Um novo nanobiossensor magnetoelástico para detecção altamente sensível de atrazina

Resumo

Aqui, primeiro relatamos um nanobiossensor magnetoelástico sem fio (ME), baseado em materiais ME e nanopartículas de ouro (AuNPs), para detecção altamente sensível de atrazina empregando o imunoensaio competitivo. Em resposta a um campo magnético variável no tempo, o material ME vibra longitudinalmente em sua frequência de ressonância, que pode ser afetada por seu carregamento de massa. A camada de revestimento AuNPs no material ME contribui para sua biocompatibilidade, estabilidade e sensibilidade. O anticorpo de atrazina foi orientado imobilizado na superfície do material ME revestido com AuNPs através da proteína A, melhorando o desempenho do nanobiossensor. A análise do microscópio de força atômica (AFM) provou que a imobilização do anticorpo atrazina foi bem-sucedida. Além disso, para aumentar a sensibilidade, o conjugado atrazina-albumina (Atr-BSA) foi induzido a competir com a atrazina pela ligação com o anticorpo atrazina, amplificando a resposta do sinal. A mudança de frequência de ressonância é inversa e linearmente proporcional ao logaritmo das concentrações de atrazina variando de 1 ng / mL a 100 μg / mL, com a sensibilidade de 3,43 Hz / μg mL ⁻¹ e o limite de detecção de 1 ng / mL, que é significativamente inferior ao padrão estabelecido pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA). Os resultados experimentais indicaram que o nanobiossensor ME exibiu forte especificidade e estabilidade em relação à atrazina. Este estudo fornece um novo método conveniente para a detecção rápida, seletiva e altamente sensível da atrazina, que tem implicações em suas aplicações no monitoramento da qualidade da água e em outros campos de detecção ambiental.

Introdução

Com o rápido desenvolvimento da indústria e da agricultura, mais e mais contaminantes ambientais foram lançados no ambiente ecológico [1], o que causou grande preocupação sobre as pesquisas relevantes [2, 3]. Nos últimos anos, os herbicidas têm sido usados ​​em quantidades crescentes para melhorar a qualidade e o rendimento nos campos agrícolas, mas muitos herbicidas podem permanecer ativos na água e no solo por anos, causando séria poluição ambiental [4]. A poluição por herbicidas tem atraído considerável atenção devido à sua contaminação ecológica na água ou em produtos agrícolas [5]. Entre os herbicidas, a atrazina (2-cloro-4-etilamino-6-isopropilamino-1, 3, 5-triazina) é o mais amplamente usado para plantas de folha larga e controle de ervas daninhas em todo o mundo [6].

Embora a atrazina tenha certo efeito inibitório em algumas ervas daninhas perenes, como contaminante ambiental, é altamente tóxica [7] e pode causar riscos à saúde de humanos e outras espécies animais [8]. A ingestão de altas concentrações de atrazina a longo prazo pode prejudicar a saúde humana ou animal, como câncer, defeitos congênitos e danos ao coração e ao fígado [9, 10]. Os EUA, a União Europeia e o Japão incluíram a atrazina na lista de desreguladores endócrinos [11]. Nos EUA, a Agência de Proteção Ambiental (EPA) permite o limite permissível de 3 μg / L (Lifetime Health Advisory Level) de atrazina na água potável [12]. Assim, é necessário quantificar com precisão a atrazina em baixas concentrações.

Muitas técnicas analíticas convencionais foram desenvolvidas para a detecção de atrazina, incluindo LC acoplado a espectrometria de massa (LC-MS) [13], cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) [14] e cromatografia gasosa acoplada também a espectrometria de massa (GC-MS ) [15], mas esses métodos também têm algumas limitações, como alto custo, necessidade de grandes instrumentos, baixa seletividade e demorado [16].

Como uma plataforma sem fio sensível à massa, o sensor magnetoelástico (ME) feito de material ME tem sido amplamente desenvolvido para várias aplicações devido às suas vantagens críticas de baixo custo, alta sensibilidade, tamanho menor e facilidade de uso [17, 18]. Atualmente, os sensores ME são geralmente feitos de materiais de ligas ferromagnéticas amorfas, como Metglas 2826 MB (Fe ₄₀ Ni ₃₈ Mo ₄ B ₁₈ ) [19]. Sob os campos magnéticos alternados e estáticos aplicados externamente, o material ME vibra longitudinalmente em sua frequência de ressonância [20], gerando uma densidade de fluxo magnético que pode ser detectada sem fio por uma bobina de captação sem quaisquer conexões físicas diretas [21]. De acordo com a Eq. (1) [22], a frequência de ressonância fundamental f ₀ depende do comprimento do material L , densidade ρ , módulo de elasticidade E e coeficiente de Poisson v .
$$ {f} _0 =\ frac {1} {2L} \ sqrt {\ frac {E} {\ rho \ left (1- {v} ^ 2 \ right)}} $$ (1)
Uma pequena carga de massa adicional ∆m depositado na superfície do material ME de massa M ( ∆m ≪ M ) causa uma mudança na frequência de ressonância ( ∆f ), que é dado pela Eq. (2) [23].
$$ \ frac {\ Delta f} {\ Delta m} =- \ frac {f_0} {2M} $$ (2)
Com base nas propriedades exclusivas acima do material ME, a frequência de ressonância do material ME diminui com um aumento da carga de massa extra. Assim, por meio de sua funcionalização com filme sensor, os materiais ME foram desenvolvidos para análises físicas, químicas e biológicas, como detecção de estresse / pressão [24], temperatura / umidade [25], dióxido de carbono [26], endotoxina [27], Salmonella typhimurium / Bacillus anthracis esporos [28] e Escherichia coli O157:H7 [29]. Até onde sabemos, no entanto, nenhuma aplicação do material ME foi aplicada na detecção de atrazina.

Nesta pesquisa, utilizando suas excelentes propriedades e vantagens, propusemos inicialmente um nanobiossensor ME sem fio empregando o material ME como substrato e nanopartículas de ouro (AuNPs) como camada de revestimento, para detecção de atrazina em nível de ppb com base no imunoensaio competitivo direto procedimentos. Em comparação com a imobilização covalente-aleatória do anticorpo, a estratégia covalente orientada é mais benéfica para melhorar a sensibilidade do nanobiossensor. Como a proteína A é uma alternativa interessante para se ligar especificamente à região de imunoglobulina Fc do anticorpo, ela foi empregada para imobilização orientada do anticorpo atrazina [30], dando a maior densidade de imobilização, para exibir melhor eficiência de ligação ao antígeno e melhorar o desempenho do nanobiossensor [31]. O imunoensaio competitivo direto para atrazina foi construído por imobilização orientada de anticorpo de atrazina para proteína A covalentemente modificada na superfície do material ME revestido com AuNPs, seguido pela reação competitiva de conjugado de atrazina-albumina (Atr-BSA) e atrazina com o anticorpo de atrazina. Atr-BSA foi induzido para amplificar as respostas do sinal, por sua vez aumentando significativamente a sensibilidade do nanobiossensor. A eficiência do nanobiossensor ME foi avaliada, demonstrando que um novo nanobiossensor ME para a detecção de concentrações de traços de atrazina foi desenvolvido com sucesso.

Materiais e métodos

Materiais

Anticorpo de atrazina, antígeno conjugado de atrazina-albumina (Atr-BSA), atrazina e proteína A foram adquiridos na EastCoast Bio (Maine, EUA). Simazina, prometrina e diclorodifeniltricloroetano (DDT) foram obtidos de Chengdu Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd. Cisteamina, cloridrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N -hidroxissulfosuccinimida (NHS), albumina de soro bovino (BSA, 99%) e solução salina tamponada com fosfato (tampão PBS, pH =7,4) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, EUA).

Fabricação de nanobiossensor ME

Preparação da plataforma do nanossensor ME

Fitas de material ME compostas de liga de metglas 2826 (Fe ₄₀ Ni ₃₈ Mo ₄ B ₁₈ ) foram adquiridos da Honeywell Corporation (Morristown, NJ, EUA) e cortados em 5 mm x 1 mm x 0,028 mm usando uma máquina de corte a laser controlada por computador. Para remover o filme orgânico e detritos, as fitas ME foram ultrassonicamente limpas em acetona e etanol cada por 10 min e enxaguadas em água desionizada, então secas em uma corrente de nitrogênio (Fig. 1a). Uma camada de ~ 100 nm de espessura de nanopartículas de cromo foi espalhada em ambos os lados da superfície da fita ME para aumentar a adesão entre os AuNPs e a superfície da fita. Posteriormente, ambos os lados da superfície da fita ME revestida com cromo foram pulverizados com AuNPs para melhorar a biocompatibilidade e proteger a fita da oxidação e corrosão. A imagem do microscópio eletrônico de varredura (SEM) na Fig. 1 mostrou que os AuNPs revestidos na fita ME eram em tamanho esférico. AuNPs e -SH podem facilmente formar a ligação Au-S. Além disso, devido às suas vantagens atrativas de baixo preço, não corrosão, biocompatibilidade e não toxicidade [32], AuNPs podem fornecer uma excelente interface para a modificação de elementos químicos ou de bio-reconhecimento [33, 34]. Posteriormente, as fitas ME foram recozidas em um forno a vácuo a 200 ° C por 2 h para aliviar a tensão interna residual e promover a adesão da camada AuNPs às fitas ME. Em seguida, as plataformas de nanosensores ME foram concluídas e prontas para a imobilização do anticorpo atrazina (Fig. 1b).

A representação esquemática dos procedimentos de funcionalização dos nanobiossensores ME:( a ) a fita ME nua; ( b ) o revestimento AuNPs; ( c ) a camada SAM; ( d ) a imobilização da proteína A; ( e ) a modificação do anticorpo; ( f ) Bloqueio de BSA; ( g ) atrazina e Atr-BSA combinados competitivamente com o anticorpo; Imagem SEM da superfície do nanossensor revestido com AuNPs

Imobilização de anticorpo de atrazina

As plataformas de nanosensores revestidas com AuNPs foram limpas por ultrassom com acetona, isopropanol, água deionizada e etanol, cada por 5 min, e secas sob uma corrente de nitrogênio. Em seguida, as plataformas de nanosensores foram imersas em solução de cisteamina (10 mM) por 12 h em temperatura ambiente para a obtenção de uma monocamada automontada (SAM) (Fig. 1c). A proteína A (1 mg / mL) foi ativada com 4 mg / mL EDC-4 mg / mL NHS por 30 min em temperatura ambiente. Depois disso, a proteína A ativada foi incubada nos nanosensores modificados por SAM por 30 min a 37 ° C e lavada com tampão PBS (Fig. 1d). As plataformas de nanosensores foram então incubadas com anticorpo de atrazina por 50 min e lavadas com tampão PBS (Fig. 1e). Para evitar a adsorção não específica, os nanossensores revestidos com anticorpo de atrazina foram posteriormente tratados com BSA a 0,5% por 30 min e, em seguida, enxaguados com tampão PBS para remover qualquer BSA não ligado e secos sob uma corrente de nitrogênio. Finalmente, os nanobiossensores ME foram fabricados para detecção de atrazina (Fig. 1f).

Medição de sinal

A frequência de ressonância do nanobiossensor ME foi medida usando uma bobina de captação enrolada em torno de um frasco, juntamente com um analisador de rede vetorial (AV3620A, 41st Institute of CETC, Qingdao, China), conforme esquematicamente representado na Fig. 2. Para gerar um campo magnético, o analisador de rede conectado com a bobina de captação foi operado no S ₁₁ modo para fornecer um sinal de frequência varrido para a bobina e pode monitorar o sinal refletido da bobina. Além disso, um campo magnético estático gerado por uma barra magnética foi aplicado para melhorar o comportamento de ressonância. Os nanobiossensores foram verticalmente e sem fio (sem qualquer conexão de fio com o sistema de medição) inseridos no frasco contendo soluções de amostra de 30 μL a serem testadas. Todos os experimentos foram conduzidos à temperatura ambiente (25 ± 2 ° C) em sistema de solvente PBS (0,1 M, pH 7,4). A frequência de ressonância do nanobiossensor pode ser determinada através da medição do S ₁₁ parâmetro, que foi monitorado e registrado a cada 5 min.

A representação esquemática do sistema de medição de nanobiosensor ME sem fio

Resultados e discussão

Caracterização da morfologia da superfície do nanobiossensor

A observação do microscópio de força atômica (AFM, ND-100, Park System, Coreia) da superfície do nanobiossensor foi realizada para examinar o efeito de imobilização do anticorpo atrazina. As imagens AFM do nanobiossensor revestido com AuNPs e da superfície do nanobiossensor modificado com anticorpo são apresentadas na Fig. 3a, b, respectivamente. É claro que o aumento da rugosidade da superfície resulta do anticorpo atrazina imobilizado covalentemente. A análise abrangente da topografia das seções transversais AFM mostra que o nanobiossensor revestido com AuNPs tem a variação de altura de 13,421 nm; no entanto, o valor aumentou para 28,425 nm após a modificação do anticorpo. Como é bem sabido que o diâmetro do anticorpo molecular é de cerca de 15 nm, conclui-se obviamente que a imobilização do anticorpo de atrazina é bem sucedida.

Imagens AFM de ( a ) o AuNPs revestido e ( b ) superfície de nanobiossensor modificada com anticorpo

Otimização para concentração de anticorpo de atrazina

A concentração de imobilização do anticorpo tem uma influência importante na sensibilidade do nanobiossensor. Portanto, foi necessário avaliar a resposta da frequência de ressonância do nanobiossensor com diferentes concentrações de imobilização do anticorpo atrazina (25 μg / mL, 50 μg / mL, 75 μg / mL, 100 μg / mL). Na Fig. 4, podemos ver que o deslocamento da frequência de ressonância atingiu o máximo em 50 μg / mL. Quando a concentração do anticorpo atrazina subiu para 75 μg / mL, a resposta começou a declinar devido ao impedimento estérico e à repulsão eletrostática [35]. Ou seja, o anticorpo de atrazina 50 μg / mL pode atingir uma imobilização relativamente saturada. Assim, 50 μg / mL foi a concentração ótima de anticorpo atrazina para imobilização.

A resposta de frequência do nanobiossensor ME com diferentes concentrações de imobilização de anticorpo de atrazina (0 μg / mL, 25 μg / mL, 50 μg / mL, 75 μg / mL, 100 μg / mL)

Otimização para concentração de Atr – BSA

Na imunorreação, a atrazina e o Atr-BSA competiram pelo número limitado de locais de anticorpos atrazina na superfície do nanobiossensor. Portanto, com a concentração ideal de anticorpo de atrazina para imobilização, a concentração de trabalho de Atr-BSA, como um fator importante, afeta a sensibilidade do nanobiossensor. O processo de otimização foi investigado pela determinação da resposta de frequência de ressonância do nanobiossensor ME a Atr-BSA de diferentes concentrações (20 μg / mL, 40 μg / mL, 60 μg / mL, 80 μg / mL). Conforme indicado na Fig. 5, a resposta máxima foi observada em 40 μg / mL. Portanto, 40 μg / mL Atr – BSA foi usado na seguinte determinação.

A resposta de frequência do nanobiossensor ME para Atr-BSA de diferentes concentrações (20 μg / mL, 40 μg / mL, 60 μg / mL, 80 μg / mL)

Detecção de atrazina

A Figura 6 representa a resposta de frequência em tempo real do nanobiossensor ME medido na mistura de amostra de 15 μL Atr-BSA (40 μg / mL) e 15 μL de atrazina com diferentes concentrações (0 ng / mL, 1 ng / mL, 10 ng / mL, 100 ng / mL, 1000 ng / mL, 10 μg / mL, 50 μg / mL, 100 μg / mL). Conforme mostrado na Fig. 1g, atrazina e Atr-BSA combinaram competitivamente com o anticorpo imobilizado na superfície do nanobiossensor, o que por sua vez leva a um aumento da carga de massa na superfície do nanobiossensor, conseqüentemente causando uma diminuição da frequência de ressonância com a incubação Tempo. É claro a partir da Fig. 6 que a resposta de estado estacionário é geralmente alcançada em cerca de 50 min. A concentração de Atr-BSA e o número de locais de anticorpos de atrazina foram fixados, de modo que a quantidade de Atr-BSA ligada no nanobiossensor foi inversamente proporcional à concentração de atrazina na solução. O peso molecular do Atr – BSA é maior do que o da atrazina. Portanto, a frequência de ressonância do nanobiossensor muda inversamente com a concentração de atrazina em solução. Conforme mostrado na Fig. 6, a taxa e magnitude da mudança de frequência de ressonância diminuíram com o aumento das concentrações de atrazina, e uma concentração mais alta de atrazina pode induzir uma mudança de frequência de ressonância menor. A curva da Figura 6 * representa uma resposta de fundo do sensor de controle em branco (sem imobilização de anticorpo atrazina) para Atr-BSA, que é aproximadamente 48 Hz, muito menos do que o sinal de detecção, indicando que a adsorção não específica pode ser ignorada. Assim, a concentração de atrazina pode ser detectada através do deslocamento da frequência de ressonância do nanobiossensor ME sem fio, com uma relação inversamente proporcional.

Respostas de frequência em tempo real em diferentes concentrações de atrazina variando de 0 a 100 μg / mL. * A resposta de controle em branco (sem imobilização de anticorpo de atrazina) para Atr-BSA

A curva de calibração padrão para a detecção de atrazina no nanobiossensor ME durante os primeiros 50 min são mostrados na Fig. 7. Para cada concentração, os experimentos de calibração do nanobiossensor foram realizados cinco vezes em condições idênticas. Verificou-se que o deslocamento da frequência de ressonância é linear com o valor do logaritmo das concentrações de atrazina variando de 1 ng / mL a 100 μg / mL, que pode ser representado por ∆f =54,717 log C _Atrazina - 442,45 ( R ² =0,971). A sensibilidade é calculada em 3,43 Hz / μg mL ⁻¹ . É evidente a partir da Fig. 7 que o limite de detecção (LOD) é 1 ng / mL, que é significativamente menor do que o limite superior permissível para atrazina de 3 μg / L dado na US EPA, satisfazendo o padrão atualmente disponível. Além disso, o limite de detecção é evidentemente inferior ao dos métodos relatados anteriormente [36, 37]. Foi demonstrado que um nanobiossensor de baixo custo, sem fio e altamente sensível foi estabelecido com sucesso para a detecção em tempo real da atrazina.

Curva de calibração:a mudança de 50 min na frequência de ressonância em função de diferentes concentrações de atrazina

Uma vez que a atrazina é a molécula pequena, a abordagem de imunoensaio competitivo direto foi empregada para melhorar a sensibilidade do nanobiossensor ME. No imunoensaio competitivo direto, o anticorpo é modificado na superfície do sensor e a resposta do sinal resulta da ligação da molécula Atr-BSA. Por outro lado, no imunoensaio competitivo indireto, Atr-BSA é imobilizado na superfície do sensor e a resposta resulta da ligação da molécula de anticorpo. De acordo com pesquisas da literatura [38] e nossos resultados, o imunoensaio competitivo direto é viável para o monitoramento de pequenas moléculas. O imunoensaio competitivo indireto é altamente sensível à amostra de analito com concentração de traços [39]. Embora o imunoensaio competitivo indireto tenha uma sensibilidade mais alta [40, 41], pode ser complicado de operar e difícil de implementar para uso confiável repetido [36]. No entanto, o imunoensaio competitivo direto é muito rápido, simples de usar e independente - não são necessários reagentes adicionais [36]. Assim, para o desenvolvimento futuro, o imunoensaio competitivo direto pode ser o método mais promissor.

Especificidade do nanobiossensor ME

A especificidade do nanobiossensor ME para atrazina foi investigada pela determinação das respostas do nanobiossensor a alguns outros pesticidas, como prometrina, simazina e DDT, como mostrado na Fig. 8. Ficou evidente na Fig. 8 que o nanobiossensor ME mostrou poucas respostas a estes interferências devido à absorção não específica, e as respostas ao prometryn e simazine foram ligeiramente maiores do que DDT, que teve um nível de resposta semelhante à solução em branco. Pode ser devido ao fato de que tanto a prometrina quanto a simazina têm estruturas semelhantes à atrazina, pertencente aos pesticidas triazínicos; no entanto, o DDT é um tipo de inseticida organoclorado. Os resultados indicaram que a atrazina foi efetivamente reconhecida e especificamente combinada com o anticorpo imobilizado na superfície do nanobiossensor. Assim, o nanobiossensor ME mostrou forte especificidade para detecção de atrazina.

Resposta de frequência de ressonância do nanobiossensor ME a outros interferentes com a concentração de 100 μg / mL

Estabilidade do nanobiossensor ME

A Figura 9 mostra a estabilidade do nanobiossensor ME em relação à detecção de atrazina. Seis dos mesmos nanobiossensores de ME foram preparados e armazenados a 4 ° C, cada um dos quais testado para 10 ng / mL de atrazina em dias alternados até 6 dias. Cada ciclo de detecção testou apenas um nanobiossensor por 50 min. É claro que as respostas de frequência de ressonância dos nanobiossensores permanecem quase constantes e o desvio padrão relativo (RSD) é calculado em 1,8%. O resultado demonstra que o nanobiossensor ME exibe excelente estabilidade para detecção de atrazina.

Medições de estabilidade de atrazina 10 ng / mL no nanobiossensor ME

Conclusões

Um nanobiossensor ME sem fio baseado em materiais ME e AuNPs foi desenvolvido com sucesso para detecção em tempo real e altamente sensível de atrazina empregando o imunoensaio competitivo. A imobilização orientada do anticorpo atrazina através da proteína A melhorou o desempenho do nanobiossensor. Atr-BSA com massa de molécula pesada e atrazina combinados competitivamente com anticorpo de atrazina na superfície do nanobiossensor, amplificando as respostas do sinal, o que por sua vez melhorou a sensibilidade. A mudança de frequência de ressonância induzida principalmente pelo Atr-BSA ligado é inversamente proporcional à concentração de atrazina alvo. Além disso, as concentrações de trabalho do anticorpo atrazina e Atr-BSA foram otimizadas para 50 μg / mL e 40 μg / mL, respectivamente. Sob as condições ideais, o nanobiossensor de ME exibe intervalos de determinação amplamente linear para atrazina de 1 ng / mL a 100 μg / mL, com a sensibilidade satisfatória de 3,43 Hz / μg mL ⁻¹ e o limite de detecção de 1 ng / mL, que é suficiente para os requisitos legislativos e é inferior ao de outros métodos relatados. Imagens de AFM verificaram que o anticorpo atrazina foi imobilizado com sucesso na superfície do nanobiossensor de forma orientada. Os resultados experimentais demonstram que o nanobiossensor ME possui alta especificidade e estabilidade em relação à atrazina. Beneficiando-se de seus efeitos sobre os limites de detecção, simplicidade, propriedade descartável e natureza sem fio, o estudo não apenas propôs um novo método para detecção altamente sensível de atrazina, mas também indicou sua praticidade potencial para detecção de outros contaminantes ambientais e monitoramento da qualidade da água.

Abreviações

AFM:

Microscópio de força atômica

Atr – BSA:

Antígeno conjugado atrazina-albumina

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

BSA:

Albumina sérica bovina

DDT:

Diclorodifeniltricloroetano

EDC:

Cloridrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida

ME:

Magnetoelástico

NHS:

N -Hidroxissulfosuccinimida

PBS:

Salina tamponada com fosfato

SAM:

Monocamada auto-montada

SEM:

Microscópio eletrônico de varredura

US EPA:

Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos

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