Avaliação da Segurança de Nanocarregadores Lipossomais Administrados por Via Intratimpânica no Ouvido Interno de Ratos

Resumo

Nanocarregadores lipossomais (LPNs) oferecem alta carga de fármaco e captação eficiente no ouvido interno após administração intratimpânica minimamente invasiva. No entanto, sua biocompatibilidade neste órgão sensível não havia sido sistematicamente avaliada. Neste estudo, LPNs — com ou sem ácido gadolínio-tetra-azaciclo-dodecano-tetra-acético (Gd-DOTA) — foram injetados transtimpânicamente em ratos Sprague-Dawley. Ressonância magnética realçada com gadolínio (Gd-MRI) rastreou a distribuição dos LPNs e avaliou a integridade da barreira, enquanto respostas do tronco cerebral auditivo (ABR) mediram a função auditiva. Marcadores inflamatórios (glicosaminoglicanos, ácido hialurônico, CD44, TLR2) e apoptose (TUNEL) foram quantificados em tecidos cocleares. Os resultados mostraram entrada eficiente dos LPNs no ouvido interno sem desestabilizar as barreiras do ouvido médio ou interno, sem perda auditiva e sem elevação em marcadores inflamatórios ou apoptóticos. Assim, a administração transtimpânica de LPNs é segura para a cóclea de ratos e promissora para tratar perda auditiva sensorioneural.

Introdução

LPNs são a plataforma nanoterapêutica mais antiga na clínica, usada com sucesso para câncer, doenças infecciosas, inflamação e dor. Sua alta capacidade de carga e captação comprovada no ouvido interno tornam-nos atraentes para terapia otológica. A administração intratimpânica é uma abordagem racional e direcionada que limita a exposição sistêmica e já é empregada clinicamente para doença de Ménière e perda auditiva sensorioneural súbita. Embora trabalhos anteriores tenham demonstrado LPNs funcionalizados com peptídeos alcançando a cóclea, o perfil de segurança dos LPNs no ouvido interno — particularmente em relação à função de barreira, inflamação e viabilidade celular — permanece desconhecido. Este estudo preenche essa lacuna avaliando a biocompatibilidade dos LPNs no ouvido interno de ratos usando Gd-MRI, ABR e análises histológicas abrangentes.

O ácido hialurônico (HA) é um componente principal da matriz extracelular que se liga a CD44 e TLR2/4, iniciando vias inflamatórias. O acúmulo de HA tem sido associado a aumento de permeabilidade e inflamação em vários tecidos, incluindo a cóclea, onde nanopartículas de prata (AgNPs) induziram anteriormente acúmulo de HA. Portanto, HA, CD44 e TLR2 foram examinados como marcadores inflamatórios críticos neste estudo.

O objetivo foi determinar se LPNs transtimpânicos comprometem a integridade da barreira do ouvido interno, induzem inflamação ou causam perda auditiva. Gd-MRI avaliou a função de barreira, ABR mediu limiares auditivos e imuno-histoquímica quantificou HA, CD44, TLR2 e fragmentação de DNA apoptótico.

Resultados

LPNs não causaram alterações funcionais na cóclea de ratos

Gd-MRI demonstrou que LPNs entraram na cóclea eficientemente, com sinal forte na scala vestibuli e scala tympani dentro de 3 h pós-injeção (Fig. 2c-f). Aos 6 h, a distribuição do sinal tornou-se homogênea pela cóclea, indicando equilíbrio completo (Fig. 2e-f). A integridade das barreiras sangue-perilinfa e sangue-endolinfa permaneceu intacta, conforme refletido por intensidades de sinal comparáveis entre ouvidos tratados e não tratados (Tabela 1). Limiares ABR para cliques e rajadas tonais (2-32 kHz) não mostraram deslocamento significativo aos 2, 4 ou 7 dias pós-injeção, confirmando função auditiva preservada (Fig. 3).

LPNs não induziram acúmulo de glicosaminoglicanos na cóclea de ratos

Coloração com ácido periódico-Schiff revelou nenhum aumento em glicosaminoglicanos através das estruturas cocleares (limbo espiral, parede óssea, estria vascular) após tratamento com LPN ou LPN-Gd comparado com controles de água desionizada (Figs. 5, 6). A quantificação confirmou diferenças não estatisticamente significativas (p > 0,05).

Impacto menor na secreção de ácido hialurônico por LPNs

Imunofluorescência detectou HA principalmente em células ganglionares espirais, células basais estriais, células do sulco externo e células endoteliais capilares (Fig. 7). Embora a intensidade de HA em fibroblastos do ligamento espiral tenha diminuído ligeiramente após administração de LPN ou LPN-Gd, esta mudança não se traduziu em permeabilidade de barreira alterada ou perda auditiva (Fig. 8).

Expressão de CD44 permaneceu inalterada após exposição a LPNs

Células CD44-positivas eram abundantes na camada de células basais estriais, ligamento espiral, células de Deiters e endotélio capilar em todos os grupos, sem diferenças significativas na intensidade de coloração ou contagem de células entre ouvidos tratados e controle (Figs. 9, 10).

Expressão de TLR2 não foi afetada por LPNs

Imunorreatividade de TLR2 era alta em células basais estriais, fibroblastos do ligamento espiral e endotélio, mas não diferiu entre ouvidos tratados com LPN, LPN-Gd e água (Figs. 11, 12).

Nenhum aumento na apoptose coclear após administração de LPNs

Coloração TUNEL revelou núcleos apoptóticos esparsos distribuídos pela cóclea em todos os grupos, sem elevação nas coortes LPN ou LPN-Gd comparado com controles (Fig. 13). A apoptose ocasional observada na base do estribo e nicho da janela oval é considerada parte da renovação celular normal.

Discussão

Nossos dados demonstram que LPNs intratimpânicos alcançam o ouvido interno eficientemente, atravessando tanto as vias da janela oval quanto redonda, e o fazem sem comprometer as barreiras sangue-perilinfa ou sangue-endolinfa. A ausência de deslocamentos de limiar auditivo e ausência de marcadores inflamatórios ou apoptóticos confirmam que LPNs são bem tolerados na cóclea de ratos. A redução menor na secreção de HA de fibroblastos do ligamento espiral parece clinicamente irrelevante, provavelmente refletindo uma mudança para HA de alto peso molecular, anti-inflamatório, sem induzir mudanças de permeabilidade. Estes achados alinham-se com relatórios anteriores que LPNs de 95 nm são mais eficientes para entrega no ouvido interno e que LPNs maiores (110-115 nm) ainda mantêm segurança.

Importante, o estudo confirma que LPNs não ativam o eixo inflamatório TLR2/CD44, uma via chave implicada em lesão coclear por espécies reativas de oxigênio e toxinas mitocondriais. Portanto, LPNs representam um veículo seguro para entrega direcionada de fármacos ao ouvido interno, suportando sua potencial aplicação clínica em perda auditiva sensorioneural e outras condições otológicas.

Conclusões

A administração transtimpânica de nanocarregadores lipossomais é segura para o ouvido interno de ratos, preservando a integridade da barreira, função auditiva e homeostase celular. LPNs prometem como plataforma de entrega de fármacos para futuras terapias do ouvido interno.

Métodos

Materiais

Lipídios (esfingosina, SOPC, DSPE-PEG-2000), corantes fluorescentes (DiI, TRITC-DHPE), Gd-DOTA (DOTAREM) e nanopartículas de prata (AgNPs) foram obtidos de fornecedores comerciais. A pureza dos lipídios foi verificada por cromatografia em camada delgada; as concentrações foram determinadas gravimetricamente.

Preparação e Caracterização dos LPNs

LPNs unilamelares (~110 nm) encapsulando 500 mM Gd-DOTA (LPN-Gd) e LPNs em branco (~115 nm) foram preparados por um método de hidratação de filme fino descrito anteriormente. Distribuição de tamanho e potencial zeta foram medidos por espalhamento dinâmico de luz.

Administração dos LPNs

Sob anestesia com isoflurano, 50 µl de LPN ou LPN-Gd foi injetado transtimpânicamente no ouvido médio esquerdo via microscópio cirúrgico. O ouvido contralateral recebeu água desionizada como controle negativo. Os animais foram posicionados com o ouvido injetado voltado para cima por 15 min pós-injeção.

Avaliação da Função de Barreira Biológica Usando Gd-MRI

Gd-MRI foi realizada em um scanner Bruker de 4,7 T usando protocolo RARE. O contraste foi administrado por via intravenosa 2 h antes da imagem. Pontos de tempo de imagem variaram de 5 h a 8 dias pós-injeção para capturar mudanças agudas e subagudas.

Resposta do Tronco Cerebral Auditivo (ABR)

Limiares ABR para cliques e rajadas tonais (2-32 kHz) foram registrados no baseline, 2, 4 e 7 dias pós-injeção usando montagem de eletrodos padrão e câmara atenuadora de som.

Análises Histológicas e de Imunofluorescência

Após o ABR final, cócleas foram colhidas, descalcificadas e seccionadas. Colorações hematoxilina-eosina e ácido periódico-Schiff avaliaram inflamação e conteúdo de glicosaminoglicanos. Imunofluorescência para HA, CD44 e TLR2 foi realizada em crioseções, e imagem confocal quantificou intensidades de sinal. Apoptose foi detectada por marcação TUNEL.

Análise Estatística

Dados foram analisados com SPSS 20. ANOVA de uma via e testes de Kruskal-Wallis compararam deslocamentos ABR e intensidades de coloração; testes LSD post-hoc seguiram achados significativos. p < 0,05 foi considerado significativo.