Nanoadsorventes Fluorescentes SnO₂/SiO₂ para Captura de Proteínas Marcadas com GST de Alta Eficiência

Resumo

Relatamos uma plataforma de nanoesferas de sílica funcionalizadas com tiol (SiO₂-SH), sintetizada hidrotermicamente e subsequentemente decorada com pontos quânticos de SnO₂. As nanoesferas compostas SnO₂/SiO₂ resultantes exibem fluorescência forte e responsiva à luz visível, permitindo o rastreamento em tempo real da captura de proteínas. A funcionalização com glutationa reduzida (GSH) converte as nanoesferas em SnO₂/SiO₂-GSH, que se ligam especificamente a proteínas marcadas com glutationa S-transferase (GST). Quando aplicadas a lisados de E. coli, os nanoadsorventes apresentam adsorção inespecífica negligenciável, capacidade de ligação proteica de 7,4 mg g⁻¹ e mantêm o estado redox e a atividade peroxidase da glutationa peroxidase 3 (GPX3) isolada. Essas propriedades posicionam as nanoesferas SnO₂/SiO₂-GSH como uma ferramenta promissora para purificação rápida e de alto rendimento de proteínas marcadas com GST.

Introdução

A purificação eficiente de proteínas sustenta avanços no metabolismo de fármacos, biologia estrutural e desenvolvimento de vacinas. Métodos cromatográficos e de precipitação tradicionais são laboriosos e frequentemente comprometem a integridade proteica. A purificação por afinidade, explorando a interação natural entre GST e seu ligante, continua sendo o padrão-ouro para proteínas recombinantes com marcação GST. No entanto, resinas convencionais de afinidade GST (ex.: Glutationa Sepharose 4B) sofrem de capacidade de ligação limitada, alto custo e ausência de relatório visual intrínseco.

Nanomateriais podem superar essas limitações ao oferecer alta área superficial, química ajustável e, quando adequadamente projetados, assinaturas ópticas. Pontos quânticos de SnO₂ são atraentes para bioaplicações: são quimicamente estáveis, biocompatíveis e exibem fluorescência induzida por defeitos que pode ser aproveitada para imagem. Ao ancorar QDs de SnO₂ em nanoesferas de sílica, criamos uma plataforma de dupla função que acopla captura por afinidade com monitoramento por fluorescência.

Materiais e Métodos

Materiais e Procedimentos Gerais

Todos os reagentes eram de grau analítico e utilizados sem purificação adicional. Reagentes-chave incluem CTAB, SnCl₄·5H₂O, TEOS, MPS e GSH. Os QDs de SnO₂ foram preparados via método hidrotérmico, seguidos de fixação superficial em nanoesferas SiO₂-SH e subsequente conjugação com GSH.

Síntese de Pontos Quânticos de SnO₂

SnCl₄·5H₂O (3,5 g) foi dissolvido em 50 mL de H₂O; amônia (5 mL) foi adicionada para precipitar Sn(OH)₄, que foi lavado e redisperso em 30 mL de H₂O. O pH foi ajustado para 12 com NH₄OH 2 M, então transferido para um autoclave revestido de Teflon e aquecido a 150 °C por 24 h. O produto resultante foi coletado, lavado com etanol-isopropanol (1:1) e seco para obter QDs de SnO₂ (~5 nm de diâmetro).

Fabricação de Nanoesferas SnO₂/SiO₂-SH

QDs de SnO₂ (0,2 g) e CTAB (0,09 g) foram dispersos em mistura água-etanol (42,5 mL + 7 mL). TEA (2,7 mL) foi adicionado, seguido por TEOS (3,5 mL) e MPS (0,35 mL) sob agitação a 60 °C por 5 h. A mistura foi centrifugada, lavada com HCl-etanol e água, e redispersa para produzir nanoesferas SnO₂/SiO₂-SH (~460 nm de diâmetro).

Funcionalização com GSH

Nanoesferas SnO₂/SiO₂-SH (4 mL, 0,12 g mL⁻¹) foram incubadas com GSH (16,7 mg mL⁻¹) em PBS (pH 7,4) a 37 °C por 24 h. Após centrifugação e lavagem, as nanoesferas SnO₂/SiO₂-GSH foram armazenadas em 25% de etanol a 4 °C.

Captura por Afinidade de Proteínas Marcadas com GST

GPX3, OST1 e ABI2 marcados com GST foram expressos em E. coli BL21(DE3) a partir de construtos pGEX-6p1. Lisados celulares (pH 7,4, 0,01 M) foram misturados com nanoesferas SnO₂/SiO₂-GSH (1 mL) e rotacionados a 4 °C por 2 h. Após centrifugação e lavagem, proteínas ligadas foram eluídas com 0,5 M GSH, quantificadas por ensaio BCA e analisadas por SDS-PAGE.

Ensaio de Atividade da GPX3

GPX3 purificada foi desmarcada com protease PreScission e ensaiada para atividade peroxidase monitorando consumo de NADPH a 340 nm na presença de tioredoxina, redutase de tioredoxina e H₂O₂.

Análise do Estado Redox

Amostras de GPX3 foram tratadas com H₂O₂ e DTT, então resolvidas em SDS-PAGE 15% não redutor para diferenciar formas oxidadas e reduzidas.

Caracterização

Morfologia e composição foram examinadas por TEM (JEM-2010) e SEM (JSM 5600LV). Padrões de XRD foram registrados em difratômetro X'Pert Philips. Espectros de fluorescência foram medidos com espectrômetro FluoroSENS (excitação 260 nm). Pureza proteica foi avaliada por SDS-PAGE (Power PAC 300). Ensaios BCA foram realizados com kit Beijing CoWin.

Resultados e Discussão

Morfologia, Cristalinitidade e Fluorescência dos Nanoadsorventes

Os QDs de SnO₂ exibiram morfologia esférica monodispersa de ~5 nm com espaçamento de rede de 0,29 nm (plano 110), confirmando alta cristalinitidade (Fig. 1). XRD correspondeu à fase cassiterita (JCPDS 41-1445). As nanoesferas compostas SnO₂/SiO₂-GSH mantiveram forma esférica (~430 nm) com superfície moderadamente rugosa, conforme imagens de SEM e TEM (Fig. 2). A presença de QDs de SnO₂ em SiO₂ é confirmada por TEM (Fig. 2c,d).

Análise de fluorescência revelou pico de emissão forte a 368 nm, atribuível a defeitos de vacância de oxigênio em SnO₂ (Fig. 3b). Imagem de fluorescência das nanoesferas após captura proteica (Fig. 3c) demonstrou luminescência intacta, permitindo rastreamento visual de complexos ligados.

Eficiência de Captura Proteica

SDS-PAGE de GST-GPX3 capturado por nanoesferas SnO₂/SiO₂-GSH mostrou enriquecimento claro da proteína alvo (Fig. 4a). Concentrações crescentes de GSH de eluição (10-100 mM) liberaram progressivamente a proteína ligada, confirmando a especificidade da interação GSH-GST. Os nanoadsorventes exibiram ligação inespecífica negligenciável ao lisado bruto de E. coli.

Testes de reutilização revelaram que as nanoesferas mantiveram sua capacidade de ligação ao longo de três ciclos consecutivos de captura (Fig. 4b), demonstrando sua robustez.

Estendendo a abordagem a outras proteínas marcadas com GST (OST1, ABI2) obteve-se resultados comparáveis (Fig. 5). Capacidades de ligação foram 7,4 mg g⁻¹ (GPX3), 7,1 mg g⁻¹ (OST1) e 6,8 mg g⁻¹ (ABI2), superando a Glutationa Sepharose 4B comercial (7,1, 6,9, 5,6 mg mL⁻¹, respectivamente).

Preservação do Estado Redox e Atividade da GPX3

Após remoção da GST, a GPX3 reteve tanto formas oxidadas quanto reduzidas, evidenciadas por migração distinta em SDS-PAGE não redutor (Fig. 6a). O ensaio de atividade peroxidase (Fig. 6b) demonstrou que a GPX3 isolada via nanoesferas SnO₂/SiO₂-GSH exibiu atividade comparável à obtida com resina comercial, confirmando que o nanoadsorvente preserva a função enzimática.

Conclusões

Desenvolvemos um nanoadsorvente fluorescente, com pontos quânticos de SnO₂ protegidos por sílica, que captura proteínas marcadas com GST com alta especificidade e capacidade, preservando seu estado redox nativo e atividade enzimática. A robusta reutilizabilidade da plataforma, desempenho superior de ligação e fluorescência intrínseca a tornam uma alternativa atraente às resinas de afinidade convencionais para purificação rápida de proteínas.

Abreviações

ABI2:

ABA insensitive 2

CTAB:

Brometo de hexadeciltrimetilamônio

DTT:

Ditiotreitol

GPX3:

Glutationa peroxidase 3

GSH:

Glutationa reduzida

GST-marcada:

Marcada com glutationa S-transferase

MPS:

3-Mercaptopropil-trimetoxissilano

NADPH:

Fosfato de diidronicotinamida adenina dinucleotídeo

OST1:

Open stomata 1

QDs:

Pontos quânticos

SDS-PAGE:

Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

SiO₂-SH NEs:

Nanoesferas de sílica funcionalizadas com tiol

SnCl₄:

Cloreto de estanho (IV)

TEA:

Trietilamina

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

TEOS:

Ortossilicato de tetraetila

XRD:

Difração de raios X