Nanopartículas de Ouro Modulam o Metabolismo da Testosterona em Microssomos Hepáticos Humanos: Efeitos do Tamanho, Química de Superfície e Coroa Proteica

Resumo

Complexos de nanopartículas de ouro (AuNPs) com coroa proteica podem alterar o metabolismo da testosterona (TST) mediado pelo citocromo P450 (CYP) ao modificar suas propriedades físico-químicas. Investigamos como o tamanho das NPs, a química de superfície e a coroa proteica do plasma humano (PC) influenciam o metabolismo da TST em microssomos hepáticos humanos agrupados (pHLM). AuNPs de 20-40 nm e 80 nm funcionalizadas com polietilenimina ramificada (BPEI), ácido lipoico (LA) ou polietileno glicol (PEG) foram estudadas, tanto na forma nua quanto com PC. Em pHLM, AuNPs nuas de 40 nm inibiram a formação de cinco metabólitos hidroxilados da TST, enquanto partículas de 80 nm tiveram efeito mais fraco. A PC atenuou amplamente essas inibições. Surpreendentemente, AuNPs nuas aumentaram a produção de androstenediona. Em microssomos hepáticos de doador único (HLM), observou-se variabilidade interindividual; a maioria das AuNPs suprimiu o metabolismo da TST em concentrações não inibitórias, enquanto AuNPs PEG-com-PC estimularam a produção de androstenediona. Esses achados destacam as AuNPs como potenciais disruptores endócrinos ao modular o metabolismo da TST e fornecem uma estrutura para triagem de outros nanomateriais.

Introdução

AuNPs são amplamente utilizadas em administração de fármacos, diagnósticos e produtos de consumo devido às suas propriedades ópticas e físicas únicas (Refs. 1-3). Ao serem expostas a fluidos biológicos, as AuNPs adsorvem rapidamente proteínas, formando uma coroa que modifica a química de superfície, a conformação proteica e as respostas biológicas subsequentes, incluindo citotoxicidade, captação celular e atividade enzimática do CYP (Refs. 4-7). Estudos in vitro demonstraram que AuNPs podem ser tóxicas para hepatócitos humanos, a linhagem hepatoma C3A e espermatozoides (Refs. 6-8), mas a presença de PC pode atenuar ou potencializar esses efeitos dependendo da química de superfície (Refs. 6-7). A formação de PC também interfere na captação celular em vários tipos celulares, independentemente do tamanho ou carga das NPs (Refs. 6-12).

Enzimas CYP no fígado metabolizam compostos endógenos e exógenos. Vários agentes — incluindo fármacos, pesticidas e nanopartículas — podem interromper a síntese e o metabolismo de hormônios esteroides, levando a funções fisiológicas alteradas (Refs. 13-17). A testosterona (TST) é um andrógeno primário e substrato do CYP3A4, que a hidroxila em 6β-OH-TST. Hidroxilações adicionais pelo CYP3A4 produzem 2β-OH-TST, 15β-OH-TST, 16α-OH-TST e 16β-OH-TST, enquanto o CYP2D6 desalquila a TST em androstenediona (AD) (Refs. 17, 19, 27). Trabalhos anteriores indicam que AuNPs nuas e com PC modulam um amplo espectro de enzimas CYP, incluindo CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 e 3A4 (Refs. 6, 7, 20-21). AgNPs também suprimem a atividade do CYP3A4 em HLM (Ref. 22). AuNPs funcionalizadas com BPEI e LA diminuem a atividade do CYP3A4 em células C3A, mas a PC atenua esse efeito (Ref. 7). In vivo, pequenas AuNPs se acumulam no fígado e baço e alteram a expressão hepática de Cyp1a1 e Cyp2b (Ref. 23). Dados esses achados, o estudo atual investiga como a PC influencia o tamanho, carga e química de superfície das AuNPs no metabolismo da TST mediado por CYP em pHLM e HLM de doador único.

Métodos

Químicos

Testosterona, seus metabólitos e TST marcado com ¹³C₃ foram obtidos da MilliporeSigma (St. Louis, MO). Reagentes adicionais foram adquiridos da Steraloids ou MilliporeSigma. Solventes de grau LC-MS foram da Fisher Scientific; água ultrapura foi gerada por sistema Merck Synergy® UV-R.

Microssomos Hepáticos Humanos

HLM agrupados (pHLM) de 200 doadores (100 homens, 100 mulheres) e HLM de doador único foram obtidos da Corning Inc. (Charlotte, NC). Atividades CYP específicas de doadores são detalhadas na Tabela Suplementar S1.

Síntese de Nanopartículas de Ouro

Biopure™ AuNPs de 40 e 80 nm funcionalizadas com BPEI, LA ou PEG foram compradas da nanoComposix. A síntese do núcleo envolveu redução de HAuCl₄·3H₂O em K₂CO₃, seguida de envelhecimento e filtração por fluxo tangencial (TFF). Funcionalização de superfície: LA (0,2:1 p/p) ou PEG (0,5:1 p/p) foi adicionado, seguido por TFF e filtração estéril. Superfícies BPEI foram preparadas via química EDC/NHS ligando carboxila de LA a aminas de BPEI; BPEI não ligado foi removido por TFF e centrifugação.

Preparação da Coroa Proteica

Plasma humano agrupado (n=5) foi incubado com AuNPs de 40 ou 80 nm a 55% de volume de plasma em agitador a 37 °C (250 rpm, 1 h). AuNPs-PC foram coletadas por centrifugação (20.000×g, 20 °C, 20 min), lavadas três vezes com PBS e ressuspensas em PBS para caracterização.

Caracterização Física

DLS e TEM mediram tamanho de partícula, polidispersidade e potencial zeta. Medidas foram realizadas em água DI, PBS e tampão de incubação microssomal (pH 7,4) a 0 min e 45 min (37 °C). Grades de TEM foram examinadas em Tecnai G2 Spirit BioTWIN (120 kV). Espectros UV-Vis foram registrados com leitor Spectra Max i3.

Metabolismo In Vitro da Testosterona

Metabolismo linear da TST (10 µM) foi confirmado entre 1,3-9,3 mg mL⁻¹ de proteína microssomal por até 60 min. pHLM foram incubados com TST e concentrações variadas de AuNPs nuas ou com PC (0-571 µg mL⁻¹). Reações foram iniciadas com ou sem NADPH (0,25 mM NADP, 2,5 mM glicose-6-fosfato, 2 U mL⁻¹ desidrogenase) e interrompidas após 45 min a 37 °C com ácido fosfórico 4%. Supernatantes foram centrifugados, armazenados a -20 °C e processados para LC-MS/MS. HLM de doador único foram tratados similarmente a 10 µg mL⁻¹ de AuNPs.

Padrões e Preparação de Amostras

Padrões primários (1 mM) e ISTD (¹³C₃-TST) foram preparados em metanol. Padrões de trabalho variaram de 0,01 a 200 µM. Amostras QC foram 0,01, 0,05 e 0,1 µM. Amostras foram marcadas com ISTD, extraídas via placas Oasis PRIME HLB, lavadas, eluídas, diluídas e analisadas por LC-MS/MS.

Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas

Separação utilizou coluna Waters UPLC HSS T3 (2,1 × 50 mm, 1,8 µm) com fluxo de 600 µL min⁻¹. Gradiente: 30% B a 98% B em 8,4 min. Fonte ESI⁺ operou a 4000 V, 150 °C; dessecação a 450 °C. Transições MRM estão na Tabela Suplementar S2. Curvas de calibração abrangeram 0,001-20 µM. LOD e LOQ foram 0,001 µM e 0,005 µM, respectivamente.

Análise Estatística

Teste t de Student avaliou diferenças em D_H e PDI. IC₅₀ e EC₅₀ foram calculados via equação de Hill no GraphPad Prism®. ANOVA de uma via seguido por HSD de Tukey (p < 0,05) avaliou efeitos das AuNPs. Correlação de Pearson r correlacionou atividade CYP com produção de metabólitos.

Resultados e Discussão

Propriedades Físico-Químicas das AuNPs

TEM confirmou monodispersidade de todas as AuNPs nuas e com PC, exceto AuNPs BPEI-PC de 40 e 80 nm, que exibiram agregação em PBS. Valores de D_H aumentaram para AuNPs BPEI e LA nuas de 40 nm e AuNPs PEG-PC ao longo de 45 min, enquanto AuNPs LA-PC de 80 nm diminuíram. PDI aumentou para AuNPs nuas de 40 nm e AuNPs PEG-PC, e potencial zeta diminuiu ao longo do tempo para AuNPs BPEI nuas. Essas mudanças espelham achados anteriores onde PC altera tamanho, absorbância e morfologia das NPs (Refs. 6, 7, 10, 26).

Metabolismo da TST em HLM Agrupados

Seis metabólitos da TST (cinco hidroxilados e AD) foram detectados em pHLM. AuNPs nuas de 40 e 80 nm inibiram a produção de 2β-OH-TST, 6β-OH-TST e 15β-OH-TST de forma dose-dependente (IC₅₀: 416-1113 µg mL⁻¹). Não inibiram 16α- ou 16β-OH-TST, exceto AuNP BPEI de 40 nm que suprimiu levemente 16β-OH-TST na maior dose. Curiosamente, AuNPs nuas aumentaram a produção de AD em altas concentrações (4,3 pmol mg⁻¹ min⁻¹ para AuNP BPEI de 40 nm). AuNPs com PC aboliram amplamente essas inibições; a PC também atenuou o efeito estimulatório em AD para AuNP LA de 80 nm. No geral, AuNPs nuas reduziram a hidroxilação enquanto às vezes aumentaram a desalquilação, efeito atenuado pela PC.

Variabilidade em HLM de Doador Único

Atividade CYP específica de doador correlacionou-se fortemente com formação de metabólitos: 6β-OH-TST correlacionou com CYP2C19 (r = 0,99, p = 0,01) e CYP3A4 (r = 0,99, p = 0,03); AD correlacionou inversamente com CYP4A11 (r = -0,98, p = 0,04). AuNPs em concentrações não inibitórias modularam a produção de metabólitos diferentemente entre doadores, refletindo polimorfismos e fenótipos CYP (Refs. 33). Tamanho, revestimento de superfície e formação de PC afetaram significativamente os níveis de metabólitos (p < 0,0001). AuNPs PEG-PC, por exemplo, ativaram a produção de AD no doador HDC3 independentemente do tamanho.

Conclusões

AuNPs, particularmente partículas nuas de 40 e 80 nm, inibem a hidroxilação da TST e podem estimular a desalquilação em HLM agrupados. A presença de uma PC biologicamente relevante mitiga esses efeitos, especialmente para AuNPs BPEI catiônicas. Em HLM de doador único, os efeitos das AuNPs dependem da química de superfície e variam com a atividade CYP individual, ressaltando o potencial das AuNPs como disruptores endócrinos. Esses resultados fornecem uma estrutura para avaliar o impacto de outros nanomateriais no metabolismo de hormônios esteroides e identificar subpopulações vulneráveis.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo e em seu arquivo de informações suplementares.

Abreviações

11β-OH TST

11β-hidroxitestosterona

15β-OH TST

5β-hidroxitestosterona

16α-OH TST

16α-hidroxitestosterona

16β-OH TST

16β-hidroxitestosterona

2α-OH TST

2α-hidroxitestosterona

2β-OH TST

2β-hidroxitestosterona

6α-OH TST

6α-hidroxitestosterona

6β-OH TST

6β-hidroxitestosterona

AD

Androstenediona

AgNP

Nanopartículas de prata

ANOVA

Análise de variância de uma via

AuNP

Nanopartículas de ouro

BPEI

Polietilenimina ramificada

CFS

Clorpirifós

CYP

Citocromo P450

DEET

Dietiltoluamida

D_H

Diâmetro hidrodinâmico

DI

Água desionizada

DLS

Espalhamento dinâmico de luz

EC₅₀

Concentração de ativação máxima metade

EDC/NHS

1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida/N-hidroxisuccinimida

ESI⁺

Eletrospray positivo

HLM

Microssomos hepáticos humanos

HSD

Diferença honestamente significativa de Tukey

IC₅₀

Concentração inibitória máxima metade

ISTD

Padrão interno

LA

Ácido lipoico

LC-MS/MS

Cromatografia líquida-espectrometria de massas

LOD

Limite de detecção

LOQ

Limite de quantificação

MRM

Monitoramento de múltiplas reações

NADP

Fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido

NADPH

NADP reduzido

naked

Sem PC

NP

Nanopartícula

PBS

Salina fosfatada tamponada

PC

Coroa proteica do plasma humano

PDI

Índice de polidispersidade

PEG

Polietileno glicol

pHLM

Microssomos hepáticos humanos agrupados

QC

Controle de qualidade

SWCNT

Nanotubo de carbono de parede única

TEM

Microscopia eletrônica de transmissão

TFF

Filtração por fluxo tangencial

TiO₂

Dióxido de titânio

TST

Testosterona

UPLC TQD

Sistema de cromatografia líquida de ultra performance com detector de quádruplo triplo