Dispositivo microfluídico fabricado diretamente em eletrodos impressos na tela para detecção eletroquímica ultrassensível de PSA

Resumo

Como fabricar dispositivo microfluídico de baixo custo em escala para detecção de biomarcadores é um grande requisito. Aqui, é pela primeira vez relatado que um novo dispositivo microfluídico baseado na ligação de canais microfluídicos de polidimetilsiloxano ao substrato de um eletrodo impresso em tela com solução de vidro de revestimento foi fabricado para detecção eletroquímica do antígeno específico da próstata (PSA). Comparado aos processos tradicionais de microfabricação, este método é simples, rápido, de baixo custo e também adequado para produção em massa. O dispositivo microfluídico baseado em eletrodo impresso em tela (CASPE-MFD) foi usado para a detecção de PSA em soro humano. O CASPE-MFD preparado tinha um limite de detecção de 0,84 pg / mL (25,8 fM) e uma boa linearidade com concentração de PSA variando de 0,001 a 10 ng / mL, que se mostrou uma grande plataforma promissora para o desenvolvimento de produtos eletroquímicos miniaturizados de baixo custo dispositivo microfluídico para uso em saúde humana, monitoramento ambiental e outras aplicações.

Histórico

Sistema microfluídico é o processo de manipulação de fluidos de pequeno volume (10 ⁻⁹ a 10 ⁻¹⁸ L) dentro de canais com uma dimensão de dezenas a centenas de micrômetros [1]. Essa tecnologia tem mostrado grande potencial em biomedicina, monitoramento ambiental e análise de segurança alimentar. Em particular, os dispositivos microfluídicos (MFDs) normalmente exibem as seguintes vantagens, incluindo pequenas pegadas, consumo reduzido de reagentes, detecção de múltiplas amostras em paralelo, maior confiabilidade, sensibilidade e integração de alta e grande escala [2,3,4].

Os sensores eletroquímicos foram amplamente integrados e hifenizados com amostragem, manuseio de fluidos, separação e outros cenários de detecção de engenharia [5]. A aplicação de sensores eletroquímicos para detecção de biomoléculas é promissora, uma vez que os sensores eletroquímicos exibem inúmeras vantagens, como alta sensibilidade e seletividade, reprodutibilidade confiável, uso simples para análise contínua no local, preparação mínima de amostra, custo relativamente baixo e resposta de curto tempo. O sistema eletroquímico pode ser facilmente integrado dentro de um sistema microfluídico [6, 7], e isso oferece vantagens sobre uma plataforma analítica convencional [8,9,10], como facilidade na preparação da amostra, excelente sensibilidade e versatilidade e a remoção de volumosos componentes ópticos [11, 12].

Neste estudo, uma estratégia simples, barata e versátil foi usada para a fabricação de DMFs de detecção eletroquímica usando eletrodos impressos em tela disponíveis no mercado para diagnóstico em ponto de atendimento. O dispositivo desenvolvido foi definido como CASPE-MFDs (dispositivos microfluídicos baseados em eletrodos impressos em tela disponíveis comercialmente). Os canais microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) foram primeiramente padronizados usando fotolitografia padrão e os CASPE-MFDs foram fabricados ligando diretamente canais microfluídicos PDMS em um eletrodo impresso em tela disponível comercialmente (Fig. 1). O eletrodo serigrafado foi usado diretamente e revestido por uma fina camada de vidro usando a abordagem sol-gel [13]. Posteriormente, os canais microfluídicos de PDMS foram ligados ao eletrodo após o tratamento com plasma de suas superfícies. Os CASPE-MFDs são capazes de quantificar a concentração de vários analitos em fluidos biológicos, como solução tampão de fosfato (PBS) e amostras de soro. Os CASPE-MFDs foram usados para demonstrar a detecção e quantificação do biomarcador do antígeno prostático específico (PSA) em soluções tampão de PBS e amostras de soro humano usando cronoamperometria (CA) e voltametria de onda quadrada (SWV). A detecção de PSA neste dispositivo mostrou uma alta sensibilidade, e o limite de detecção (LOD) para PSA é de 0,84 pg / mL (25,8 fM). O LOD é mais de 100 vezes mais sensível do que o limite clínico de detecção de 0,1 ng / mL para ensaios comerciais [14] e melhor do que outros dispositivos [3, 15, 16]. O CASPE-MFD é portátil, simples de usar e tem potencial para integrar outros componentes, como preparação de amostras e sistemas de separação.

a Processo de fabricação dos canais microfluídicos PDMS padronizados pela fotolitografia SU-8. b Processo de fabricação para o dispositivo microfluídico baseado em eletrodo impresso em tela disponível comercialmente. O CASPE-MFD compreende canais microfluídicos PDMS, dois eletrodos de ouro impressos como eletrodos de trabalho e contra e um eletrodo de prata impresso como eletrodo de pseudo-referência. c Um dispositivo microfluídico baseado em eletrodo impresso em tela disponível comercialmente

Materiais e métodos

Reagentes e materiais químicos

O antígeno específico da próstata (PSA) e o anticorpo multiclonal anti-PSA peroxidase de rábano (HRP) foram adquiridos na Petsec Energy Ltd. Anticorpo anti-PSA biotinilado, contas magnéticas de estreptavidina, albumina de soro bovino e hidroquinona eram da Fisher Scientific. Tween-20, peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂; 30%) e ácido ferrocenocarboxílico eram da Sigma-Aldrich. SU-8 2075 era da MicroChem Corp. O pré-polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) e o agente de cura foram adquiridos da Dow Corning. Todos os imunoreagentes foram dissolvidos em soluções tampão de PBS 1 × pH 7,4 da KD Medical Solutions. Todos os reagentes químicos foram preparados com água ultrapura de um sistema de purificação de água Millipore Milli-Q.

Instrumentação

O microscópio de fluorescência foi realizado em um Olympus U-CMAD3 (Olympus, Japão). Os dispositivos μCSPE foram fabricados por um limpador de Plasma PDC-32G (Harrick Plasma, EUA). Todas as medições eletroquímicas foram realizadas por CHI 760B (CHI, China) com um sistema convencional de três eletrodos, que consiste em dois eletrodos de ouro impressos como eletrodo de trabalho e contra-eletrodo, respectivamente, e um eletrodo de prata impresso como eletrodo de pseudo-referência (Fig. 1 )

Fabricação de chips microfluídicos

Os canais microfluídicos PDMS foram padronizados usando fotolitografia padrão. Resumidamente, um wafer de silício, enxaguado com uma solução mista (H ₂ SO ₄ / H ₂ O ₂ =7/3) seguido por água ultrapura limpa, foi revestido com fotoresiste SU-8 2075. O wafer foi então cozido a 65 ° C por 7 min seguido por 95 ° C por 40 min para remover solventes e fotoexposta à luz ultravioleta por 15 s através de uma fotomáscara. Todo o sistema foi cozido a 65 ° C durante 5 min seguido por 95 ° C durante 15 min para estabilizar a polimerização. O fotorresiste não polimerizado foi removido embebendo o wafer de silício no revelador SU-8 e lavando com isopropanol e água desionizada. As misturas de solução de pré-polímero de PDMS e agente de cura (10,1) foram moldadas sobre o wafer de silício pré-descrito, curadas a 65 ° C por 2 h e removidas [17].

O eletrodo impresso disponível comercialmente foi revestido com uma camada de vidro usando a abordagem sol-gel. Resumidamente, tetra etoxissilano (TEOS), MTES, etanol e água foram totalmente misturados na proporção de 1:1:1:1 e sonicados por 5 min. As misturas foram colocadas em um forno a 65 ° C durante a noite. O eletrodo foi colocado em uma placa quente por 5 min a 80 ° C antes do revestimento do vidro e então untado com as misturas precursoras usando uma escova para evitar que as misturas invadissem a superfície do eletrodo. O eletrodo foi seco em temperatura ambiente após o esfregaço. O chip PDMS e o eletrodo coberto de vidro foram então processados com O ₂ plasma por 30 se aderidos um ao outro.

Experimentos cronoamperozmétricos

Os experimentos cronoamperométricos foram realizados em 1 × pH 7,4 PBS contendo hidroquinona 4,5 mM e soluções de peróxido de hidrogênio 0,1 mM em um potencial de etapa de - 2,0 mV (vs. um eletrodo de pseudo-referência de prata) e gerou a curva de calibração para a concentração de PSA de 0 a 10 ng mL ⁻¹ . Resumidamente, injetamos 50 μL de 0,2 mg mL ⁻¹ anticorpo anti-PSA conjugado com grânulo magnético para dispositivos μCSPE a uma taxa de 50 μL min ⁻¹ , e lavado completamente usando 100 μL pH 7,4 PBS a uma taxa de 50 μL min ⁻¹ . Além disso, 50 μL de um tampão de bloqueio (0,05% ( v / v ) Tween-20 e 2% ( w / v ) albumina de soro bovino (BSA) em PBS) foi injetada na taxa de 10 μL min ^-1 e incubado por 30 min sob condição de 37 ° C, lavado completamente usando 100 μL de pH 7,4 PBS a uma taxa de 50 μL min ⁻¹ . Então, 50 μL de diferentes concentrações de PSA foram injetados a uma taxa de 10 μL min ⁻¹ com incubação por 30 min a 37 ° C e lavado completamente usando 100 μL de pH 7,4 PBS a uma taxa de 50 μL min ⁻¹ . Além disso, 50 μL de anticorpo anti-PSA conjugado com HRP (diluição 1:1000) foram injetados a uma taxa de 10 μL min ⁻¹ , incubado por 30 min a 37 ° C e lavado completamente usando 100 μL de pH 7,4 PBS a uma taxa de 50 μL min ⁻¹ . Finalmente, injetamos 50 μL de 1 × pH 7,4 PBS contendo 4,5 mM de hidroquinona e soluções de peróxido de hidrogênio 0,1 mM a uma taxa de 50 μL min ⁻¹ . Depois que a corrente de pico está estável, calculamos a média das três medições de corrente e calculamos o desvio padrão correspondente. Por fim, foi realizada uma cronoamperometria no potencial constante de 4 mV, em oito repetições para cada grupo. Para garantir que o CASPE-MFD esteja na melhor condição sempre durante o experimento eletroquímico, o eletrodo do CASPE-MFD foi ativado primeiro por varredura dentro da faixa de potencial 0,5 a 1,5 V por 10 ciclos em 0,5 MH recentemente preparado ₂ SO ₄ soluções usando voltametria cíclica. A característica típica do voltamograma do ouro policristalino limpo foi apresentada. Em seguida, o CASPE-MFD foi lavado com água ultrapura e soluções de PBS.

Resultados e discussão

Preparação de CASPE-MFDs

A distribuição homogênea foi usada para investigar a utilidade do CASPE-MFD. Uma solução de microesferas fluorescentes foi injetada nos canais de um CASPE-MFD a uma taxa de fluxo de 5 μL / min, e é óbvio que todos os cantos do CASPE-MFD foram preenchidos com a solução de microesferas fluorescentes e nenhuma bolha foi formada no dispositivo (Fig. 2). A vazão foi aumentada para 100 μL / min a fim de comprovar a robustez do CASPE-MFD, que mostrou que o dispositivo é adequado para detecção de analito.

a Fotoeletrodo impresso em tela usado para obter imagens de fluorescência. b Imagem de fluorescência de CASPE-MFD. Usamos um fotoeletrodo como imagem de fluorescência modelo para demonstrar que a área de trabalho está cheia de corantes e não tem bolhas no CASPE-MFD. c Desenho parcial ampliado da imagem de fluorescência

O processo de fabricação também foi investigado por voltamogramas cíclicos como mostrado na Fig. 3. O ácido ferrocenocarboxílico foi usado como o composto redox-ativo modelo, e a Fig. 3a mostra a relação das correntes de pico redox com diferentes taxas de varredura de potencial. O pico redox das curvas CV exibe uma reação eletroquímica reversível típica, na qual a taxa de reação é governada pela difusão das espécies eletroativas para a superfície do eletrodo. A separação de potencial entre o potencial catódico de pico ( E _pc ) e potencial anódico de pico ( E _pa ) é 62 mV, que está perto do valor teórico de 59 mV para o par redox do ferroceno. Além disso, a posição dos potenciais de pico não se altera em função das taxas de varredura do potencial e da corrente de pico anódica ( i _pa ) é aproximadamente igual à corrente de pico catódica ( i _pc ) na faixa de 10 a 350 mV / s. O comportamento reversível é correspondente ao sinal na solução em massa (arquivo adicional 1:Fig. S1A), o que indica que nenhuma reação lateral ocorre e que, como esperado, a cinética de transferência de elétrons é suficientemente rápida para manter as concentrações de redox na superfície -espécies ativas nos valores exigidos pela equação de Nernst. A Figura 3b mostra que tanto a corrente de pico anódica ( i _pa ) e corrente de pico catódica ( i _pc ) foram proporcionais à raiz quadrada das taxas de varredura, implicando em um processo de difusão controlada típico [18]. Além disso, a corrente medida em CASPE-MFDs é bastante próxima ao valor da corrente na solução em massa (Arquivo adicional 1:Fig. S1B), o que indicou que uma análise no dispositivo não sacrifica sua sensibilidade.

a Voltamogramas cíclicos de ácido carboxílico ferroceno 0,5 mM em solução aquosa de KCl 0,1 M (pH 7,0) em CASPE-MFD em diferentes taxas de varredura (ascendendo ao longo do y -eixo):10, 25, 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300 e 350 mV / s. b Gráficos de calibração do anódico ( i _pa ) e corrente de pico catódica ( i _pc ) vs a taxa de varredura quadrada. As duas linhas representam uma curva linear com equação de regressão, respectivamente: Y ( eu _pa ) =0,9932 X - 0,2563 ( R ² =0,9996, n =8); Y ( eu _pc ) =- 0,9384 X - 0,1774 ( R ² =0,9996, n =8)

Desempenho dos CASPE-MFDs na detecção de PSA

Relatórios recentes indicaram que a concentração de antígeno específico da próstata (PSA) na faixa de 4 a 10 ng / mL geralmente indica uma alta probabilidade de presença de carcinoma de próstata [19]. Portanto, o PSA foi escolhido como um alvo para avaliar o desempenho do CASPE-MFD preparado (Fig. 4). A Figura 4a mostra que o CASPE-MFD preparado pode ser conectado diretamente a uma estação de trabalho eletroquímica portátil. Como mostrado na Fig. 4c, o anticorpo anti-PSA conjugado com grânulo magnético foi imobilizado na superfície do eletrodo de ouro (eletrodo de trabalho) usando um ímã. O antígeno PSA foi então injetado nos canais microfluídicos do CASPE-MFD preparado e conjugado com o anticorpo anti-PSA que imobilizou no eletrodo de trabalho. Em seguida, o anticorpo anti-PSA modificado com HRP foi conjugado com o antígeno PSA. A cronoamperometria foi usada para detectar os sinais eletroquímicos produzidos pela hidroquinona e pelo peróxido de hidrogênio.

a Todo o dispositivo de detecção. A bomba de seringa foi usada para injetar solução no CASPE-MFD, e a estação de trabalho eletroquímica foi usada para detectar os sinais eletroquímicos. b O CASPE-MFD usado para detectar PSA. Anticorpo anti-PSA conjugado com grânulos imunomagnéticos foi injetado com soluções através da entrada, e um ímã foi usado para capturar os grânulos magnéticos. c Esquema do CASPE-MFD na detecção do antígeno PSA. O anticorpo anti-PSA conjugado com grânulos imunomagnéticos foi imobilizado no eletrodo de trabalho usando um ímã. O antígeno PSA foi injetado no CASPE-MFD e conjugado com o anticorpo anti-PSA. O anticorpo anti-PSA modificado com HRP foi então conjugado com o antígeno PSA. A cronoamperometria foi usada para detectar os sinais eletroquímicos que a hidroquinona e o peróxido de hidrogênio produziram.

A cronoamperometria dá uma melhor relação sinal-ruído em comparação com outras técnicas amperométricas [20,21,22,23,24], e o uso de uma placa fina de fluidos presa mecanicamente aos eletrodos é mais resistente à vibração do que a análise em um maior volume de solução. Para correntes limitadas por difusão faradaica, a resposta atual-tempo é descrita pela equação de Cottrell.
$$ i =\ frac {nFA {D} ^ {\ frac {1} {2}} C} {{\ left (\ pi t \ right)} ^ {\ frac {1} {2}}} $$
onde n é o número de elétrons, F é a constante de Faraday (96.485 C / mol), A é a área do eletrodo (cm ² ), D é o coeficiente de difusão (cm ² / s) e C é a concentração (mol / cm ³ )

O CASPE-MFD preparado foi usado para detectar PSA em uma série de soluções de analito, concentração de 0 a 10 ng mL ⁻¹ . As respostas cronoamperométricas da detecção de PSA em CASPE-MFDs foram mostradas na Fig. 5a. As correntes de pico aumentaram com o aumento da concentração de PSA em PBS de pH 7,4 contendo hidroquinona 4,5 mM e peróxido de hidrogênio 0,1 mM. Conforme mostrado na Fig. 5b (linha azul), as correntes de pico foram proporcionais ao valor logarítmico das concentrações de PSA na faixa de 0,001 a 10 ng / mL e a equação de regressão linear é I (μA) =14,87 + 3,927 × log C _PSA (ng / mL) ( R ² =0,9985, n =8). O baixo limite de detecção (0,84 pg / mL) e a boa relação linear sugeriram que o CASPE-MFD preparado poderia ser usado para detectar PSA em uso prático. Além disso, também detectamos diferentes concentrações de PSA em CASPE-MFDs usando voltametria de onda quadrada (SWV) na Fig. 5c. As respostas do SWV também foram consistentes com os resultados cronoamperométricos.

a Curvas cronoamperométricas para várias concentrações de antígeno PSA (ascendendo ao longo do y -axis):0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 e 10 ng / mL em tampão PBS de pH 7,4 contendo hidroquinona 4,5 mM e H 0,1 mM ₂ O ₂ solução em CASPE-MFD a - 2,0 mV vs eletrodo de pseudo-referência de prata. b A relação linear entre a corrente de pico e a concentração de antígeno PSA nos CASPE-MFDs em tampão PBS de pH 7,4 (linha azul) e em soro humano (linha vermelha). A equação de regressão linear da linha azul é Y =14,87 + 3,927 × X ( R ² =0,9985, n =8), e a equação de regressão linear da linha vermelha é Y =14,15 + 3,622 × X ( R ² =0,9986, n =8). c Voltamogramas de onda quadrada para várias concentrações de antígeno PSA em tampão PBS de pH 7,4 contendo hidroquinona 4,5 mM e H 0,1 mM ₂ O ₂ solução em CASPE-MFD (ascendente ao longo do y -eixo):0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 e 10 ng / mL, respectivamente. d A relação linear correspondente de diferentes concentrações de antígeno PSA. A equação de regressão linear é Y =34,53 + 9,246 × X ( R ² =0,9884, n =8)

Detecção seletiva de PSA com CASPE-MFDs

Para verificar a possível aplicação em nosso dispositivo para amostras reais, analisamos várias concentrações de PSA em amostras de soro humano usando cronoamperometria. Os resultados obtidos no arquivo adicional 1:Fig. S2 demonstraram que as correntes de pico do PSA também aumentaram com o aumento da concentração de PSA no soro humano contendo 4,5 mM de hidroquinona e 0,1 mM de peróxido de hidrogênio. Além disso, a curva de calibração correspondente foi mostrada na Fig. 5b (linha vermelha), e a equação de regressão linear é I (μA) =14,15 + 3,622 × log C _PSA (ng / mL) ( R ² =0,9986, n =8). É óbvio que quase não houve diferenças estatísticas entre os dois grupos, indicando que o CASPE-MFD preparado foi capaz de funcionar em amostras reais. Além disso, o CASPE-MFD demonstrou ter grande seletividade para direcionar o PSA e pode ser usado em aplicação clínica para o diagnóstico de carcinoma de próstata.

Conclusões

Nós desenvolvemos um sensoriamento eletroquímico baseado em eletrodo com impressão em tela comercial simples, de baixo custo e portátil. Além disso, demonstramos a aplicação de nossos CASPE-MFDs para a análise quantitativa de PSA em tampão PBS e em amostras de soro humano. A medição apresentou boa sensibilidade e reprodutibilidade devido ao dispositivo ser confeccionado diretamente nos eletrodos serigrafados comerciais. Os CASPE-MFDs têm cinco vantagens:(i) é leve, portátil, multiuso; (ii) é padronizado; (iii) possui excelente reprodutibilidade com alta sensibilidade e precisão; (iv) é fácil de usar e não requer pessoal médico profissional ou instrumentos complicados; e (v) permite a integração de sistemas de detecção de alta densidade em um pequeno dispositivo. Além disso, o uso de um potenciostato miniaturizado poderia tornar os CASPE-MFDs capazes de diagnóstico em campo ou em casa. Além disso, os eletrodos comerciais e de fácil fabricação puderam atingir a padronização e industrialização dos CASPE-MFDs. Portanto, acreditamos que esta plataforma seja amplamente utilizada para diagnóstico de ponto de atendimento, como pequenas moléculas (sódio, potássio, cloreto, glicose), marcadores de câncer (peptídeo natriurético tipo B ou BNP, troponina I), células (CD ₄ ) e ácidos nucleicos (DNA, RNA).

Abreviações

MFDs:: Dispositivos microfluídicos
CASPE-MFDs:: Dispositivos microfluídicos baseados em eletrodos impressos em tela
PDMS:: Polidimetilsiloxano
PSA:: Antígeno específico da próstata
CA:: Cronoamperometria
SWV:: Voltametria de onda quadrada
LOD:: Limite de detecção
HRP:: Peroxidase de rábano
TEOS:: Tetra etoxissilano
MTES:: Espectroscopia de emissão de transferência metaestável
BNP:: Peptídeo natriurético tipo B

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