Complexação com C60 Fulereno aumenta a eficiência da doxorrubicina contra células leucêmicas in vitro

Resumo

A quimioterapia anticâncer convencional é limitada por causa dos efeitos colaterais graves, bem como uma resistência a múltiplas drogas de evolução rápida das células tumorais. Para resolver este problema, exploramos um C ₆₀ sistema nanométrico baseado em fulereno como um transportador de drogas anticâncer para uma entrega otimizada de drogas às células leucêmicas.

Aqui, estudamos as propriedades físico-químicas e a atividade anticâncer de C ₆₀ complexos não covalentes de fulereno com o medicamento anticâncer comumente usado doxorrubicina. C ₆₀ -Complexos de doxorrubicina em uma proporção de 1:1 e 2:1 foram caracterizados com espectrometria UV / Vis, espalhamento de luz dinâmico e cromatografia líquida de alta performance-espectrometria de massa em tandem (HPLC-MS / MS). Os dados analíticos obtidos indicaram que os complexos de 140 nm eram estáveis ​​e poderiam ser usados ​​para aplicações biológicas. Em linhagens celulares leucêmicas (CCRF-CEM, Jurkat, THP1 e Molt-16), os nanocomplexos revelaram potencial citotóxico ≤ 3,5 maior em comparação com o fármaco livre em uma faixa de concentrações nanomolares. Além disso, o nível da droga intracelular evidenciou C ₆₀ fulereno função nanocarreador considerável.

Os resultados deste estudo indicaram que C ₆₀ nanocomplexos de entrega à base de fulereno tiveram um valor potencial para a otimização da eficiência da doxorrubicina contra células leucêmicas.

Introdução

Os principais esforços na pesquisa do câncer visam encontrar formas mais poderosas e seletivas para a eliminação direta das células cancerosas. Essa tarefa pode ser abordada por meio da nanobiotecnologia. O progresso recente neste campo aumentou o interesse em uma nanoestrutura de carbono - C ₆₀ fulereno [1] que não só exibe propriedades físico-químicas únicas [2, 3], atividade biológica [4,5,6,7,8,9,10] e comportamento antioxidante [11,12,13,14], mas também possui um potencial significativo para servir como um nanocarreador para entrega de drogas em células cancerosas [15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25] (aqui consistentemente abreviado como “C ₆₀ ”).

O fármaco quimioterápico anticâncer antraciclina Doxorrubicina (aqui abreviado consistentemente como "Dox") é um dos primeiros candidatos para uma nanoentrega mais direcionada devido à cardiotoxicidade com risco de vida e outros efeitos colaterais graves [25, 26]. O principal mecanismo de toxicidade Dox contra células cancerosas é a sua intercalação em DNA nuclear seguida pela inibição da atividade da topoisomerase, replicação de DNA e reparo [26,27,28]. Mas os efeitos colaterais de Dox nos cardiomiócitos são considerados determinados por outro mecanismo, principalmente, a formação de espécies reativas de oxigênio relacionadas ao ferro [27, 28]. A combinação de C ₆₀ potencial antioxidante [2, 11, 13] e sua capacidade de entrega de drogas [24, 25] torna a nanoestrutura muito atraente para terapia anticâncer.

A complexação de Dox com nanoestruturas aumenta o tamanho da droga, melhorando sua retenção no organismo e prolongando a atividade terapêutica [29, 30]. Para desenvolver um nanossistema aplicável para uma liberação de drogas anticâncer bem-sucedida, estudos anteriores focaram em aspectos relacionados à estabilidade, biocompatibilidade, biodistribuição e funcionalidade [29,30,31,32,33].

Um acoplamento de Dox e C ₆₀ para um direcionamento passivo de células cancerosas pode ser alcançado por ligação covalente [15,16,17, 23] ou por interações não covalentes [18,19,20,21,22]. Um complexo de C ₆₀ com duas moléculas Dox ligadas a amida mostraram a mesma citotoxicidade contra células de câncer de mama humano MCF-7 que a droga livre [16]. Quando Dox estava vinculado a C ₆₀ por meio de um ligante carbamato, não exibiu nenhuma alteração na eficácia antitumoral, mas não apresentou toxicidade sistêmica em um modelo de tumor murino [17]. Quando uma ou duas moléculas Dox foram ancoradas em C ₆₀ peguilado partículas através de uma ligação do tipo uretano, o complexo exibiu até mesmo um efeito antiproliferativo retardado nas células MCF-7 [23].

Para complexação não covalente da molécula Dox aromática com a superfície poliaromática de C ₆₀ , o efeito de empilhamento π-π é o responsável. Em uma tentativa pioneira, Evstigneev et al. [19] mostrou um método simples e rápido de C ₆₀ complexação não covalente com Dox em água [19] e em solução fisiológica [20]. O nanossistema proposto demonstrou ter maior toxicidade em comparação com a droga livre contra várias linhas de células tumorais humanas in vitro e carcinoma de pulmão de Lewis de camundongo in vivo [21, 22]. Em outra abordagem, um efeito antimicrobiano e a aplicabilidade para imagens in vivo foram mostrados [18].

O objetivo da pesquisa apresentada é avaliar as propriedades físico-químicas do C ₆₀ -Dox complexo formado após interação não covalente dos componentes, seu acúmulo intracelular e potencial citotóxico contra linhagens de células leucêmicas humanas.

Métodos / Experimental

Químicos

Meio líquido RPMI 1640, solução salina tamponada com fosfato (PBS), soro bovino fetal (FBS), penicilina / estreptomicina e L-glutamina foram obtidos na Biochrom (Berlim, Alemanha). Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT) e Hoechst 33342 foram obtidos de Sigma-Aldrich Co. (St-Louis, EUA). Dimetilsulfóxido (DMSO), cloreto de sódio, acetonitrila, ácido fórmico e azul de tripano da Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Alemanha) foram usados.

C ₆₀ e C ₆₀ -Dox Complex Synthesis

O primitivo C ₆₀ solução colóide aquosa foi preparada por C ₆₀ transferência de tolueno para água usando sonicação de ultrassom contínua, conforme descrito por Ritter et al. [34] O obtido C ₆₀ solução colóide de água teve uma concentração final de 150 μg / ml com 99% de pureza, estabilidade e homogeneidade e um tamanho médio de nanopartícula de 100 nm [34, 35].

Dox (“Doxorubicin-TEVA”, Pharmachemie B.V., Utrecht, Holanda) foi dissolvido em solução fisiológica a uma concentração inicial de 150 μg / ml.

A C ₆₀ O complexo -Dox foi preparado de acordo com o protocolo [20]. Resumidamente, C ₆₀ e as soluções Dox foram misturadas na proporção em peso de 1:1 ou 2:1. A mistura foi tratada no dispersor ultrassônico por 30 min e agitada magneticamente por 24 h em temperatura ambiente. A concentração final de ambos C ₆₀ e Dox no C ₆₀ O complexo -Dox 1:1 foi de 75 μg / ml. A concentração final de C ₆₀ e Dox no C ₆₀ O complexo -Dox 2:1 foi de 100 μg / ml e 50 μg / ml, respectivamente. A droga não ligada foi lavada com o kit de diálise Pur-A-LyzerTM Midi 1000 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EUA). A estabilidade (valor do potencial ζ) e a distribuição do tamanho (diâmetro hidrodinâmico) [20, 36,37,38,39] dos complexos foram sistematicamente verificados e mostraram estar praticamente inalterados após 6 meses de armazenamento em solução salina fisiológica. A concentração de trabalho de C ₆₀ Os complexos -Dox nas sondas foram apresentados de acordo com a concentração de equivalente Dox na faixa de 0,1–100 μM propositalmente para comparar o efeito dos complexos com o efeito do fármaco livre na mesma concentração.

Cromatografia líquida de alto desempenho - espectrometria de massa em tandem

Espectrometria de massa do C ₆₀ Os complexos -Dox após a separação cromatográfica foram obtidos com um espectrômetro de massa tandem quadrupolo LCMS-8040, equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) (Shimadzu, Kyoto, Japão) acoplada a um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) Nexera. Este último usou uma coluna Eclipse XDB-C18 100 mm × 4,6 mm, 3 μM (Agilent, Santa Clara, EUA) com uma fase móvel isocrática de acetonitrila e solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (80:20, v / v ) a uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min. As condições cromatográficas de fase reversa e parâmetros MS / MS otimizados são apresentados na Tabela 1. Para identificação e quantificação, o íon molecular de Dox foi escolhido. A análise HPLC-ESI-MS / MS foi realizada no modo positivo usando o regime de monitoramento de reação múltipla (MRM) que fornece a melhor sensibilidade e precisão das medições. Após a otimização MS / MS, uma transição MRM exclusiva que inclui íons precursores e produtos característicos foi adquirida e usada para posterior identificação e quantificação. O Dox protonado ([M ⁺ H] ⁺ , 544,2 m / z) foi usado como um íon precursor com os íons de fragmento mais abundantes de 130,2 e 361,1 m / z.

Para o processamento dos dados, foi utilizado o software LabSolutions HPLC-MS / MS (Shimadzu, Kyoto, Japão). Outros parâmetros foram ajustados automaticamente.

Os padrões de calibração Dox de 0,005 a 5 μM foram preparados a partir de uma solução estoque de água de 1,85 mM. Os padrões foram armazenados no escuro a 4 ° C. As curvas de calibração foram traçadas com 1 / X ponderação, r ² =0,99463. Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) foram definidos de acordo com LOD =3,3 × s / Inclinação e LOQ =10 × s / Inclinação, respectivamente, onde s é o desvio padrão da linha de regressão.

Análise espectroscópica e fluorométrica

Os espectros de absorbância e fluorescência de Dox e C ₆₀ livres -Dox complex foram medidos nos seguintes parâmetros:(1) absorbância - faixa de comprimento de onda 400-550 nm, comprimento de onda tamanho do passo 5 nm, número de flashes por poço 25; (2) fluorescência - λ _ex =470 nm, faixa de comprimento de onda 500-800 nm, comprimento de onda tamanho da etapa 2 nm, número de flashes por poço 25. Um volume de 100 μl das soluções estudadas foi medido nas placas de 96 poços Sarstedt (Nümbrecht, Alemanha) com um multimodo espectrômetro de microplaca Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Suíça).

Difusão dinâmica de luz

C ₆₀ A distribuição do tamanho do complexo -Dox foi avaliada com um Zetasizer Nano S (Malvern Instruments, UK) equipado com um laser He-Ne (633 nm). Os dados foram registrados a 37 ° C em modo de retroespalhamento a um ângulo de espalhamento de 2 θ =173 °.

Cultura de células

As linhas de células T de câncer humano de origem de leucose CCRF-CEM (ACC 240), Jurkat (ACC 282) e Molt-16 (ACC 29) foram adquiridas do Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen). O THP1 foi gentilmente cedido pela Dra. Sofia Cortes (Universidade Nova de Lisboa, Portugal).

As células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina e 2 mM de glutamina, usando 25 cm ² frascos a 37 ° C com 5% CO ₂ em uma incubadora Binder umidificada (Tuttlingen, Alemanha). O número de células viáveis ​​foi contado após coloração com azul de tripano 0,1% com um Roche Cedex XS Analyzer (Basel, Suíça).

Viabilidade celular

10 ⁴ células / poço foram cultivadas em placas de cultura de células de 96 poços Sarstedt (Nümbrecht, Alemanha) por 24 h. O meio de cultura de células foi substituído por um meio suplementado com fármaco. As células foram incubadas na presença de concentrações variáveis ​​de Dox ou C ₆₀ livre -Dox complex. Após 24, 48 e 72 h de incubação, a viabilidade celular foi determinada com o ensaio de redução MTT [40]. Resumidamente, 10 μl de solução de MTT (5 mg / ml em PBS) foram adicionados a cada poço e as células foram incubadas por 2 h a 37 ° C. O meio de cultura foi então substituído por 100 μl de DMSO e a formação de diformazan foi determinada medindo a absorção a λ =570 nm com o leitor de microplacas Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Suíça). O ajuste da curva e o cálculo dos valores da metade da concentração inibitória máxima (IC50) foram feitos usando software especializado GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., EUA). Resumidamente, curvas de efeito de concentração individuais foram geradas ajustando o logaritmo da concentração do composto testado versus a porcentagem normalizada correspondente dos valores de viabilidade celular usando regressão não linear.

Microscopia Fluorescente

As células CCRF-CEM foram semeadas em placas de 6 poços Sarstedt (Nümbrecht, Alemanha) a uma densidade celular de 2 × 10 ⁵ células / poço em 2 ml de meio de cultura e incubadas por 24 h. Em seguida, as células foram tratadas com 1 μM de Dox livre ou C ₆₀ -Dox complex durante 1, 3 e 6 he lavado com PBS. A visualização foi realizada com um microscópio de fluorescência Keyence BZ-9000 BIOREVO (Osaka, Japão) equipado com vermelho (λ _ex =480 nm, λ _em =600 nm) e um respectivo software de aquisição Keyence BZ-II Viewer (Osaka, Japão).

Citometria de fluxo

Células CCRF-CEM (2 × 10 ⁵ / poço, 2 ml) foram semeados em placas de 6 poços, incubados por 24 h e, em seguida, tratados com 1 μM livre e C ₆₀ vinculado a Dox. Após 1, 3 e 6 h de incubação, as células foram colhidas, lavadas com PBS e analisadas com o citômetro de fluxo BD FACSJazz ™ (Singapura). No mínimo 2 × 10 ⁴ células por amostra foram adquiridas e analisadas com o software BD FACS ™ (Cingapura).

Estatísticas

Todos os experimentos foram realizados com um mínimo de quatro repetições. A análise dos dados foi realizada com a utilização do GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., USA). Alunos em pares t testes foram realizados. Valores de diferença p <0,05 foram considerados significativos.

Resultados e discussão

Análise HPLC-MS / MS de C ₆₀ -Dox Complexos

Para a separação cromatográfica, usamos as condições de fase reversa, prevendo que durante o processo de separação, o C hidrofóbico ₆₀ as moléculas são retidas na coluna muito mais fortes do que as do Dox mais polar [41]. A eluição com a fase móvel polar deve evidentemente causar decomposição do complexo e liberação de Dox livre que possui maior afinidade para a fase móvel e pode ser detectada por espectrometria de massa.

Para confirmar a presença do complexo na solução, uma concentração de 1 μM de Dox foi escolhida como uma ótima para análise analítica. Em condições de fluxo isocrático, o tempo de retenção para Dox e Dox livres como um componente dos complexos com C ₆₀ foi diferente - 11,66 e 9,44 min, respectivamente (Fig. 1). Além disso, os picos de cromatografia de Dox liberados dos complexos eram mais amplos e com "cauda de pico" observada. Mudança detectada nos tempos de retenção, bem como diferentes formas de seleção indicam que a decomposição de C ₆₀ -Dox conjugados nas moléculas de fulereno da coluna que possuem maior afinidade para a coluna C18. Portanto, a nanoestrutura ocupa uma parte dos locais de ligação ativa e interfere na ligação de Dox a esses locais de forma adequada, afetando assim o processo de separação. Isso resultou em retenção mais curta (tempo reduzido necessário para Dox passar pela coluna), bem como limite de pico e cauda para Dox liberado do complexo em comparação com a droga livre. Um fenômeno muito semelhante foi observado por Lie et al. [42] durante a separação cromatográfica de C ₆₀ complexos não covalentes com pululano. As diferenças nos cromatogramas do Dox livre e aqueles liberados dos complexos evidentemente apontados na presença de C ₆₀ -Dox complexos em solução.

Cromatogramas de monitoramento de múltiplas reações de Dox livre (1 μM), C ₆₀ -Dox 1:1 e C ₆₀ -Dox 2:1 (concentração equivalente a 1 μM de Dox) sob fluxo isocrático (acetonitrila, 0,1% de ácido fórmico em H ₂ O, 80:20, v : v ), transição de íons precursor → produto:544,2 → 130,2 e 361,1 m / z; a.u. unidades arbitrárias

Análise espectroscópica e fluorométrica

As propriedades ópticas de Dox são determinadas pela transição de elétrons no sistema π-complexado de seus anéis aromáticos e grupos cetônicos [43]. O espectro de absorção típico de Dox encontra-se nos comprimentos de onda de λ <600 nm com uma banda larga em 480 nm (Fig. 2a). O espectro de absorção de UV / Vis do C ₆₀ puro solução coloidal de água tem três bandas de absorção típicas com máximos em 220, 265 e 350 nm e uma longa cauda larga menor até a região vermelha da luz visível [34, 44]. Portanto, os respectivos espectros de controle de C ₆₀ livre foram subtraídos dos espectros do complexo. Os espectros de absorção observados de ambos os complexos de 50 μM foram semelhantes aos do Dox 50 μM livre, mas um efeito hipocrômico de 30% foi observado (Fig. 2a) indicando uma fixação de Dox no C ₆₀ superfície devido às interações de empilhamento π-π.

Caracterização óptica de complexos. Espectros de densidade óptica de Dox e C livres ₆₀ -Dox complexos ( a ) Espectros de emissão de fluorescência de Dox e C livres ₆₀ -Dox complexos em concentração equivalente a Dox de 3 a 50 μM ( b ); a.u. unidades arbitrárias

O comprimento de onda máximo de absorção de Dox (λ =480 nm) foi usado como um comprimento de onda de excitação para rastrear sua fluorescência. O espectro de fluorescência exibe uma banda larga que consiste em três picos em 560, 594 e 638 nm com um máximo em torno de 594 nm (Fig. 2b) [43], enquanto C ₆₀ não tem fluorescência detectável nesta banda espectral. C ₆₀ A fluorescência dos complexos -Dox foi estimada em uma série de diluições com concentração equivalente a Dox de 3 a 50 μM. Independentemente da diluição, a fluorescência de Dox (λ _ex =480 nm, λ _em =594 nm) nos complexos foi extinto por C ₆₀ porções (Fig. 2b). Assim, a fluorescência de Dox em ambos os complexos em concentração equivalente a 3 μM de Dox pareceu ser extinta em 50%. A extinção de fluorescência Dox observada é atribuída à forte capacidade de aceitação de elétrons de C ₆₀ [3] e transferência de energia de estado excitado intramolecular típica para complexos Dox não covalentes [18, 36, 45], indicando a proximidade espacial dos componentes.

Análise de distribuição de tamanho por espalhamento dinâmico de luz

O tamanho e a estabilidade de um fármaco anticâncer nanoparticulado são substancialmente dependentes da composição do meio de cultura de células, força iônica e concentração de proteína. O diâmetro hidrodinâmico médio de 1 μM C ​​ ₆₀ -Dox 1:1 e 2:1 complexos em solução salina fisiológica (0,9% NaCl) foi encontrado para ser 135 ± 5 nm e 134 ± 6 nm, respectivamente, coincidindo com os dados de investigações anteriores [20]. Para estimar a estabilidade em meio de cultura de células, 1-μM C ₆₀ Os complexos -Dox foram incubados a 37 ° C por 72 h em RPMI suplementado com FBS a 10%. O padrão de distribuição do tamanho de partícula neste meio (Fig. 3) é atribuído ao alto teor de proteína, bem como sua provável agregação [46, 47].

Tamanho hidrodinâmico (diâmetro, nm) de 1 μM С ₆₀ -Dox complexos em meio de cultura de células RPMI suplementado com 10% de FBS em 0 ( a ) e 72-h ( b ) incubação. Porcentagem de intensidade (%) de toda a intensidade da luz espalhada

Os dados de dispersão de luz dinâmica em 1 μM C ​​ ₆₀ - A distribuição do diâmetro hidrodinâmico do nanocomplexo 1:1 e 2:1 em cultura de células suplementadas com FBS mostrou que seu tamanho era de 138 ± 6 nm e 139 ± 5 nm quando medido imediatamente (Fig. 3a) e 146 ± 4 nm e 144 ± 5 nm após 72 h de incubação (Fig. 3b), respectivamente.

A estabilidade detectada do máximo (cerca de 140 nm) indicou que não houve agregação adicional do C ₆₀ -Dox complexes durante uma incubação prolongada em meio de cultura de células suplementado com FBS que confirmou sua adequação para estudos in vitro.

Viabilidade celular

A viabilidade de células leucêmicas humanas de diferentes linhagens foi estimada pelo teste MTT em 24, 48 e 72 h de incubação na presença de C ₆₀ -Dox complexos, bem como de Dox livre separadamente em concentrações equivalentes. C ₆₀ sozinho em concentrações equivalentes às dos complexos não teve efeito sobre a viabilidade das células leucêmicas (dados não mostrados).

A Figura 4 apresenta a diminuição dependente do tempo e da concentração da viabilidade das células leucêmicas sob tratamento com Dox. A droga mostrou apresentar toxicidade contra células leucêmicas na faixa nanomolar. A sensibilidade das células leucêmicas ao Dox foi encontrada para seguir a ordem Molt-16 ˃ THP1 ˃ Jurkat ˃ CCRF-CEM (menos sensível).

Viabilidade de células leucêmicas CCRF-CEM, Jurkat, THP1 e Molt16, tratadas com doses iguais de Dox ou C livre ₆₀ -Complexos Dox para 24, 48 e 72 h (* p ≤ 0,05 em comparação com o Dox livre, ** p ≤ 0,05 em comparação com C ₆₀ -Dox 1:1 complexo, n =5)

Sob ação de Dox 100 nM, a viabilidade das células CCRF-CEM foi diminuída para 84 ± 7, 50 ± 4 e 34 ± 7% em comparação com o controle em 24, 48 e 72 h, respectivamente. O padrão comparável de efeito tóxico Dox 100 nM foi encontrado em células Jurkat. A viabilidade das células THP1 após o tratamento com células Dox 100 nM foi de 50 ± 4, 47 ± 5 e 13 ± 4% em 24, 48 e 72 h, respectivamente. As concentrações inibitórias de Dox metade do máximo (IC50) para células CCRF-CEM, THP1 e Jurkat em 72 h de incubação foram estimadas em 80 ± 9, 43 ± 5 e 38 ± 6 nM, respectivamente. Esses dados correspondem aos dados da literatura [48, 49]. As células Molt-16 pareceram ser as mais sensíveis à droga, uma vez que seu efeito tóxico foi detectado na faixa de 1 a 25 nM em todos os períodos de incubação celular. A viabilidade das células Molt-16 tratadas com 5 nM Dox foi diminuída para 75 ± 4, 28 ± 4 e 18 ± 4% daquela do controle em 24, 48 e 72 h, respectivamente, e o valor de IC50 em 72 h foi igual a apenas 2,0 nM. A alta sensibilidade semelhante de células Molt-16 com indução de apoptose 10 vezes mais intensa em comparação com células Jurkat sob tratamento de um alcalóide à base de plantas foi relatada anteriormente por Cai et al. [50].

As células tratadas com Dox livre foram usadas como um controle para avaliar a viabilidade sob a ação de C ₆₀ -Dox complexos nas doses equivalentes da droga. O valor de IC50 para Dox e C gratuitos ₆₀ Os complexos -Dox foram calculados para cada ponto de tempo e linha celular e estão listados na Fig. 4.

Foi demonstrado que ambos C ₆₀ Os complexos -Dox possuíam maior potencial tóxico em comparação com o Dox livre contra linhagens de células leucêmicas humanas (Fig. 4).

Em resumo, nossos numerosos experimentos mostraram para as quatro linhas de células uma variedade de toxicidades aumentadas em até 3,5 vezes. C ₆₀ O complexo -Dox 1:1 mostrou maior toxicidade em comparação com o complexo 2:1. O efeito menos pronunciado (diminuição de IC50 em ≥ 2,5 vezes em comparação com aquele para Dox livre) do complexo 2:1 pode ser atribuído à maior concentração de C ₆₀ como seu componente. Devido à sua atividade antioxidante [11, 13], excesso de C ₆₀ pode proteger as células contra o estresse oxidativo associado a Dox [27].

Acúmulo intracelular de Dox e C grátis ₆₀ -Dox Complexos

Para investigar uma correlação potencial do efeito tóxico aumentado de C ₆₀ -Dox complexos com um acúmulo de droga intracelular mais eficaz, a absorção celular de Dox livre e C ₆₀ -Dox foi estudado. Uma vez que Dox possui forte absorção e fluorescência na região espectral visível [43, 45] (Fig. 2), o rastreamento de complexos Dox é possível com técnicas não invasivas baseadas em fluorescência direta. As células CCRF-CEM foram incubadas na presença de 1 μM Dox ou C ₆₀ -Dox complexos em uma concentração de droga equivalente, examinados com microscopia fluorescente e submetidos a citometria de fluxo para quantificar o nível intracelular de droga acumulada após 1, 3 e 6 horas de tratamento (Fig. 5). A intensidade média de fluorescência de cada amostra foi calculada a partir de histogramas FACS logarítmicos pelo valor do respectivo sinal fluorescente vermelho Dox (λ _ex =488 nm, λ _em =585/29 nm) e apresentado na Tabela 2. A autofluorescência de células não tratadas foi usada como um controle negativo (Fig. 5a).

Acúmulo intracelular de 1 μM livre e C ₆₀ Dox complexado. Citometria de fluxo ( a ) e imagens de microscopia fluorescente ( b ) de células CCRF-CEM incubadas com Dox e C ₆₀ -Dox na proporção 1:1 e 2:1 por 1, 3 e 6 h. Barra de escala 20 μM

O acúmulo dependente do tempo de 1 μM Dox foi estimado pelo aumento da intensidade de fluorescência (Fig. 5, Tabela 2). As imagens de microscopia de fluorescência ilustram que C ₆₀ Os complexos -Dox foram internalizados mais rapidamente do que o fármaco livre, conforme evidenciado por uma fluorescência intracelular muito mais brilhante (Fig. 5b). As intensidades médias de fluorescência das células CCRF-CEM, tratadas com 1:1 C ₆₀ O complexo -Dox na concentração equivalente a 1 μM de Dox aumentou em 1,5, 1,7 e 2,2 vezes em comparação com o Dox livre em 1, 3 e 6 h, respectivamente. 2:1 C ₆₀ O complexo -Dox exibiu acúmulo de droga intracelular retardado atingindo o mesmo nível que o complexo 1:1 em 6 h (Fig. 5, Tabela 2).

Os dados obtidos demonstraram que a complexação Dox com C ₆₀ promoveu a entrada nas células, mas não afetou sua localização. A coloração de controle das células estudadas com o corante de ligação ao DNA Hoechst 33342 revelou sua co-localização com o sinal Dox (dados não mostrados). Evidentemente, moléculas Dox de C ₆₀ complexos e a droga livre entraram nos núcleos que refletem seu impacto antiproliferativo através do dano ao DNA [26,27,28]. Uma captação intracelular aumentada da droga após complexação com C ₆₀ aponta para este último funcionando como um promotor do transporte de drogas. C ₆₀ foi demonstrado que a nanoestrutura transmigra a membrana plasmática celular devido à difusão passiva [51] e / ou endocitose / pinocitose [52, 53], enquanto que moléculas pequenas como Dox podem penetrar apenas por difusão passiva. O C ₆₀ estrutura assemelha-se à estrutura da clatrina [54, 55], o principal componente do revestimento da formação de vesículas durante a endocitose. Portanto, C ₆₀ pode funcionar como um transportador de pequenas moléculas aromáticas [56]. Pelo contrário, uma ligação covalente entre o transportador e a carga introduz uma alteração estrutural na molécula do fármaco. Consequentemente, o padrão de acumulação e a interação com alvos intracelulares são alterados, resultando na perda total ou parcial da função da droga. Liu et al. [15] mostrou que C ₆₀ com duas moléculas Dox ligadas por uma ligação amida foi distribuída predominantemente no citoplasma.

Conclusão

As propriedades físico-químicas de C ₆₀ Os complexos -Dox com proporção de 1:1 e 2:1 dos componentes foram determinados e sua toxicidade contra células leucêmicas humanas CCRF-CEM, Jurkat, Molt-16 e THP1 foi estimada.

A análise de HPLC-MS / MS revelou distinções evidentes nos cromatogramas de Dox livre e aqueles liberados de C ₆₀ -Dox complexos. Complexação de C ₆₀ com Dox foi confirmado por efeito hipocrômico de absorção e extinção de fluorescência em C ₆₀ -Dox complexos. Determinamos que o tamanho de C ₆₀ Os complexos -Dox em torno de 140 nm foram retidos na presença de proteína e incubação prolongada no meio. Estudos em linhas de células leucêmicas humanas revelaram que C ₆₀ Os complexos -Dox possuem maior citotoxicidade em comparação com o fármaco livre em concentrações equivalentes. Às 72 h de incubação das células, o valor de IC50 para os complexos 1:1 e 2:1 diminuiu ≤ 3,5 e ≤ 2,5 vezes, respectivamente, em comparação com IC50 para o fármaco livre. Complexação com C ₆₀ promoveu a entrada de Dox nas células leucêmicas. Um tratamento de células CCRF-CEM por 6 h com C ₆₀ Os complexos -Dox em concentração equivalente a 1 μM de Dox foram seguidos por um aumento de 2,2 vezes do nível intracelular da droga em comparação ao tratamento com Dox livre.

Nossos resultados confirmam a função de C ₆₀ como nanocarreador e a perspectiva de sua aplicação para otimização da eficiência Dox contra células leucêmicas. Como o Dox é apenas uma substância representativa ou modelo para muitos medicamentos antitumorais, esperamos que nossos resultados sejam transferidos para outros medicamentos. O aumento da absorção de um medicamento pelas células tumorais e / ou suas qualidades antitumorais podem apontar para novas estratégias de tratamento. A complexação de drogas com nanocarreadores pode servir para reduzir suas taxas de dosagem eficazes e, assim, atenuar os efeitos colaterais indesejados.

Histórico de alterações

Abreviações

C ₆₀ :

C ₆₀ fulereno

DMSO:

Dimetilsulfóxido

Dox:

Doxorrubicina

ESI:

Ionização por electrospray

FBS:

Soro fetal bovino

HPLC-MS / MS:

Espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida de alto desempenho

IC50:

Metade da concentração inibitória máxima

LOD:

Limite de detecção

LOQ:

Limite de quantificação

MRM:

Monitoramento de múltiplas reações

MTT:

Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio

PBS:

Salina tamponada com fosfato

Caracterizações estruturais e propriedades dielétricas de pós de PbTiO3 semelhantes a esferas e bastões sintetizados via síntese de sal fundido Preparação e caracterização fácil de polianilina e CeO2 Co-Decorated TiO2 Nanotube Array e sua atividade fotoeletrocatalítica altamente eficiente