Nano-adsorvente funcionalizado para separação por afinidade de proteínas

Resumo

Nanoesferas de sílica funcionalizadas com tiol (SiO ₂ -SH NSs) com diâmetro médio de 460 nm foram sintetizados por via hidrotérmica. Posteriormente, o SiO ₂ preparado -SH NSs foram modificados por SnO ₂ pontos quânticos para permitir SnO ₂ / SiO ₂ NSs compostos possuindo fluorescência óbvia, que poderia ser usada para rastrear a proteína alvo. O SnO ₂ / SiO ₂ NSs foram posteriormente modificados por glutationa reduzida (GSH) para obter SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs, que podem separar especificamente a glutationa S proteína marcada com transferase (marcada com GST). Além disso, a atividade da peroxidase da glutationa peroxidase 3 (GPX3) separada do SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs in vitro foi avaliado. Os resultados mostram que o SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs exibem adsorção inespecífica desprezível, alta concentração de ligação de proteína (7,4 mg / g) e boas propriedades de reutilização. Nesse ínterim, o GPX3 marcado com GST separado por esses NSs pode reter seu estado redox e atividade de peroxidase. Portanto, o SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs pode encontrar aplicação promissora na rápida separação e purificação de proteínas marcadas com GST.

Histórico

A fácil separação e purificação de proteínas são muito importantes na biotransformação xenobiótica, metabolismo de drogas, biossíntese de prostaglandinas e hormônios esteróides e degradação de aminoácidos aromáticos [1,2,3,4,5,6]. As proteínas separadas podem ser usadas para antígeno e produção de vacina, imunologia molecular e estrutural, e estudos bioquímicos e biológicos celulares. Glutationa S -transferase (GST) representa um grupo principal de isoenzimas de desintoxicação que podem ser usadas no sistema de fusão do gene GST e no campo de direcionamento do efeito do medicamento ou como marcadores tumorais [7, 8]. Vários métodos, como precipitação, cromatografia, ultrafiltração e diálise estão atualmente disponíveis para purificar várias proteínas e, em particular, a separação por afinidade com base na afinidade biológica natural entre macromoléculas biológicas e ligantes complementares é de extraordinária importância [9,10,11,12 , 13,14]. A produção e purificação bem-sucedidas de proteínas de fusão naturais, solúveis e de comprimento total, no entanto, ainda são retardadas por vários obstáculos, como a necessidade de pré-tratamento para remover os resíduos celulares e contaminantes colóides, um tempo de operação relativamente longo e solubilidade da proteína. Essas desvantagens, felizmente, poderiam ser superadas pela aplicação de nanomateriais para auxiliar na separação e purificação das proteínas alvo [15,16,17,18,19]. Por exemplo, SiO magnético ₂ O nanocompósito -NiO é capaz de separar proteínas marcadas com His [20]. Os nanomateriais, no entanto, ainda apresentam pernas curtas na separação de várias proteínas, pois muitas vezes são inativos às técnicas de visualização e fluorescência que podem ser utilizadas como ferramentas biomoleculares e de diagnóstico médico sensíveis para combater a guerra biológica [21,22,23]. Nesse sentido, é imprescindível encontrar nanomateriais com respostas fluorescentes de forma a promover sua aplicação na separação e purificação de proteínas recombinantes como a glutationa peroxidase 3 (GPX3).

Prestamos atenção especial ao SnO em nanoescala ₂ pontos quânticos (QDs), porque, como um semicondutor de banda larga tipo n (3,6 eV) com boa estabilidade química e biocompatibilidade, SnO ₂ exibe absorbância óptica na região espectral visível. Aqui, estabelecemos um caminho inteligente para introduzir SnO fluorescente ₂ QDs na superfície de nanoesferas de sílica (NSs), na esperança de desenvolver um SnO ₂ desejado / SiO ₂ nanoestrutura com potencial aplicação na separação e purificação de proteínas marcadas com GST. Em primeiro lugar, nanoesferas de sílica funcionalizadas com tiol (SiO ₂ -SH NSs) foram preparados por meio de uma rota hidrotérmica. SiO resultante ₂ -SH NSs foram combinados com SnO ₂ pontos quânticos para fornecer SiO ₂ / SnO ₂ NSs compostos possuindo absorção de fluorescência óbvia. O SiO ₂ / SnO ₂ NSs foram posteriormente modificados por glutationa reduzida (GSH) para obter SiO ₂ / SnO ₂ -GSH NSs com potencial para a separação por afinidade da proteína marcada com GST. A capacidade e a atividade da peroxidase do SnO ₂ preparado / SiO ₂ -GSH NSs na separação de proteínas marcadas com GST foram avaliados por análise de SDS-PAGE.

Experimental

Material e métodos

Brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB), cloreto de estanho (IV) (SnCl ₄ ), trietilamina (TEA) e isopropanol foram fornecidos por Tianjin Kermel Chemicals Reagent Company (Tianjin, China). AgNO ₃ foi adquirido da Tianjin Fuchen Technology Development Co., Ltd. (Tianjin, China). O 3-mercaptopropil-trimetoxisilano (MPS) foi oferecido pela Alfa-Aesar (Xangai, China). O ortossilicato de tetraetila (TEOS) foi fornecido pela Tianjin Fuchen Chemicals (Tianjin, China). Fosfato de di-hidronicotinamida adenina dinuclectida (NADPH), tioredoxina e tioredoxina redutase foram obtidos na Sigma (Pequim, China). Glutationa Sepharose 4B (Estocolmo, EUA) era da GE Healthcare. O ditiotreitol (DTT) estava disponível na Aladdin Industrial Corporation (Inalco SPA, Itália). Todos os reagentes químicos eram de reagente analítico e usados sem qualquer purificação adicional.

Preparação de SnO ₂ Pontos quânticos

Em uma síntese típica [24], 3,5 g SnCl ₄ · 5H ₂ O foi adicionado em 50 mL de H ₂ O, então 5 mL de amônia foram adicionados à solução sob agitação. Posteriormente, a precipitação obtida por centrifugação foi lavada várias vezes com água desionizada para remover o excesso de Cl ^- íons. Trinta mililitros de água desionizada foram adicionados ao precipitado obtido e, em seguida, o pH da solução foi ajustado para ser 12 por 2 mol / L de amônia. A solução misturada foi transferida para uma autoclave de aço inoxidável forrada com Teflon, selada e aquecida a 150 ° C por 24 h. Após a conclusão do aquecimento, a solução misturada foi resfriada, centrifugada e totalmente lavada com etanol-isopropanol (proporção de volume 1:1) para obter SnO ₂ QDs.

Preparação de SnO ₂ / SiO ₂ -SH NSs

Em uma síntese típica, 0,2 g SnO ₂ QDs e 0,09 g de CTAB foram dissolvidos no solvente misto de H ₂ O (42,5 mL) e álcool absoluto (7 mL) sob agitação magnética (200 G, r =180 mm). Na solução resultante foram adicionados 2,7 mL de TEA sob 20 min adicionais de agitação. A solução mista foi aquecida a 60 ° C durante 5 h enquanto 3,5 mL de TEOS e 0,35 mL de MPS foram lentamente gotejados, seguido por centrifugação (12.800 G, r =180 mm) e lavagem completa com HCl-etanol (30 mL) e água (30 mL) para obter SnO ₂ / SiO ₂ -SH NSs por três vezes, que foi disperso em água (0,12 g / mL).

Modificação de superfície de SnO ₂ / SiO ₂ -SH NSs

Quatro mililitros de 0,12 g / mL SnO ₂ / SiO ₂ -SH NSs foi lavado com PBS (0,01 mol / L, pH =7,4) por três vezes. Estes SnO ₂ / SiO ₂ -SH NSs foram adicionados a 30 mL de solução de GSH de 16,7 mg / mL e oscilaram a 37 ° C por 24 h (120 rev / min) com um oscilador de temperatura constante. No final da oscilação, a solução misturada foi centrifugada para fornecer SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs; em seguida, o precipitado foi totalmente lavado com 30 mL de PBS (0,01 mol / L, pH =7,4) por três vezes para remover GSH excessivo por meio de adsorção física, proporcionando assim o SnO ₂ desejado / SiO ₂ -GSH NSs. O SnO resultante ₂ / SiO ₂ -GSH NSs foram adicionados ao álcool (25%, v / v ) e armazenado a 4 ° C.

Separação de proteínas marcadas com GST

As proteínas misturadas foram coletadas do lisado celular de Escherichia coli , que é por lise de água (concentração 0,01 mol / L, pH 7,4). Para a expressão da proteína in vitro, a região da proteína contendo a sequência codificadora da glutationa peroxidase 3 (GPX3, aminoácidos 37–206), estômatos abertos 1 (OST1) e insensível ao ABA 2 (ABI2, aminoácidos 100–423) em Arabidopsis thaliana foi clonado e inserido na estrutura no plasmídeo pGEX-6p1 (GPX3 foi usado como controle). Os construtos pGEX-GPX3, pGEX-OST1 e pGEX-ABI2 foram introduzidos em E. coli Células BL21 (DE3). As proteínas marcadas com GST recombinante foram purificadas usando Glutationa Sepharose 4B e SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs. Os primers usados para clonar os genes foram os seguintes:para GPX3, primer forward, 5′- GATGGATCCTCGCCATCGACGGTGGAACAA-3 ′; iniciador reverso, 5′- CACCTCGAGTCAAGCAGATGCCAATAGCTT-3 ′; para OST1, primer direto, 5′- GCCGAATTCATGGATCGACCAGCAGTGA-3 ′; iniciador reverso, 5′- CCCGTCGACTCACATTGCGTACACAATC-3 ′; para ABI2, primer direto, 5′- GCGGAATTCGAGAGTAGAAGTCTGTTTG-3 ′; primer reverso, 5′- GCGCTCGAGTCAATTCAAGGATTTGCTC-3 ′.

Depois de ser lavado com solução de PBS (0,01 mol / L, pH =7,4), o SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs foram introduzidos diretamente em 1000 μL E. coli lisado e agitado a 4 ° C por 2 h (velocidade de rotação:90 rev / min) para permitir o SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs para capturar proteínas marcadas com GST. Após a conclusão da agitação, esses NSs foram isolados da solução por centrifugação e totalmente lavados com solução de PBS para remover quaisquer proteínas residuais não capturadas. SnO ₂ ligado à proteína marcada com GST / SiO ₂ -GSH NSs foram lavados com 300 μL e solução de GSH 0,5 mol / L por três vezes para desassociar proteínas marcadas com GST de sua superfície. Soluções de proteínas coletadas separadamente foram detectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). A concentração das proteínas separadas foi determinada pelo BCA protein Assay Kit. O SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs podem ser reutilizados para separar as proteínas alvo várias vezes pelo mesmo método.

Medição da atividade da glutationa peroxidase

A atividade de GPX3 separada foi medida pela determinação espectrométrica do consumo de NADPH a 340 nm, conforme descrito por Delaunay et al. [25]. A tag GST foi cortada pela protease PreScission do GPX3 marcado com GST e, em seguida, o GPX3 foi usado para análise de atividade. Em primeiro lugar, 98 μL de solução tampão de reação (incluindo 100 mmol / L de Tris-Cl, 0,3 mmol / L de NADPH, 1,34 μmol / L de tiorredoxina e 0,18 μmol / L de tiorredoxina redutase de E. coli lisado) foi adicionado a um tubo; após misturar completamente, 1,35 μmol purificado de GPX3 foi adicionado à solução tampão de reação resultante. Em seguida, a solução misturada foi adicionada a 2 μL de H ₂ O ₂ (5 mmol / L) para iniciar a reação e o consumo de NADPH a 340 nm foi coletado pela determinação espectrométrica.

Análise dos estados redox do GPX3 purificado

A tag GST foi cortada do GPX3 com tag GST pela protease PreScission. O GPX3 separado foi tratado com 5 mmol / L H ₂ O ₂ e 1 mmol / L de DTT durante 10 min para alterar os estados redox do GPX3 purificado. O GPX3 resultante foi usado para análise in vitro dos estados redox. Os extratos foram avaliados por gel não redutor de 15% SDS-PAGE.

Caracterização

A morfologia e composição do SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, JEM-2010, Japão), microscopia eletrônica de varredura (SEM, JSM 5600LV, Japão), difração de raios-X (XRD, X 'Pert Philips, Holanda) e espectrômetro de fluorescência ( FL, FluoroSENS, Grã-Bretanha, no comprimento de onda de excitação de 260 nm). As proteínas marcadas com GST separadas foram detectadas com eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE, Power PAC 300, China), com a tensão de pré-concentração de 70 V e a tensão de separação de 120 V. O oscilador de temperatura constante era da Shanghai ChemStar Instruments , Co., Ltd. (ATS-03M2R, China). A concentração das proteínas separadas foi determinada pelo BCA protein Assay Kit (Beijing CoWin Biotech, China).

Resultados e discussão

TEM, SEM, XRD e análises fluorescentes de SnO ₂ QDs e SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs

A Figura 1 fornece as imagens TEM de alta resolução (HRTEM) e o padrão de XRD do SnO sintetizado ₂ QDs. Pode ser visto que o SnO sintetizado ₂ QDs são de forma esférica e têm um diâmetro médio de 5 nm, que exibe uma distribuição de tamanho de partícula estreita (Fig. 1a), e seu espaçamento de rede do plano (110) é de 0,29 nm (Fig. 1b). A imagem de rede bem resolvida demonstra que o SnO preparado ₂ Os QDs têm uma estrutura cristalina altamente ordenada. Padrão de difração de elétrons de área selecionada correspondente de SnO ₂ Os QDs (Fig. 1c) podem ser indexados a uma única fase Cassiterita, que é consistente com o padrão de XRD relevante (Fig. 1d). Nomeadamente, os picos característicos em 2 teta =26,6 ° (110), 33,9 ° (101), 38,0 ° (200), 51,8 ° (211), 65,9 ° (301) e 78,7 ° (321) são consistentes com o padrão Dados XRD de Cassiterite SnO ₂ (Cartão JCPDS nº 41-1445). Além disso, os picos intensos de XRD indicam que o SnO ₂ preparado Os QDs são bem cristalizados e a ausência de outros picos característicos sugere que eles não contêm hematita ou impurezas de hidróxido.

TEM ( a ), HRTEM ( b ) imagens, padrão de difração de elétrons da área selecionada ( c ) e padrão de XRD ( d ) de SnO preparado ₂ QDs

A Figura 2 fornece as imagens SEM e TEM de SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs. Pode ser visto que o SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs são de forma esférica e têm um diâmetro médio de cerca de 430 nm, e sua superfície parece ser um pouco áspera (Fig. 2a, b). Nesse ínterim, pode ser visto que o SnO ₂ QDs (cerca de 5–15 nm) são modificados na superfície de SiO ₂ microesferas (Fig. 2c, d), que é consistente com as imagens SEM correspondentes. É indicado que o SnO ₂ e os NSs de sílica foram agregados.

SEM ( a , b ) e TEM ( c , d ) imagens do SnO ₂ preparado / SiO ₂ -GSH NSs

A Figura 3a fornece o padrão de XRD do SnO sintetizado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs. Os picos principais em 2 teta =110 °, 101 °, 200 °, 211 °, 301 ° e 321 ° são consistentes com aqueles de SnO ₂ (Fig. 1d). Além disso, SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs mostram um pico característico intenso de sílica amorfa em torno de 23 ° (cartão JCPDS nº 76-0933), o que indica que SnO ₂ possuindo resposta à luz visível foi introduzido com sucesso na superfície de SiO ₂ NSs. A Figura 3b mostra o espectro fluorescente de SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs a 368 nm. Pode ser visto que SnO ₂ / SiO ₂ -GSH exibe emissão fluorescente intensa, que é atribuída a vacâncias de oxigênio de SnO ₂ . A Figura 3c dá a imagem de fluorescência de SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs quando esses NSs são usados para separar GPX3 marcado com GST em E. bobina lisado. Pode ser visto que há fluorescência verde óbvia onde o SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs são usados. Indica que SnO ₂ foi modificado na superfície do SiO ₂ e o SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs têm boas propriedades de fluorescência.

Padrão de XRD ( a ), espectro de fluorescência (b ) e imagens de fluorescência ( c ) de SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs

Análise SDS-PAGE

Para estimar a capacidade do SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs na separação de proteínas marcadas com GST, realizamos análise de SDS-PAGE. A Figura 4 mostra o resultado da análise SDS-PAGE do GPX3 marcado com GST separado por SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs. Pode ser visto que o SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs pode enriquecer eficientemente proteínas alvo de E. coli lisado e, em particular, a quantidade das proteínas dissociadas tende a aumentar com a concentração incremental de GSH na faixa de 10-100 mmol / L (faixas 3-6 na Fig. 4a). É claro que as proteínas alvo podem ser separadas especificamente pelo SnO ₂ preparado / SiO ₂ -GSH NSs do E. coli lisado e quase não havia nenhum inespecífico.

Análise SDS-PAGE de proteínas marcadas com GST purificadas separadas por SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs. a Pista 1, marcador; pista 2, E. coli lisado; as pistas 3-6 referem-se às frações lavadas do SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs com diferentes concentrações de solução de GSH (faixa 1, 10 mmol / L; faixa 2, 20 mmol / L; faixa 3, 50 mmol / L; faixa 4, 100 mmol / L). b Pista 1, marcador; pista 2, E. coli lisado; pista 3, 1ª separação; pista 4, 2ª separação; pista 5, 3ª separação; e pista 6, as frações lavadas da Glutationa Sepharose 4B

A fim de investigar as propriedades reutilizadas do SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs, nós os usamos repetidamente para separar GPX3 marcado com GST. Como mostrado na Fig. 4b (a pista 1 se refere ao marcador, a pista 2 se refere a E. coli contida em GST-GPX3 lisado, pista 3 refere-se à 1ª separação, pista 4 refere-se à 2ª separação, pista 5 refere-se à 3ª separação e pista 6 refere-se às frações lavadas da Glutationa Sepharose 4B), o SnO ₂ sintetizado / SiO ₂ -GSH NSs exibem seletividade especial para GPX3 marcado com GST extraído de E. coli lisado e sua especificidade e afinidade permanecem inalteradas após três ciclos de separação repetida.

Para testar a universalidade do SnO sintetizado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs para purificar proteínas marcadas com GST, selecionamos três tipos de proteínas marcadas com GST (GPX3 marcado com GST, OST1 marcado com GST e ABI2 marcado com GST) para conduzir experimentos. Como mostrado na Fig. 5, as proteínas GPX3, OST1 e ABI2 marcadas com GST podem ser separadas especificamente por SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs do E. coli lisado (pistas 3, 6, 9); então, podemos obter GPX3 (cortar a tag GST de SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs ligando GPX3 com tag GST) e tag GST eluída de SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs (pista 13, o GPX3; pista 14, a etiqueta GST), que tem um efeito semelhante com Glutationa Sepharose 4B (pistas 2, 5, 8, 11, 12). As concentrações de proteínas purificadas por SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs foram 7,4 mg / g (GPX3 marcado com GST), 7,1 mg / g (OST1 marcado com GST) e 6,8 mg / g (ABI2 marcado com GST), o que indica que SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs são bons para purificar proteínas marcadas com GST de E. coli lisado. A fim de comparar a capacidade de ligação entre o SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs e o outro material, Glutationa Sepharose 4B (adquirido em Estocolmo, EUA) foi usado como material de experiência de comparação. As proteínas totais purificadas por Glutationa Sepharose 4B foram 7,1 mg / mL (GPX3 marcado com GST), 6,9 mg / mL (OST1 marcado com GST) e 5,6 mg / mL (ABI2 marcado com GST), respectivamente. Pode ser visto que a capacidade de ligação do SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs é maior do que a mercadoria 4B.

Análise SDS-PAGE das proteínas GPX3, OST1 e ABI2 recombinantes purificadas. Pistas 1, 4 e 7, E. coli lisado; pistas 2, 5 e 8, as proteínas eluídas de Glutationa Sepharose 4B comercial (GE Healthcare, EUA); pistas 3, 6 e 9, as proteínas eluídas de SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs; pista 10, o marcador; pistas 11 e 13, GPX3 obtido após a tag GST ser cortada de Glutationa Sepharose 4B ligada a GST-GPX3 e SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs vinculado a GPX3 marcado com GST; pistas 12 e 14, tag GST eluída de Glutationa Sepharose 4B e SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs

Análise do estado redox e atividade da peroxidase de GPX3 marcado com GST

A fim de analisar o estado redox e a atividade do GPX3 marcado com GST separado pelo SnO ₂ preparado / SiO ₂ -GSH NSs, cortamos a tag GST para obter o GPX3 separado. A Figura 6a mostra determinados ensaios in vitro do estado redox de GPX3 (correspondendo a um gel representativo de três experiências independentes). As pistas 1 e 2 referem-se a GPX3 obtido após a etiqueta GST ser cortada de Glutationa Sepharose 4B ligada a GPX3 marcada com GST (a pista 1 é o GPX3 oxidado e a pista 2 é o GPX3 reduzido); as pistas 3 e 4 referem-se ao GPX3 obtido após a tag GST ser cortada do SnO ₂ / SiO ₂ -GSH ligado a GPX3 marcado com GST (a pista 3 é o GPX3 oxidado e a pista 4 é o GPX3 reduzido); a faixa 5 refere-se ao marcador. Como mostrado na Fig. 6a, o GPX3 purificado separado de Glutationa Sepharose 4B (pistas 1 e 2) e SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs (pistas 3 e 4) têm os estados oxidado e reduzido, e o GPX3 reduzido migra mais lentamente do que a contraparte oxidada. Isso é bem consistente com nossos achados anteriores de que o GPX3 está presente nos estados oxidado e reduzido in vitro, e suas formas reduzida e oxidada podem ser separadas como resultado da modificação dos resíduos Cys reduzidos [26,27,28].

a Ensaios in vitro do estado redox de GPX3:pistas 1 e 3 (o GPX3 oxidado) e 2 e 4 (o GPX3 reduzido) referem-se ao GPX3 obtido após a tag GST ser cortada de Glutationa Sepharose 4B e SnO ₂ / SiO ₂ GPX3 marcado com GST ligado a -GSH, respectivamente; pista 5, marcador. b Ensaios de atividade de peroxidase de GPX3

A Figura 6b mostra os ensaios de atividade de peroxidase de GPX3:linha GPX3 *, ensaio completo do GPX3 purificado na presença de Glutationa Sepharose 4B, tioredoxina, tiorredoxina redutase, NADPH e H ₂ O ₂; linha GPX3, reação completa entre SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs separou GPX3, tioredoxina, tioredoxina redutase, NADPH e H ₂ O ₂; linha No GPX3, reação completa na ausência de GPX3; e linha No Trx, reação completa na ausência de tioredoxina. A Figura 6b mostra a atividade da glutationa peroxidase do GPX3 purificado separado de Glutationa Sepharose 4B e SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs in vitro. Pode-se ver que, com a tiorredoxina como substrato, o GPX3 purificado exibe atividade peroxidase significativa, o que indica que o GPX3 se separou do SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs existe no estado natural.

Conclusões

Um método fácil é estabelecido para fabricar SnO protegido por sílica ₂ Nanoesferas QD (SnO ₂ / SiO ₂ NSs). O SnO ₂ / SiO ₂ NSs são posteriormente modificados pela glutationa para fornecer SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSs para a separação por afinidade de glutationa S proteína recombinante marcada com transferase (marcada com GST). As descobertas indicam que, em termos da capacidade de separar GPX3 marcado com GST, LOV marcado com GST e ABI2 marcado com GST, o SiO ₂ preparado / SiO ₂ -GSH NSs exibem separação específica, alta concentração de ligação a proteínas e boas propriedades de reutilização. Além disso, o GPX3 separado do GPX3 marcado com GST retém seus estados redox in vitro e a atividade GPX também, o que significa que o SnO preparado ₂ / SiO ₂ -GSH NSs pode ter um potencial promissor para a rápida separação e purificação de proteínas marcadas com GST.