Biossensor de Metamaterial Totalmente Metálico em Terahertz Alcança Ultra-Alta Sensibilidade para Detecção de Proteínas

Como o desempenho do sensor é afetado pelos parâmetros estruturais, é necessário otimizar os parâmetros estruturais durante o procedimento de design. A Figura 3 mostra o efeito das mudanças de tamanho estrutural nos espectros de transmissão. Como mostrado na Fig. 3a, quando o comprimento do haltere oco aumentou de 290 para 298 μm, a frequência de pico dos espectros de transmissão deslocou para o vermelho (red-shift) a partir de 0,48 THz. Como mostrado na Fig. 3b, quando o vão do haltere oco aumentou de 56 para 64 μm, a frequência de pico dos espectros de transmissão deslocou para o azul (blue-shift) a partir de 0,48 THz. Conforme L e H aumentaram, o pico de ressonância começou a mover-se em direção à baixa frequência e alta frequência, respectivamente. Quando o raio do círculo variou de 56 a 64 μm e a espessura da chapa de aço inoxidável variou de 40 a 60 μm, a posição do pico de ressonância mudou ligeiramente. Portanto, é mais fácil ajustar a frequência de ressonância do biossensor de metamaterial ajustando o comprimento do haltere oco L e o vão do haltere oco H.

Também é muito importante estudar a influência do ângulo de incidência e do ângulo de polarização nos espectros de transmissão. A onda eletromagnética incidiu verticalmente, e então os ângulos de incidência e polarização foram alterados. A definição desses ângulos é mostrada na Fig. 4a. O ângulo de incidência significa θ_i no plano y-z, e a polarização é θ_p no plano x-y. Como mostrado na Fig. 4b, quando o ângulo de incidência mudou de 0° a 15°, a diferença da frequência do pico de ressonância foi apenas 9 GHz. Como mostrado na Fig. 4c, quando o ângulo de polarização aumentou de 0° a 15°, a diferença na frequência do pico de ressonância foi quase 0 GHz, mas a amplitude do pico de ressonância diminuiu cerca de 0,1. Isso mostrou que o biossensor era quase insensível a mudanças nos ângulos de incidência e polarização, o que é benéfico para aplicações práticas de biossensores.

Para explorar o desempenho de sensoriamento do biossensor, uma camada fina de analito de 120 μm foi adicionada a este biossensor de metamaterial como mostrado na Fig. 5a, então diferentes espectros de transmissão deste biossensor de metamaterial foram simulados quando o índice de refração do analito mudou como mostrado na Fig. 5b. A sensibilidade RI S foi definida como a razão das variações na posição do pico de transmissão para a unidade de RI (S = Δf/Δn). Conforme o RI do analito aumentou, a frequência do pico de ressonância deslocou para o vermelho. Então, o deslocamento de frequência do pico de ressonância correspondente a cada RI foi coletado. Boa linearidade foi observada. O resultado de ajuste na Fig. 5c mostra que a sensibilidade ao RI foi 294,95 GHz/RIU.

O desempenho de sensoriamento também foi quantificado usando a figura de mérito (FOM), que foi definida como:

$${\text{FOM}} = \frac{S}{{{\text{FWHM}}}}$$ (1)

onde S é a sensibilidade e FHWM é a largura total a meia altura do pico de ressonância. O FOM deste biossensor foi 4,03.

Para a maioria das estruturas de metamaterial, elas geralmente usam materiais dielétricos como substratos. No entanto, este biossensor de metamaterial proposto neste artigo era baseado em um metamaterial totalmente metálico com design totalmente em aço inoxidável e o ar era usado como substrato. Comparado com materiais dielétricos tradicionais, como tereftalato de polietileno (PET), quartzo e silício, o ar tem o menor RI. Para avaliar o papel do substrato, esses biossensores de metamaterial foram simulados novamente usando diferentes substratos, e as sensibilidades de índice de refração e valores FOM foram calculados subsequentemente. Como mostrado na Fig. 6, à medida que o RI do substrato aumentava, a sensibilidade RI do sensor e o FOM começavam a diminuir. Este resultado indicou que o biossensor com menor RI de substrato tinha melhor desempenho de sensoriamento.

Para investigar ainda mais o princípio de sensoriamento do biossensor, diagramas de distribuição de campo elétrico foram simulados, como mostrado na Fig. 7. As vistas superior e lateral da distribuição simulada de campo elétrico demonstraram que a energia do campo elétrico estava principalmente concentrada em parte dos orifícios do aço inoxidável. Portanto, é crucial garantir que o analito fosse adicionado nos orifícios.

A Tabela 1 resumiu a sensibilidade RI e FOM do sensor proposto, e os comparou com outros estudos relatados [35,36,37]. Os outros sensores THz são todos baseados em processos tradicionais de fotolitografia. Pode-se ver que o biossensor de metamaterial de aço inoxidável que projetamos tinha excelente desempenho de sensoriamento usando tecnologia de perfuração a laser barata.

Experimento

Materiais e preparação de amostras

Então, para demonstrar a capacidade de biossensoriamento do sensor de metamaterial THz proposto, a detecção de proteínas foi realizada no experimento. BSA e tampão PBS foram ambos comprados da Sigma-Aldrich. A solução de BSA foi formulada em tampão PBS (pH = 7,4).

Uma imagem de microscópio do biossensor de metamaterial fabricado é mostrada na Fig. 8. O tamanho total do biossensor de metamaterial era 12 mm × 12 mm.

As concentrações da solução de BSA formulada eram 0,2 mg/mL, 0,5 mg/mL, 2,0 mg/mL e 4,0 mg/mL. O analito foi adicionado à superfície do biossensor pelo método de deposição líquida. Cada vez, 150 μL de solução de BSA foram transferidos para a superfície do biossensor com uma pipeta, e o biossensor foi seco em uma mesa de aquecimento a 40 °C. Quando o biossensor era aquecido a 40 °C, o filme de proteína formava-se mais rápido e uniformemente. Cada vez antes de mudar diferentes concentrações de solução de BSA, a chapa de aço inoxidável era colocada em água deionizada e vibrada em um vibrador ultrassônico para garantir que o filme de proteína do processo anterior fosse limpo e a superfície deste biossensor de metamaterial estivesse limpa. A Figura 9 mostrou as imagens e as imagens de microscopia do processo de adição e secagem da proteína. Como mostrado na Fig. 9a, a chapa de aço inoxidável estava limpa, e então como mostrado na Fig. 9b, a solução de BSA de uma concentração foi adicionada à superfície da chapa de aço inoxidável, e a solução ficou na superfície deste biossensor e não passou pelos orifícios devido ao efeito de tensão superficial da água. Após aquecimento e secagem, uma camada fina de filme de BSA foi formada como mostrado na Fig. 9c.

Para observar a situação dentro dos orifícios do aço inoxidável, um lado do aço inoxidável foi cortado, de modo que um lado dos orifícios foi revelado e observado com microscópio. Como mostrado na Fig. 9d-g, quando a solução de BSA foi gotejada e seca, uma camada fina de BSA foi adicionada nos orifícios do aço inoxidável, o que é principalmente porque o diâmetro dos orifícios é muito maior que o tamanho das proteínas BSA. Isso prova que o analito a ser detectado pode entrar na região sensível de detecção do nosso biossensor, o que pode aumentar muito a sensibilidade deste biossensor de metamaterial.

Medições espectrais

Todas as medições espectrais foram conduzidas usando um sistema de espectroscopia THz de onda contínua (TeraScan 1550, Toptica Photonics AG). O sistema consistia em eletrônicos inteligentes de controle de laser duplo (DLC), dois lasers de realimentação distribuída (DFB), dois fotomisturadores InGaAs acoplados a fibra e quatro espelhos parabólicos fora do eixo de 90° como mostrado na Fig. 10. Ondas THz foram colimadas e focalizadas na amostra através dos espelhos parabólicos fora do eixo de 90°. Todos os espectros de transmissão foram obtidos varrendo entre 50 e 1220 GHz em tamanhos de passo de 40 MHz com tempo de integração de 10 ms operando no modo de varredura rápida para reduzir o tempo de varredura. A polarização da onda terahertz estava ao longo da direção de abertura do anel do haltere.

Resultados e Discussão do Experimento

Os experimentos de detecção de proteínas do biossensor de metamaterial foram realizados com quatro concentrações de soluções de BSA. Ao longo dos experimentos, cada grupo de soluções de BSA foi adicionado em ordem da menor para a maior concentração. Todas as medições foram repetidas três vezes.

Como mostrado na Fig. 11a, à medida que a concentração das soluções de BSA aumentava, a frequência do pico de ressonância deslocava para o vermelho. Esta tendência é consistente com os resultados de simulação. A diminuição na intensidade da ressonância foi devida à absorção da onda terahertz pela proteína BSA.

A relação entre o deslocamento de frequência e a concentração das soluções de BSA não é linear, o que é comum em experimentos biológicos [38, 39]. O modelo de Hill pode caracterizar a capacidade de ligação entre nosso biossensor de metamaterial e biomoléculas. Portanto, o modelo de Hill [40] foi usado para ajustar os dados experimentais, como mostrado na Fig. 11b. A equação de Hill é descrita como segue:

$$\Delta f = \Delta f_{\max} \cdot \frac{{[\text{BSA}]^{n}}}{{\left\{ K_{\text{D}} + [\text{BSA}]^{n} \right\}}}$$ (2)

onde o deslocamento máximo de frequência de pico Δf_max é o valor de saturação, [BSA] é a concentração da solução de BSA, n é o coeficiente de Hill, e K_D é a constante de dissociação.

Usando a curva de ajuste como mostrado na Fig. 11b, o coeficiente de Hill n foi calculado como 0,83, e a constante de dissociação K_D foi calculada como 2,87 mg/mL. Além disso, Δf_max foi aproximadamente 166 GHz, o que indicou o deslocamento máximo de frequência de pico na concentração de saturação. Os resultados de ajuste de Hill do pico de frequência de ressonância confirmaram a confiabilidade e precisão do experimento.

A sensibilidade S do biossensor foi deduzida como segue [41]:

$$S = \frac{{\Delta f_{\max}}}{{\delta_{\max}}}$$ (3)

onde Δf_max é 166 GHz e δ_max é a densidade superficial de BSA. δ_max foi determinado por [41]:

$$\delta_{\max} = \frac{{M_{\text{BSA}}}}{{N_{\text{A}} \times P_{\text{BSA}}^{2}}}$$ (4)

onde M_BSA = 66.430 g/mol é a massa molecular estimada de BSA [42], N_A = 6,02 × 10²³ mol⁻¹ é o número de Avogadro, e P_BSA = 6,96 nm [43] é o comprimento médio de uma molécula de BSA. δ_max foi 2,28 ng/mm² e a sensibilidade de detecção de BSA do biossensor foi 72,81 GHz/(ng/mm²).

K_D obtido usando o modelo de Hill mostrou que a constante de dissociação estava fortemente relacionada à BSA, e o limite de detecção (LOD) C_lim da BSA foi calculado usando a seguinte equação [44]:

$$C_{\lim} = K_{\text{D}} \times \frac{{S_{\text{f}}}}{{\Delta f_{\max} - S_{\text{f}}}}$$ (5)

onde S_f é a resolução espectral de 2 GHz. A equação (5) mostra que menor constante de dissociação resultou em menor limite de detecção. Assim, C_lim foi calculado como 0,035 mg/mL.

A Tabela 2 mostra o desempenho de sensoriamento de BSA do nosso biossensor comparado com aqueles estudos relatados. No experimento, a menor concentração da solução de BSA foi 0,2 mg/mL e uma mudança de frequência de 10,8 GHz foi obtida. Comparado com Refs. [45,46,47], uma mudança de frequência relativamente maior foi alcançada na mesma concentração de BSA. A fórmula de Hill foi aplicada para analisar os dados do biossensor de metamaterial. O LOD calculado de 0,035 mg/ml foi significativamente melhor que aquele na Ref. [45]. Tudo isso prevê que nosso biossensor de metamaterial THz totalmente metálico proposto terá excelente desempenho em muitas aplicações biológicas e químicas.

Baseado no excelente desempenho de sensoriamento do biossensor de aço inoxidável, o biossensor de aço inoxidável pode ser modificado com anticorpo específico para alcançar detecção específica de antígeno no futuro. E a espessura do biossensor de aço inoxidável é apenas 50 μm. Com o desenvolvimento da tecnologia de microfluídica e espectroscopia terahertz, é esperançoso aplicar medição em tempo real in vivo no futuro.

Conclusão

Em conclusão, um biossensor de terahertz baseado em metamaterial totalmente metálico foi usado para medir concentrações de proteínas. O biossensor foi feito de aço inoxidável e preparado via tecnologia de perfuração a laser. A sensibilidade RI máxima e FOM calculados usando software de simulação eletromagnética CST são 294,95 GHz/RIU e 4,03, respectivamente. A amostra foi caracterizada usando um espectrômetro THz de onda contínua. Os resultados experimentais mostraram que, para a solução de analito BSA, a sensibilidade de detecção e limite de detecção são 72,81 GHz/(ng/mm²) e 0,035 mg/mL, respectivamente. Este biossensor tem vantagens de formato pequeno, alta sensibilidade de detecção, baixos limites de detecção, reutilizabilidade, fácil fabricação e custo-efetivo. Estes resultados de pesquisa são de considerável significado para futuras aplicações em detecção de biomoléculas e diagnóstico de doenças.