Nanocomplexos de Fullereno C₆₀ Potenciam Doxorrubicina Contra Células de Leucemia In Vitro

Resumo

A quimioterapia tradicional frequentemente falha devido a efeitos colaterais graves e o rápido surgimento de multirresistência a fármacos. Investigamos o fullereno C₆₀ como transportador nanoescala para doxorrubicina (Dox) para melhorar a entrega do fármaco especificamente a células leucêmicas. Nanocomplexos não-covalentes C₆₀-Dox (razões 1:1 e 2:1) foram caracterizados por UV/Vis, espalhamento dinâmico de luz e HPLC-MS/MS, confirmando tamanho estável de nanopartícula de 140 nm adequado para uso biológico. Em linhagens de células leucêmicas (CCRF-CEM, Jurkat, THP-1, Molt-16), esses complexos exibiram citotoxicidade até 3,5 vezes maior que Dox livre em concentrações nanomolares, com evidência de acúmulo intracelular apoiando entrega aprimorada. Esses achados sugerem fullereno C₆₀ como nanotransportador promissor para melhorar a eficácia da Dox contra leucemia.

Introdução

Nanobiotecnologia oferece caminho para terapias anticâncer mais seletivas e potentes. O fullereno C₆₀, uma nanoestrutura de carbono esférica, exibe propriedades físico-químicas únicas, atividade antioxidante intrínseca e capacidades comprovadas de carregamento de fármacos. A doxorrubicina, embora eficaz, é limitada por cardiotoxicidade e estresse oxidativo. Combinar Dox com C₆₀ aproveita as propriedades antioxidantes e potencial de entrega do fullereno para mitigar efeitos colaterais e melhorar direcionamento tumoral. Estudos prévios mostraram que complexos não-covalentes de C₆₀ podem aumentar atividade anticâncer in vitro e in vivo. Este estudo avalia as características físico-químicas, captação celular e potência citotóxica de complexos C₆₀-Dox contra linhagens de células leucêmicas humanas.

Métodos

Materiais

Químicos e linhagens celulares foram obtidos de fornecedores padrão (Biochrom, Sigma-Aldrich, Instituto Leibniz DSMZ). Condições de cultura celular seguiram protocolos padrão ISO.

Preparação dos Complexos

Coloides aquosos de C₆₀ prístino foram preparados via sonicação por ultrassom, alcançando pureza de 150 µg mL⁻¹ e diâmetro hidrodinâmico de 100 nm. Dox foi dissolvido a 150 µg mL⁻¹ e misturado com C₆₀ em razões de peso 1:1 ou 2:1, sonicado por 30 min e agitado 24 h à temperatura ambiente. Fármaco livre em excesso foi removido por diálise. Concentrações finais dos complexos foram 75 µg mL⁻¹ (1:1) e 100/50 µg mL⁻¹ (2:1). Estabilidade foi confirmada por 6 meses em salina.

Caracterização Analítica

HPLC-MS/MS (Shimadzu LCMS-8040) quantificou liberação de Dox, usando coluna C18 e fase móvel acetonitrila:água com ácido fórmico 0,1% 80:20. Espectros de absorção UV/Vis e fluorescência foram registrados com Tecan Infinite M200 Pro. Espalhamento dinâmico de luz (Malvern Zetasizer Nano S) mediu tamanho de partícula em PBS e RPMI-1640 +10% FBS.

Viabilidade Celular

Ensaios MTT avaliaram viabilidade de 10⁴ células/poço após 24, 48 e 72 h de exposição a Dox livre ou complexos C₆₀-Dox a 0,1–100 µM. Valores IC₅₀ foram derivados via regressão não-linear (GraphPad Prism 7).

Estudos de Captação

Microscopia de fluorescência (Keyence BZ-9000) e citometria de fluxo (BD FACSJazz) quantificaram Dox intracelular após 1, 3 e 6 h de exposição a 1 µM de fármaco livre ou complexado em células CCRF-CEM.

Resultados

Estabilidade e Tamanho dos Complexos

Cromatogramas HPLC-MS/MS revelaram tempos de retenção distintos para Dox livre (11,66 min) versus Dox ligado ao complexo (9,44 min), confirmando formação do complexo. Espectros UV/Vis mostraram deslocamento hipocrômico de 30% na absorbância, enquanto quenching de fluorescência (~50% a 3 µM) indicou empilhamento π-π próximo entre Dox e C₆₀. DLS determinou diâmetro hidrodinâmico médio de ~140 nm, estável em PBS e após 72 h de incubação em RPMI-1640 +10% FBS.

Citotoxicidade Aumentada

Todas as quatro linhagens leucêmicas exibiram sensibilidade nanomolar a Dox, com valores IC₅₀ variando de 2 nM (Molt-16) a 80 nM (CCRF-CEM). Complexos C₆₀-Dox consistentemente reduziram valores IC₅₀ em até 3,5 vezes comparado ao fármaco livre, com o complexo 1:1 superando a razão 2:1. O maior teor de C₆₀ no complexo 2:1 pode conferir proteção antioxidante, mitigando estresse oxidativo induzido por Dox.

Aumento da Captação Intracelular

Microscopia de fluorescência e citometria de fluxo demonstraram que complexos C₆₀-Dox entraram nas células mais rapidamente que Dox livre, alcançando aumento de 1,5–2,2 vezes na fluorescência intracelular às 6 h. Dox localizou-se no núcleo em ambas formulações, conforme confirmado por colocalização com coloração Hoechst 33342.

Conclusão

O fullereno C₆₀ forma complexos estáveis, de 140 nm, não-covalentes com doxorrubicina que aumentam marcadamente sua citotoxicidade contra células leucêmicas humanas. O nanotransportador facilita captação celular mais rápida sem alterar localização do fármaco, alcançando até 3,5 vezes mais potência em doses equivalentes. Esses resultados apoiam desenvolvimento adicional de nanocomplexos de C₆₀ para reduzir concentrações efetivas de Dox, potencialmente diminuindo cardiotoxicidade e outros efeitos adversos em contextos clínicos.