior citotoxicidade para células U87MG. Em conclusão, nossas descobertas indicaram que DOX@Apt-TDN fornece uma nova terapia com aplicação clínica promissora para pacientes com gliomas.

Introdução

O glioma, um tumor derivado do neuroepitélio, é a malignidade intracraniana mais comum. Quase 1/3 de todos os tumores cerebrais são gliomas, e aproximadamente 4/5 de tumores cerebrais primários malignos são gliomas [1–4]. Atualmente, o tratamento mais eficaz para glioma é ressecção cirúrgica e quimiorradioterapia concomitante pós-operatória, mas infelizmente o prognóstico para pacientes permanece ruim. A quimioterapia tradicional para glioma não mostra bom resultado devido ao direcionamento tumoral ruim, complicações devido à barreira hematoencefálica (BBB) e barreira hemato-tumor (BTB), e direcionamento insuficiente de fármacos. A BBB é o fator mais importante que impede a entrega de quase todas as macromoléculas (incluindo fármacos e genes) ao parênquima cerebral e sua função adequada. Fármacos que não podem cruzar a BBB têm que ser administrados em doses suficientemente altas para atingir uma concentração de tratamento eficaz na área de interesse. No entanto, fármacos em excesso podem causar efeitos colaterais sistêmicos graves e acúmulo indesejado de fármacos em tecidos não afetados. Além disso, fármacos anti-glioma convencionais existentes têm capacidades de direcionamento insuficientes [3, 4]. Nanopartículas emergiram como a ferramenta mais promissora de carregamento de fármacos. Devido à vantagem de tamanho, nanopartículas podem cruzar a BBB e exercer efeito antitumoral. Kafa et al. [5] projetaram nanotubos de carbono de parede múltipla quimicamente funcionalizados (f-MWNTs) direcionando ANG e confirmaram sua capacidade de cruzar a BBB através de experimentos in vivo e in vitro. No entanto, esses nanomateriais podem ser distribuídos para vários órgãos pelo corpo ou até entrar no sistema nervoso central (SNC), onde podem causar neurotoxicidade [6].

O DNA é um material ideal para construção de nanoestruturas porque sua montagem pode ser precisamente controlada por pareamento de bases Watson-Crick [7]. Até o momento, várias nanoestruturas de DNA bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) foram projetadas e demonstradas [8–10]. Nanoestruturas tetraédricas de DNA (TDN) atraíram atenção significativa devido à sua biocompatibilidade, estabilidade, sítios abundantes de modificação funcionalizada e baixa imunogenicidade [11–13]. Turberfield et al. sintetizaram nanoestruturas tetraédricas de DNA com alto rendimento usando método de síntese em uma etapa [14]. Walsh et al. descobriram que um tetraedro de DNA contendo sonda de ácido nucleico poderia entrar em células de mamíferos sem necessidade de reagente de transfeção [15]. Lee et al. demonstraram que nanopartículas tetraédricas auto-montadas podem ser usadas para entrega direcionada de siRNA in vivo [16]. TDN mostraram excelentes perspectivas de aplicação em diagnóstico molecular, entrega molecular e terapia direcionada de fármacos. Eles também são amplamente usados em pesquisa de tumores em vários órgãos, como câncer de mama [17]. Similarmente, TDN também têm sido usados no estudo de doenças do sistema nervoso. Tian et al. [18] usaram tetraedros de DNA como base e os modificaram com angiopep-2 (ANG) para construir com sucesso a nanossonda ANG-TDN, que poderia direcionar a proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP-1) para imagem direcionada. Pesquisa mostrou que ANG-TDN pode cruzar a BBB. Ma et al. [19] sugeriram que nanoestruturas tetraédricas de DNA podem entrar em células-tronco neurais (NSCs) sem necessidade de agentes de transfeção, onde promovem migração, proliferação e diferenciação de células-tronco neurais [20], e têm grande potencial para reparo e regeneração de tecido neural. Portanto, investigamos a possibilidade de uso de TDN em terapia de glioma e aprimorar sua capacidade de direcionamento.

Receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β (PDGFRβ) é um membro importante da família de tirosina quinase proteica envolvido em proliferação celular, migração e angiogênese. Vários estudos mostraram que PDGFβ é um alvo promissor para terapias antitumoriais devido ao seu papel na angiogênese [21, 22]. Aptâmeros são oligonucleotídeos curtos, de fita simples, DNA ou RNA, produzidos pelo método de evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX). Aptâmeros são similares a anticorpos, que têm alta afinidade e especificidade para seus alvos [23]. Devido às suas propriedades únicas, aptâmeros desempenham papel importante na entrega direcionada de agentes quimioterápicos, siRNAs e nanopartículas carregadas de fármacos. Gint4.T, um aptâmero de RNA que pode ligar especificamente PDGFRβ, também é um antagonista específico de PDGFRβ [24]. Monaco et al. [25] sugeriram que aptâmeros Gint4.T podem cruzar a barreira hematoencefálica (BBB) e reconhecer especificamente PDGFRβ. Nanopartículas poliméricas (PNPs) conjugadas com Gint4.T podem ser prontamente captadas por células de glioblastoma (GBM). Neste estudo, relatamos um novo sistema carregado de fármaco que combina o aptâmero Gint4.T e TDN. O TDN modificado com Gint4.T (Apt-TDN) carregado com DOX (DOX@Apt-TDN) exibiu captação celular específica aprimorada e citotoxicidade contra células U87MG.

Métodos

Materiais

Todos os oligonucleotídeos de DNA e oligonucleotídeos de RNA 2’F-Py foram comprados da Sangon Biotech (Shanghai, China), e todas as sequências de oligonucleotídeos estão listadas na Tabela 1. Solução de corante de gel GelRed DNA foi comprada da Sangon Biotech. Tanto soro fetal bovino (FBS) quanto meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) foram comprados da Thermo Fisher (Nova York, EUA). Doxorrubicina (DOX) foi comprada da Mengbio Technology (Chongqing, China). Células U87MG foram compradas da Shanghai Life Academy of Sciences Cell Library (Shanghai, China). DAPI foi comprado da Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Pequim, China).

Preparação de Nanoestruturas de DNA

Para montar o tetraedro de DNA (Tabela 1), 2 μL de cada oligonucleotídeo (S1, S2, S3 e S4) foi adicionado a 42 μL de tampão TM (10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, pH = 8). A solução de DNA foi então aquecida a 95 °C por 5 min e subsequentemente resfriada a 4 °C por 2 min usando uma máquina PCR Bio-Rad (Califórnia, EUA) [26, 27]. A concentração final de TDN foi 2 μM. TDN' foi preparado da mesma maneira, exceto que S1 foi substituído por S1'. Para sintetizar o Apt-TDN, o aptâmero Gint4.T foi adicionado ao TDN em razão molar igual, e a mistura foi incubada a 37 °C por 60 min. Antes da síntese, o aptâmero foi submetido a um passo curto de desnaturalização-renaturalização (85 °C por 5 min, resfriamento rápido por 2 min e subsequentemente aquecimento a 37 °C por 10 min) [25].

Eletroforese em Gel de Agarose

Um gel de agarose (3%) foi corrido em tampão 0,5× TEB a 100 V por 30 min. A temperatura do aparelho de eletroforese foi mantida a 0 °C colocando o aparelho em banho de gelo. Antes da eletroforese, GelRed foi adicionado ao gel de agarose para colorir as fitas de DNA. Quando o processo terminou, um scanner de fluorescência Bio-Rad (Califórnia, EUA) foi usado para capturar uma imagem do gel.

Espalhamento Dinâmico de Luz

Um Malvern Zetasizer ZS90 (Malvern, Reino Unido) foi usado para medir o tamanho hidrodinâmico e potencial zeta do TDN. Um total de 1 mL de TDN (100 nM) foi submetido à análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS).

Imagem por Microscopia de Força Atômica

Os TDN foram diluídos a 100 nM com tampão TM (tampão Tris-HCl contendo MgCl₂). Então, 10 μL de cada amostra de TDN foi adicionado a mica recém-clivada e incubado por 10 min. As amostras foram subsequentemente imageadas em um instrumento de microscopia de força atômica (AFM) no modo AC (Agilent 5500, EUA).

Medição da Capacidade de Carregamento de Fármaco dos TDN Preparados

Doxorrubicina foi dissolvida em água desionizada para fazer uma solução de estoque de 500 μM. Doxorrubicina em diferentes concentrações (1 a 20 μM) foi misturada com TDN (100 nM) ou Apt-TDN (100 nM) por 6 h à temperatura ambiente (24–26 °C). As soluções mistas foram então centrifugadas a 12.000×g por 10 min para obter o TDN carregado com fármaco. Então, 50 μL dos sobrenadantes foram removidos e misturados com PBS na razão 1:1. Um leitor de microplacas Varioskan LUX (Califórnia, EUA) foi usado para medir a intensidade de fluorescência da doxorrubicina (λ_ex = 480 nm e λ_em = 590 nm) para determinar a quantidade de doxorrubicina nos sobrenadantes [28]. A concentração de doxorrubicina carregada no TDN foi calculada pela curva padrão e intensidade de fluorescência. Também misturamos doxorrubicina com TDN em razões molares crescentes.

Estabilidade do TDN em Soro In Vitro

Os TDN foram misturados com meio completo e incubados a 37 °C por 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 24 h. As soluções de TDN foram misturadas com FBS na razão 1:1 e incubadas a 37 °C por 1, 3, 5 ou 7 h. Após incubação, as misturas foram corridas em gel de agarose 3%.

Citotoxicidade do TDN In Vitro

Para determinar a citotoxicidade da nanoestrutura, células U87MG a uma concentração de 1 × 10⁴ células/poço foram semeadas em placa de 96 poços. O meio de cultura celular foi removido, e meio fresco contendo 0–500 nM TDN foi adicionado e incubado por mais 24 h e 48 h após incubação overnight. Então, 10 μL de solução CCK-8 foi adicionado a cada poço, e a mistura foi incubada por 1 h. A absorbância a 450 nm foi então medida usando um leitor de microplacas.

Imagem de Fluorescência

A captação celular de DOX e TDN foi estudada por microscopia de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão). Células U87MG foram semeadas em lamínulas em placas de 24 poços com meio contendo 10% de soro fetal bovino inativado por calor e 1% de penicilina e estreptomicina e cultivadas por pelo menos 1 dia a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% CO₂ até que as células atingissem pelo menos 75% de confluência. Após incubação, os meios de cultura foram removidos. Meios completos contendo 100 nM Cy3-TDN e Cy3-Apt-TDN foram adicionados e incubados por 3 h. TDN e Apt-TDN foram marcados com Cy3 para detectar a captação intracelular de nanopartículas. Para avaliar a captação celular de DOX, DOX (DOX 2 μM), DOX@TDN (DOX 2 μM) e DOX@Apt-TDN (DOX 2 μM) foram adicionados a células U87MG e incubados por 3 h. Após 3 h de tratamento, as células foram fixadas com 4% paraformaldeído por 20 min no escuro e subsequentemente coradas com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 min. As células foram lavadas com PBS três vezes e observadas sob microscópio de fluorescência.

Citometria de Fluxo

Um total de 1 × 10⁶ células U87MG foram implantadas em placas de 6 poços. Após incubação overnight, os meios de cultura foram removidos, e meios suplementados com 100 nM Cy3-TDN, 100 nM Cy3-Apt-TDN ou 100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 μM Apt livre foram adicionados e incubados por 3 h. Então, as células foram fixadas com 4% paraformaldeído por 20 min, e citometria de fluxo foi usada para analisar as porcentagens de células positivas para Cy-3.

Ciclo Celular e Apoptose

Após tratamento com DOX, DOX@TDN ou DOX@Apt-TDN por 24 h, 5 × 10⁵ células foram coletadas e fixadas em 75% etanol gelado overnight. Então, as células foram incubadas com RNase e iodeto de propídio por 30 min a 37 °C no escuro. O ciclo celular foi investigado por citometria de fluxo. Além disso, após os diferentes tratamentos, as células foram coradas com Annexin V-FITC/DAPI, e apoptose precoce foi explorada.

Ensaios CCK-8

Para determinar a viabilidade celular, células U87MG (5 × 10³) foram semeadas em placas de 96 poços com 100 μL de meio e cultivadas overnight a 37 °C sob atmosfera contendo 5% CO₂. O meio foi subsequentemente removido, e meio fresco contendo DOX, DOX-TDN ou DOX-Apt-TDN foi adicionado. Após 24 h de incubação, 10 μL de solução CCK-8 foi adicionado, e as células foram cultivadas por mais 1 h. Um leitor de microplacas foi usado para medir a absorbância a 450 nm.

Análise Estatística

Todos os experimentos neste estudo foram realizados em triplicata, e todos os dados são apresentados como valor médio com seu desvio padrão (média ± DP). Análise estatística foi realizada usando o programa SPSS 24.0 (IBM, EUA). Diferenças significativas foram determinadas usando teste t de Student, com P < 0,05 indicando diferenças significativas entre grupos.

Resultados

Síntese e Caracterização do TDN e Apt-TDN

O TDN foi auto-montado a partir de quatro oligonucleotídeos (Tabela 1) via síntese em etapa única como relatado anteriormente [18, 29]. O aptâmero direcionador de tumor Gint4.T foi usado para modificar TDN via pareamento de bases Watson-Crick. O tetraedro de DNA contém quatro faces, com cada face formada por um oligonucleotídeo. Assim, quatro oligonucleotídeos hibridizaram entre si para formar um tetraedro de DNA (Fig. 1a). Análise de eletroforese em gel mostrou uma única banda proeminente nas pistas 4 e 5, sugerindo que TDN e Apt-TDN foram construídos com sucesso. A mobilidade do Apt-TDN foi diminuída em comparação com a do TDN, sugerindo que o aptâmero Gint4.T modificou com sucesso o TDN.

a Síntese do tetraedro de DNA e Gint4.T-TDN. Pista 1: S1; pista 2: S1+S2; pista 3: S1+S2+S3; pista 4: S1+S2+S3+S4 (TDN); pista 5: TDN misturado com Apt-tail (Gint4.T); Apt-TDN. Pista 1 não era visível porque corantes de ácido nucleico não podem colorir adequadamente DNA de fita simples. b Imagens AFM mostraram que as alturas do TDN e Apt-TDN eram ~ 2 nm. c Determinação do tamanho de partícula e potencial zeta do TDN e Apt-TDN por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Os tamanhos médios de partícula do TDN e Apt-TDN foram 10,10 nm (A) e 13,54 nm (B), respectivamente. Os potenciais zeta médios do TDN e Apt-TDN foram −5,69 mV (C) e −7,3 mV (D), respectivamente.

Os tamanhos do TDN e Apt-TDN foram determinados por DLS e AFM. O TDN e Apt-TDN mostraram tamanhos de partícula de 10,1 nm e 13,5 nm, respectivamente, refletindo a adição do ligante Gint4.T (Fig. 1c (A), (B)). Como o diâmetro hidrodinâmico inclui moléculas de água, as partículas foram maiores que seus tamanhos teóricos. As alturas de ambos TDN e Apt-TDN determinadas por imagens AFM foram ~ 2 nm (Fig. 1b), indicando que a modificação do aptâmero não alterou a estrutura 3D. Os potenciais zeta médios do TDN e Apt-TDN foram −5,69 mV (C) e −7,3 mV (D), respectivamente (Fig. 1c (C) (D)). Baseado nesses parâmetros, concluímos que TDN e Apt-TDN foram montados com sucesso.

Estabilidade e Citotoxicidade do TDN In Vitro

Análise de eletroforese em gel mostrou que o TDN permaneceu intacto quando incubado em meio completo por 24 h a 37 °C (Fig. 2a (A)). Além disso, quando a concentração de soro fetal bovino foi aumentada para 50%, o TDN permaneceu estável por pelo menos 7 h (Fig. 2a (B)), o que é consistente com relatórios anteriores [18, 26]. Para determinar a citotoxicidade da nanoestrutura, o ensaio CCK-8 foi usado para avaliar a viabilidade celular de células U87MG após tratamento com TDN em várias concentrações. Como mostrado na Fig. 2b, nenhuma citotoxicidade significativa foi observada em células U87MG tratadas com TDN a 0–500 nM por 24 h e 48 h. Portanto, nanopartículas de DNA podem ser usadas como transportadores estáveis e biosseguros para entrega de fármacos.

a Eletroforese em gel mostrou que o TDN permaneceu estável por 24 h em meio completo a 37 °C (A); o TDN permaneceu estável por 7 h quando a concentração de soro fetal bovino foi aumentada para 50% (B). b Células U87MG foram co-cultivadas com TDN em diferentes concentrações (10–500 nM) por 24 h e 48 h. O ensaio CCK-8 mostrou que a atividade das células U87MG não foi afetada, indicando a biossegurança do TDN.

Capacidade de Carregamento de Fármaco do TDN e Apt-TDN

Doxorrubicina é um fármaco quimioterápico de amplo espectro que pode intercalar em fitas duplas de DNA. Calculamos uma curva padrão de doxorrubicina (Fig. 3a) e então investigamos a intercalação de doxorrubicina no TDN. A quantidade de doxorrubicina intercalada no TDN e Apt-TDN aumentou gradualmente com o aumento da concentração de doxorrubicina. Quando a concentração de doxorrubicina foi 14 μM, a quantidade de doxorrubicina intercalada no TDN e Apt-TDN atingiu pico em 5,5 μM e 6,0 μM, respectivamente, e subsequentemente estabilizou (Fig. 3b), indicando que as fitas de DNA estavam totalmente ocupadas. Enquanto isso, misturamos doxorrubicina com TDN em razões molares crescentes. O espectro de fluorescência de doxorrubicina foi escaneado para análise. Como mostrado na Fig. 3c, o espectro de fluorescência de doxorrubicina foi extinto com doxorrubicina em razão molar de 0,05. Baseado nesses achados, concluímos que aproximadamente 55 moléculas de doxorrubicina eram contidas dentro de um único TDN, enquanto 60 moléculas eram contidas dentro de um único Apt-TDN.

a Curva padrão de concentrações de DOX em tampão PBS; λex = 480 nm e λem = 590 nm. A quantidade de DOX carregada pelo TDN e Apt-TDN. b DOX intercalado no DNA de fita dupla do TDN e Apt-TDN. Quando a concentração de DOX atingiu 14 μM e a DOX intercalada no TDN e Apt-TDN atingiu pico em 5,5 μM e 6,0 μM, respectivamente, um único tetraedro de DNA poderia carregar 55 moléculas de Dox, enquanto um único tetraedro de DNA modificado com aptâmero carregou 60 moléculas de DOX. c Espectros de fluorescência de DOX no sobrenadante. Doxorrubicina foi misturada com TDN em razões molares crescentes (0, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01 e 0,05 de cima para baixo). Quando a razão molar foi 1:20, a fluorescência foi extinta.

Captação Celular Direcionada do Apt-TDN

O DNA é uma macromolécula carregada negativamente, o que torna sua entrada na membrana celular carregada negativamente difícil. Tipicamente, moléculas individuais de DNA devem acessar células com a ajuda de reagente de transfeção. Aqui, marcamos TDN e Apt-TDN com Cy3 para monitorar a captação intracelular das nanopartículas. Após incubação com células U87MG por 3 h, sinal de fluorescência vermelha Cy3 emergiu no citoplasma celular, indicando que o TDN ligou à citomembrana e foi captado na célula sem ajuda de agentes de transfeção (Fig. 4a). O Apt-TDN mostrou fluorescência vermelha mais alta, o que sugere que a presença do aptâmero Gint4.T aumentou significativamente a captação do tetraedro de DNA por células U87MG. No entanto, quando aptâmero livre foi adicionado, a fluorescência Cy3 diminuiu para o nível observado para TDN sozinho. Devido à inibição competitiva pelo aptâmero livre, inferimos que o aptâmero no TDN não pôde facilitar a captação do TDN. Baseado nesta inibição competitiva, provamos que o Apt-TDN pode direcionar células U87MG. Citometria de fluxo provou ainda que a porcentagem de células U87MG positivas para Cy3 foi maior no grupo Apt-TDN que no grupo TDN. Apt livre diminuiu a porcentagem de células U87MG positivas para Cy3 no grupo Apt-TDN (Fig. 4b).

a Captação de células U87MG do TDN e Apt-TDN (TDN-Gint4.T). O TDN entrou nas células U87MG diretamente sem agentes de transfeção, e a captação de Apt-TDN (ligado ao aptâmero Gint4.T) foi significativamente aumentada e inibida competitivamente por Apt livre (Gint4.T), indicando que o aptâmero Gint4.T desempenha papel significativo no direcionamento celular. A barra de escala representa 50 μm. b Curvas de citometria de fluxo mostram a captação intracelular do TDN, Apt-TDN e Apt-TDN+Apt após incubação por 3 h.

Captação Celular do DOX@TDN e DOX@Apt-TDN

Utilizamos o espectro de fluorescência característico de doxorrubicina para avaliar a eficiência de captação do fármaco. Após 3 h de tratamento, a doxorrubicina intracelular foi imageada por microscopia de fluorescência (Fig. 5a). Doxorrubicina livre poderia entrar nas células U87MG e estava localizada no núcleo. Com a adição de DOX@TDN, a fluorescência foi maior que a de doxorrubicina livre. Este resultado sugeriu que nanopartículas de DNA aumentaram a captação celular de doxorrubicina. Quando DOX@Apt-TDN foi adicionado, o sinal vermelho no núcleo foi ainda maior que o de células às quais DOX@TDN foi adicionado. Análise semi-quantitativa da captação intracelular de DOX confirmou ainda que o Apt-TDN facilitou um aumento de mais de duas vezes na captação intracelular de DOX comparado ao fármaco único. Inferimos que isso é devido à ligação específica de Gin4.T a receptores, após a qual mais nanopartículas podem entrar na célula. Após digestão em lisossomos, a doxorrubicina pode ser liberada no citoplasma e funcionar no núcleo.

a Captação celular de DOX, DOX@TDN e DOX@Apt-TDN. Modificado com aptâmero Gint4.T, o Apt-TDN poderia entregar mais doxorrubicina a células U87MG que o TDN. Além disso, o TDN poderia carregar mais fármaco para células que o fármaco sozinho. As barras de escala indicam 50 μm. b Análise semi-quantitativa da intensidade de fluorescência de doxorrubicina com tratamento PBS, DOX, DOX@TDN e DOX@Apt-TDN (comparado ao branco: *p < 0,05, **p < 0,01).

Citotoxicidade de DOX, DOX@TDN e DOX@Apt-TDN

Para o estudo de citotoxicidade, três grupos de células U87MG foram tratados com diferentes concentrações de doxorrubicina (Fig. 6a). Os valores IC₅₀ para doxorrubicina foram 13,39 μM para tratamento com DOX, 7,826 μM para tratamento DOX@TDN e 4,205 μM para tratamento DOX@Apt-TDN. Entre os três tratamentos, DOX@Apt-TDN mostrou a maior citotoxicidade a 24 h, o que indicou a especificidade do Apt-TDN para células U87MG. Após 24 h, células nos grupos DOX, DOX@TDN e DOX@Apt-TDN foram coletadas e usadas para explorar apoptose precoce. Nossos dados demonstraram que a taxa de apoptose precoce foi maior no grupo DOX@Apt-TDN que nos outros dois grupos (Fig. 6b). Além disso, a proporção de células na fase G0/G1 foi aumentada no grupo DOX-Apt-TDN comparado com grupos DOX e DOX-TDN (p < 0,01), e a razão de células na fase S foi diminuída no grupo DOX-Apt-TDN (p < 0,01) (Fig. 6c). A porcentagem de células na fase G2 não foi alterada (dados não mostrados).

a Citotoxicidade de DOX, DOX@TDN e DOX@Apt-TDN em várias concentrações. A taxa de inibição de células U87MG aumentou significativamente com o aumento da concentração de DOX, mas os grupos DOX@TDN e DOX@Apt-TDN exibiram citotoxicidade significativamente aumentada comparada ao grupo DOX. A taxa de inibição celular do grupo DOX@Apt-TDN também foi significativamente maior que a do grupo DOX@TDN (comparado a DOX, **p < 0,05; comparado a DOX, ***p < 0,01; comparado a DOX@Apt-TDN, ^#p < 0,05). b Apoptose de células U87MG após incubação com PBS, DOX, DOX@TDN e DOX@Apt-TDN por 24 h. c Histogramas de citometria de fluxo do ciclo celular de células U87MG após incubação com PBS, DOX, DOX@TDN e DOX@Apt-TDN por 24 h (comparado ao controle, **p < 0,05; comparado ao controle, ***p < 0,01; comparado a DOX@Apt-TDN, ^#p < 0,01).

Discussão

Seja via experimentos in vitro ou in vivo, a estabilidade de um fármaco e seu transportador deve ser determinada. Após montagem do TDN, sua estabilidade foi primeiro determinada in vitro. Este estudo mostrou que a estrutura 3D de nanopartículas de DNA pode melhorar sua estabilidade no soro inibindo ligação enzimática. A segurança biológica da nanoestrutura relevante é o requisito mais importante para sua aplicação. Nenhuma citotoxicidade significativa foi observada em células U87MG co-cultivadas com várias concentrações de TDN por 24 h ou 48 h. Nenhuma das sequências de DNA usadas neste estudo codifica qualquer informação genética, e nenhum efeito colateral foi relatado no teste de citotoxicidade. Portanto, o TDN pode servir como transportador de fármaco seguro e estável.

A eficiência de direcionamento de uma nanoestrutura modificada com aptâmero é crucial para entrega seletiva de fármacos a células cancerígenas. Diferente de anticorpos, aptâmeros são quimicamente estáveis, baratos e podem ser produzidos em massa. Além disso, diferente de outros materiais, aptâmeros podem facilmente ligar um tetraedro de DNA usando o princípio de complementaridade de bases. Assim, a combinação de aptâmeros e tetraedros de DNA lança a base para entrega direcionada de fármacos e tratamentos de próxima geração. Nossos resultados mostraram que o TDN podia entrar nas células sem agentes de transfeção, o que é similar aos resultados de Walsh et al. e Ma et al. [15, 19]. Comparado ao TDN, a captação de Apt-TDN por células U87MG foi significativamente aumentada. Após adição de aptâmero livre, este aumento desapareceu. Este resultado sugere que Gint4.T é um antagonista específico de PDGFRβ [25]. Nosso estudo demonstrou que o aptâmero Gint4.T pode direcionar células U87MG devido à alta expressão de PDGFRβ na superfície de células de glioma. Camorani et al. [24] também mostraram que o aptâmero Gint4.T pode direcionar células tumorais interagindo especificamente com o domínio extracelular de PDGFRβ. As vantagens do direcionamento por aptâmero Gint4.T foram demonstradas em certa medida via estudos in vitro, mas testes in vivo adicionais são necessários para confirmar esses achados. Este estudo também confirmou que DOX@Apt-TDN é mais citotóxico que DOX ou DOX@TDN, o que provavelmente se origina de dois fatores. Primeiro, o aptâmero Gint4.T pode ligar especificamente domínios extracelulares de PDGFR, bloqueando proliferação de células tumorais e inibindo crescimento de células tumorais [24]. Isso é consistente com nossos resultados experimentais. Comparado ao grupo controle, as mudanças no ciclo celular de U87MG após tratamento com DOX, DOX@TDN e DOX@Apt-TDN aumentaram significativamente em células tumorais na fase G0/G1, diminuíram em células na fase S, e bloquearam células tumorais na fase G0/G1, indicando que podem inibir o ciclo celular de células U87MG e inibir sua proliferação. Comparado aos grupos DOX e DOX@TDN, o grupo DOX@Apt-TDN teve capacidade significativamente maior de inibir a proliferação de células U87MG. Além disso, Gint4.T liga especificamente células tumorais e aumenta o direcionamento celular do complexo DOX@Apt-TDN. Assim, podemos aumentar a eficiência de direcionamento do fármaco e reduzir a dose de administração sistêmica de fármacos antitumoriais para prevenir seus efeitos colaterais sistêmicos.

Conclusões

A modificação com Gint4.T aumentou a especificidade e eficiência de TDN no tratamento de glioma direcionando PDGFRβ expresso em grandes quantidades em células de glioma. Além disso, quando carregado com Apt-TDN, poderia promover significativamente os efeitos anti-glioma de DOX. Portanto, DOX@Apt-TDN pode servir como estratégia terapêutica promissora contra glioma para pacientes. A deficiência deste estudo é que foi verificado apenas in vitro. Em estudos posteriores, exploraremos mais em modelos animais.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Os dados relevantes estão incluídos dentro do artigo.

Abreviações

BBB:

Barreira hematoencefálica

BTB:

Barreira hemato-tumor

TDN:

Nanoestruturas tetraédricas de DNA/Tetraedros de DNA

DOX:

Doxorrubicina

PDGFRβ:

Receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β

Apt-TDN:

TDN modificado com Gint4.T

DOX@ TDN:

TDN carregado com DOX

DOX@Apt-TDN:

TDN modificado com Gint4.T carregado com DOX

CNS:

Sistema nervoso central

ANG:

Angiopep-2

LRP-1:

Proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade

SELEX:

Enriquecimento exponencial

PNPs:

Nanopartículas poliméricas

GBM:

Glioblastoma

FBS:

Soro fetal bovino

DMEM:

Meio de Eagle modificado de Dulbecco

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

AFM:

Microscopia de força atômica

CCK-8:

Kit de Contagem Celular-8

Cy3:

Sulfo-Cianina3

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-fenilindol