Captação de fotossensibilizador de cloro e6 por nanossistema híbrido de poliestireno-difeniloxazol-poli (N-isopropilacrilamida) estudado por transferência eletrônica de energia por excitação

Resumo

Nanopartículas de poliestireno (PS) -difeniloxazol (PPO) com cadeias de poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAM) reticuladas foram obtidas resultando em nanossistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM (NS). Espectro de fluorescência de clorina e ₆ adicionado ao híbrido PS-PPO-PNIPAM NS revelou transferência de energia de excitação eletrônica (EEET) da matriz PS e PPO encapsulado para clorina e ₆ . A eficiência da EEET aumentou fortemente durante 1 h após clorina ₆ adição, indicando que a absorção de clorina e ₆ por PNIPAM parte do híbrido NS ainda prossegue durante este tempo. Aquecimento de PS-PPO-PNIPAM-chlorin e ₆ NS de 21 a 39 ° C resulta em um aumento da eficiência EEET; isso é consistente com a transição de conformação PNIPAM que reduz a distância entre os doadores PS-PPO e clorina e ₆ aceitantes. Enquanto isso, uma parte relativamente pequena de chlorin e ₆ presente na solução está vinculado ao PNIPAM; portanto, novos estudos nesse sentido são necessários.

Histórico

A principal desvantagem da terapia fotodinâmica do câncer é a baixa profundidade de penetração do feixe de excitação no tecido [1]. Assim, a abordagem da terapia radiodinâmica para o tratamento do câncer (onde o sensibilizador poderia ser eficientemente excitado com os raios X capazes de penetrar profundamente no corpo) foi proposta [2] e é intensamente estudada nos últimos anos [3,4,5]; um dos escopos de pesquisa é o desenvolvimento de sensibilizadores que geram oxigênio singlete por excitação de raios-X [5,6,7,8]. O processo chave em tal sensibilizador de raios-X é a transferência de energia de excitação eletrônica (EEET) entre seus componentes cintilantes e sensibilizadores [2, 6, 9,10,11]. Outro componente importante do sensibilizador de raios X mencionado é a maneira de manter as partes cintilantes e sensibilizadoras juntas na distância ideal para EEET; conjugação química [2, 3], atração eletrostática [8, 12], surfactante [11] ou casca de polímero [4] podem ser mencionadas. Anteriormente, nos quadros de projeto de nanossistemas (NS) para sensibilização excitada por raios-X de oxigênio singlete, estudamos EEET em poliestireno (PS) -difeniloxazol (PPO) -cloro e ₆ NS, onde fotossensibilizador chlorin e ₆ foi ligado à nanopartícula de PS-PPO (que pode ser usado como cintilador [13, 14]) via revestimento de surfactante (dodecilsulfato de sódio) [15].

A poli (N-isopropilacrilamida) (PNIPAM) pertence a materiais responsivos a estímulos que mudam suas propriedades em resposta a estímulos internos ou externos [16]. PNIPAM linear é conhecido por sofrer transição conformacional após aquecimento, ou seja, o polímero encolhe (devido a se tornar hidrofóbico e, portanto, expelir moléculas de água) em temperaturas acima da temperatura de solução crítica mais baixa (LCST) que é igual a 32 ° C para PNIPAM linear [17] . Diminuição considerável na largura do shell PNIPAM após a transição de temperatura sobre LCST foi mostrado para nanopartículas PS-PNIPAM em [17]. Ao mesmo tempo, para as cadeias PNIPAM conjugadas com dextrano, a temperatura de transição de conformação mostrou ser 2–4 ° C mais alta em comparação com PNIPAM linear de peso molecular semelhante e polidispersidade devido à interação estérica entre as cadeias PNIPAM que impedem a conformação transição [18].

Neste trabalho, nanopartículas de PS-PPO cobertas pela casca de PNIPAM reticulada (Figs. 1 e 2) foram obtidas resultando em PS-PPO-PNIPAM híbrido NS. A possibilidade de usar PNIPAM reticulado para anexar clorina e ₆ foi estudado o sensibilizador ao cintilador PS-PPO NP. Este polímero tem transição conformacional em temperaturas fisiológicas (para PNIPAM reticulado, LCST deve ser superior a 32 ° C). Assim, o encolhimento da rede PNIPAM reticulada após aquecimento sob excitação pode resultar na diminuição da distância entre o doador PS-PPO e o clorina ₆ aceitador que aumentaria a eficiência da EEET e, portanto, a eficiência da destruição do tumor.

Experimental

Materiais

Estireno (ST, Ucrânia) da p.a. a qualidade foi purificada através do método padrão diretamente antes da polimerização. N-Isopropilacrilamida (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N, N′-metilenobisacrilamida (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), persulfato de potássio K ₂ S ₂ O ₈ (KPS, Ucrânia), fosfato de sódio monobásico desidratado NaH ₂ PO ₄ × 2H ₂ O (Ucrânia) e o surfactante aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) eram de grau reagente e usados sem purificação adicional. Cloro e ₆ (Frontier Scientific Inc.) foi gentilmente cedido por T.Y. Ohulchanskyy (Instituto de Lasers, Fotônica e Biofotônica da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo). Cinquenta milimolares de tampão TRIS-HCl (pH 7,2) foram usados como solvente.

Síntese e caracterização de nanossistemas

Os nanossistemas híbridos de poliestireno-poli (N-isopropilacrilamida), dopados com PPO (híbrido PS-PPO-PNIPAM NS), foram sintetizados como segue. Primeiro, nanopartículas de núcleo PS-co-PNIPAM dopadas com PPO foram preparadas por polimerização em microemulsão [13, 14, 19, 20]. Resumidamente, 0,2 g de NIPAM, 0,2 g de dodecilsulfato de sódio e 0,01 g de NaH ₂ PO ₄ × H ₂ O foram dissolvidos em 90 g de H ₂ O. Em seguida, 0,09 g de PPO foi dissolvido em 1,8 g de estireno e a mistura obtida foi adicionada gota a gota durante 30 min, também. A mistura foi agitada a 700 rpm e Ar foi borbulhado na mistura durante 30 min. Depois que a temperatura aumentou para 70 ° C, 0,01 g de K ₂ S ₂ O ₈ dissolvido em 1 ml de H ₂ O foi injetado para iniciar a polimerização. Em segundo lugar, a camada de revestimento PNIPAM foi fabricada após 4 h de aquecimento a 70 ° C. Para tanto, solução aquosa de monômero NIPAM (0,69 g) e reticulador N, N′-metilenobisacrilamida (BIS) (0,06 g) foram adicionados ao reator por meio de uma seringa. A reação foi deixada continuar por 3 h a 70 ° C e mais 1 h a 90 ° C. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e dialisada durante 48 h usando membrana de celulose com MWCO 3500 Da.

Imagens de microscopia eletrônica de transição (TEM) dos nanossistemas obtidos são apresentadas na Fig. 2. Para a preparação da amostra, grades de Cu 400 mesh com filme de carbono simples foram tornadas hidrofílicas por um tratamento de descarga luminosa (Elmo, Cordouan Technologies Bordeaux França). Uma gota de 5 μl foi depositada e deixada adsorvida por 1 min, em seguida o excesso de solução foi removido com um pedaço de papel filtro. As observações dos nanossistemas PS-PPO-PNIPAM foram realizadas em dois TEMs, Tecnai G2 ou CM12 (FEI, Eindhoven, Holanda), e as imagens foram adquiridas com uma câmera ssCCD Eagle no Tecnai e uma câmera Megaview SIS no CM12. É visto na Fig. 2 que os nanossistemas híbridos obtidos consistem em vários PS-PPO NP esféricos ligados; acreditamos que eles são ligados por rede de polímero PNIPAM reticulado. Assim, os nanossistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM foram obtidos.

Medições espectrais e preparação de amostras

Os espectros de absorção foram medidos usando um espectrofotômetro Specord M40 (Carl Zeiss, Alemanha). Os espectros de excitação e emissão de fluorescência foram registrados com a ajuda de um espectrofotômetro fluorescente Cary Eclipse (Varian, Austrália). As medições de absorção e fluorescência foram realizadas em células de quartzo de 1 × 1 cm em temperatura ambiente. Cinquenta milimolares de tampão TRIS-HCl, pH 7,2, foram usados como solvente. Para medições espectrais, a solução obtida de híbrido PS-PPO-PNIPAM NS foi dissolvida 100 vezes em tampão. Solução estoque de clorina e ₆ na concentração de 10 mM foi preparado em DMF e posteriormente diluído em tampão para a concentração de 1 mM. Uma pequena alíquota desta solução 1 mM de clorina e ₆ foi então adicionado a 100 vezes de solução tampão dissolvida de NS; a concentração final de clorina e ₆ foi de 2 μM e a mistura de DMF foi, portanto, de 0,02%. Excitação de fluorescência e espectros de emissão de solução híbrida NS de PS-PPO-PNIPAM com clorina e ₆ foi medido em 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 min após a adição de clorina e ₆ à solução de PS-PPO-PNIPAM híbrido NS. Em quase 80 min, a saturação foi atingida.

Para medições dependentes da temperatura, solução de híbrido PS-PPO-PNIPAM NS na presença de clorina e ₆ foi colocado no suporte de célula com termostato ( T =23 ° C). Em 88 min após a preparação da amostra, após a absorção de clorina e ₆ por PS-PPO-PNIPAM híbrido NS atingiu a saturação, o fluxo de água do banho-maria foi ligado aquecendo a amostra a 39 ° C (esta temperatura deve exceder LCST para o PNIPAM reticulado). Espectro de excitação de fluorescência de clorina e ₆ (emissão a 680 nm) foram então medidos em diferentes intervalos de tempo após o aquecimento ter sido iniciado. Os resultados experimentais afirmam que a transição da conformação começa cerca de 3 minutos após o aquecimento ter sido iniciado. Deve ser mencionado que em cerca de 18 min após o início do aquecimento, ocorreu a coagulação do SN dando origem a coágulos macroscópicos (que entretanto desaparecem após o resfriamento da solução, sendo a coagulação reversível). O experimento de temperatura foi realizado três vezes, e tendências semelhantes foram obtidas.

Resultados e discussão

Os espectros de absorção, excitação de fluorescência e emissão de fluorescência dos nanossistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM obtidos em tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) são apresentados na Fig. 3. O espectro de absorção contém as bandas correspondentes ao estireno (máximo próximo a 260 nm ) e PPO (máximo próximo a 307 nm). Ao mesmo tempo, o espectro de emissão de fluorescência após excitação em 250 nm (a faixa de absorção de estireno) resultou no espectro que pertence exclusivamente ao PPO (com máximo em 367 nm), enquanto a emissão de estireno (devido em 307 nm) [15] ) não foi observada. Assim, o EEET do estireno ao PPO incorporado está quase completo. EEET também é suportado pelo espectro de excitação de emissão de PPO (380 nm), onde a banda de estireno perto de 260 nm é claramente observada (Fig. 3). Deve-se acrescentar que uma estrutura vibrônica clara pode ser observada no espectro de emissão de PPO (o que não é observado para a solução aquosa de PPO [14]) que adicionalmente aponta para a incorporação de PPO na matriz de PS.

Além disso, para a solução dos nanossistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM obtidos em tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), o fotossensibilizador clorina e ₆ foi adicionado. Espectro de absorção de clorina e ₆ mostra quase nenhuma mudança na presença de nanossistemas híbridos em comparação com a solução tampão, exceto pequena diminuição da densidade óptica no máximo (Fig. 4).

Ao mesmo tempo, efeito da adição de clorina e ₆ para PS-PPO-PNIPAM híbrido NS em espectros de fluorescência é muito mais perceptível em comparação com os de absorção. Em primeiro lugar, a presença de clorina e ₆ leva à extinção da emissão fluorescente de PPO do híbrido NS de PS-PPO-PNIPAM, e esta extinção aumenta durante cerca de uma hora (Fig. 5). Geralmente, tal extinção poderia ser devido a qualquer EEET (que levaria à extinção da emissão do doador em todos os comprimentos de onda de emissão) ou reabsorção (que levaria à extinção da emissão do doador nos comprimentos de onda da absorção do aceitador). As diferenças dos espectros de emissão de PPO (Fig. 5) mostram que imediatamente após clorina e ₆ Além disso, a contribuição da reabsorção para a extinção das emissões de PPO é significativa (mas a EEET também ocorre). Ao mesmo tempo, a contribuição da reabsorção diminui ainda mais com o tempo e a da EEET aumenta.

Outro efeito da adição de clorina e ₆ para PS-PPO-PNIPAM híbrido NS é o aparecimento de clorina e ₆ emissão (mediante excitação de PS a 250 nm) que é desviada para a região de comprimento de onda longo em comparação com a de clorina livre e ₆; tanto a intensidade quanto o deslocamento aumentam com o tempo e atingem a saturação em cerca de uma hora (Fig. 6). Esta mudança aponta para a influência do PNIPAM circundante nas moléculas ligadas de clorina e ₆ . Ao mesmo tempo, emissão de clorina e ₆ após excitação para sua própria absorção (a 400 nm) é apenas ligeiramente alterado na presença de PS-PPO-PNIPAM NS. Junto com a pequena mudança no clorina ₆ absorção (Fig. 4), isso significa que apenas uma pequena parte de clorina e ₆ moléculas está ligada a PS-PPO-PNIPAM NS.

Finalmente, a banda PS-PPO aparece no espectro de excitação de clorina e ₆ adicionado ao híbrido NS PS-PPO-PNIPAM (emissão a 680 nm, onde a contribuição da clorina ligada ao PNIPAM e ₆ para a emissão total de clorina e ₆ está próximo do máximo). Esta banda é fraca no início, mas além disso, sua intensidade aumenta fortemente com o tempo (Fig. 7). Ao mesmo tempo, esta banda PS-PPO é muito fraca no espectro de excitação de clorina e ₆ após a emissão a 660 nm (ou seja, no máximo de clorina livre e ₆ espectro) mesmo após 100 min após a adição de clorina e ₆ .

Assim, chlorin e ₆ liga-se a PS-PPO-PNIPAM híbrido NS que causa EEET da matriz de PS e PPO encapsulado em clorina e ₆ . Eficiência EEET aumenta com o tempo (durante cerca de uma hora após clorina ₆ adição), indicando que a absorção de clorina e ₆ pela rede PNIPAM de PS-PPO-PNIPAM híbrido NS ainda prossegue durante este tempo. Ao mesmo tempo, uma parte relativamente pequena de clorina e ₆ presente na solução está vinculado ao PNIPAM.

Também deve ser mencionado que PS-PPO NP foi mostrado para emitir a fluorescência de PPO [14] ou porfirina ligada [13] quando excitado com raios-X. Assim, EEET de PS para clorina e ₆ observado em PS-PPO-PNIPAM híbrido NS sob a excitação de PS significa que a energia dos raios-X também pode ser transferida para clorina e ₆ no NS estudado. Ao mesmo tempo, uma concentração bastante elevada de PS-PPO NP é necessária para a observação direta da emissão estimulada por raios X de tal NP [13, 14]. Uma das maneiras de aumentar a sensibilidade de tais NS aos raios X poderia ser a adição de componentes contendo átomos pesados.

PNIPAM é conhecido por experimentar a transição de conformação em LCST igual a 32 ° C. Para o polímero reticulado, o valor LCST deve ser ainda mais alto. Se nosso híbrido PS-PPO-PNIPAM NS consiste em rede PNIPAM reticulada em torno de PS-PPO NPs e clorina e ₆ está vinculado à rede PNIPAM, podemos esperar a diminuição de PPO-chlorin e ₆ distância e, portanto, o aumento da eficiência EEET ao aquecer todo o híbrido NS.

Para verificar esta ideia, o efeito do aquecimento do híbrido PS-PPO-PNIPAM NS na presença de clorina e ₆ nos espectros de excitação de fluorescência de clorina e ₆ foi estudado. A experiência de aquecimento foi realizada três vezes; tendências semelhantes foram demonstradas. Os resultados de uma dessas experiências são apresentados nas Figs. 8 e 9. Assim, a solução de PS-PPO-PNIPAM híbrido NS na presença de clorina e ₆ foi aquecido à temperatura de 39 ° C (esta temperatura deve exceder LCST para o PNIPAM reticulado); o aquecimento começou após a absorção de clorina e ₆ pelo híbrido PS-PPO-PNIPAM, o NS atingiu a saturação. Durante o aquecimento, a proporção de clorina é ₆ intensidades de fluorescência (emissão a 680 nm) após excitação a 320 nm ( I _ex320; isto é clorina e ₆ emissão devido a PPO-para-clorina e ₆ EEET) e 404 nm ( I _ex404; isto é clorina e ₆ emissão por excitação para sua própria banda de Soret) foi estudada (Figs. 8 e 9); acreditamos que esta proporção reflete a eficiência de PPO-para-clorina e ₆ EEET. Assim, os primeiros 3 minutos após o início do aquecimento, eu _ex320 / eu _ex404 diminuiu de 0,9 para 0,85, talvez devido à diminuição do clorina e ₆ -para-PNIPAM afinidade de ligação após aumento de temperatura. Além disso, o valor de I _ex320 / eu _ex404 a razão aumentou até 1,02, o que foi acompanhado pelo aumento do espalhamento de luz (Fig. 8; o espalhamento se manifesta com o aumento de intensidade próximo a 660 nm). Isso pode ser explicado pela transição de conformação no PNIPAM que leva à redução do volume da rede PNIPAM reticulada. Isso causa a diminuição da distância entre o doador PS-PPO e o clorina ₆ moléculas aceitadoras ligadas à rede PNIPAM e, portanto, para aumento da eficiência EEET.

Em resumo, os processos na solução de híbrido PS-PPO-PNIPAM NS na presença de clorina e ₆ adição pode ser descrita como segue. Primeiro, adição de clorina e ₆ à solução de PS-PPO-PNIPAM híbrido NS em tampão (Fig. 10, processo 1) leva à penetração da pequena parte de clorina e ₆ na rede PNIPAM do NS híbrido; isso resultou em EEET de PS e PPO para clorina e ₆ . Essa penetração prossegue durante cerca de uma hora acompanhada com o aumento na eficiência EEET (Fig. 10, processo 2). O aquecimento adicional da amostra à temperatura que excede LCST resulta na transição de conformação da rede PNIPAM que leva à diminuição da distância entre PS-PPO e clorina ₆ moléculas e, portanto, para um aumento ainda maior de PS-PPO-para-clorina e ₆ Eficiência EEET (Fig. 10, processo 3).

Conclusões

O estudo fluorescente revelou a absorção de clorina e ₆ por PS-PPO-PNIPAM híbrido NS, bem como transferência de energia de excitação eletrônica da matriz PS via PPO encapsulado para clorina e ₆; a captação atingiu a saturação em cerca de uma hora.

Aquecimento de PS-PPO-PNIPAM-chlorin e ₆ NS de 21 a 39 ° C resulta em aumento da eficiência EEET; isso é consistente com a transição de conformação PNIPAM que reduz a distância entre os doadores PS-PPO e clorina e ₆ aceitantes.

Enquanto isso, uma parte relativamente pequena de chlorin e ₆ presente na solução está vinculado ao PNIPAM; portanto, novos estudos nesse sentido são necessários.

Abreviações

EEET:: Transferência eletrônica de energia de excitação
LCST:: Temperatura crítica mais baixa da solução
NS:: Nanossistema
PNIPAM:: Poli-N-isopropilacrilamida
PPO:: Difeniloxazol
PS:: Poliestireno
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão

Aprimoramento significativo de fotodetetores de metal semicondutor de metal MgZnO por meio de acoplamento com plasmons de superfície de nanopartículas de Pt Nano-adsorvente funcionalizado para separação por afinidade de proteínas

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