Nanobiossensor de ouro com base na ressonância de plasma de superfície localizada é capaz de diagnosticar a brucelose humana, apresentando um método rápido e acessível

Resumo

A brucelose é considerada a zoonose bacteriana mais comum do mundo. Embora os resultados laboratoriais sejam os diagnósticos mais confiáveis ​​hoje, os métodos laboratoriais atuais têm muitas limitações. Esta pesquisa teve como objetivo projetar e avaliar o desempenho de uma nova técnica baseada na ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) para eliminar ou reduzir as deficiências existentes. Para este propósito, lipopolissacarídeos lisos foram extraídos de Brucella melitensis e Brucella abortus e fixados na superfície das nanopartículas de ouro por meio de interações covalentes. Após alguns processos de otimização, o espalhamento de luz dinâmico foi usado para caracterizar a sonda. A detecção do anticorpo anti-Brucella capturado foi realizada medindo o redshift no pico LSPR seguido pela determinação do valor de corte, que indicou uma diferença significativa entre controles e pacientes verdadeiramente positivos ( P valor <0,01). Além disso, 40 soros de amostras negativas verdadeiras e pacientes positivos foram usados ​​para avaliar o desempenho deste método, comparando seus resultados com o padrão ouro (cultura), teste de aglutinação em tubo padrão e níveis de IgM e IgG anti-brucelose (ELISA). A sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo mostraram um desempenho adequado do método baseado em LSPR (85%, 100%, 100% e 86%, respectivamente). Os resultados da pesquisa atual fornecem um método promissor rápido, conveniente e barato para detectar os anticorpos anti-Brucella em soros humanos, que pode ser amplamente utilizado em laboratórios médicos para diagnosticar a brucelose de forma rápida e eficaz.

Introdução

Brucellae são cocobacilos Gram-negativos de crescimento lento pertencentes à família Brucellaceae [1]. Brucellae inclui bactérias intracelulares facultativas que infectam uma variedade de animais domésticos e selvagens [2]. A descoberta de novos tipos de brucelas nos últimos anos expandiu muito o gênero. Existem atualmente doze espécies do gênero, quatro das quais incluem Brucella. melitensis , B. aborto , B. suis , e B. canis são as principais causas da doença em humanos [3]. B. melitensis é considerada a espécie mais virulenta em humanos [3]. Embora a brucelose não cause a morte de pessoas e seja apenas um caso excepcional de transmissão de pessoa para pessoa, a epidemia constante de brucelose humana em todo o mundo leva a sérios problemas de saúde pública e danos econômicos devido à perda de produtividade dos animais. É importante ressaltar que o potencial de enfraquecimento da brucelose em humanos e o protocolo de tratamento complicado da doença tornaram essas bactérias candidatos a agentes da guerra biológica [4, 5].

A brucelose em humanos é rotulada como a "doença dos erros" [6] porque sua apresentação clínica é inespecífica e se sobrepõe a um amplo espectro de outras doenças; portanto, a corroboração laboratorial do diagnóstico é essencial para o correto tratamento de um paciente [7, 8]. Embora a cultura, os testes sorológicos e os testes de amplificação de ácido nucleico possam fazer o diagnóstico de brucelose, esses métodos têm muitas limitações. Na cultura, como padrão-ouro, a principal limitação que retarda o diagnóstico e o tratamento adequados do paciente é o longo tempo de incubação. Sistemas de hemocultura automatizados avançados (por exemplo, sistemas Bactec e BacTAlert) podem detectar casos agudos de brucelose, mas requerem 5 a 7 dias de incubação, e mesmo a incubação e o desempenho de subculturas cegas para amostras prolongadas precisam ser estendidos [9]. A falta de especificidade e resultados falsos positivos, especialmente em indivíduos repetidamente expostos a organismos Brucella, são as principais limitações em relação aos testes serológicos [9, 10]. Embora tenham excelente sensibilidade, especificidade, segurança e diagnóstico rápido da doença por ensaios de amplificação de ácido nucleico, a importância clínica desses métodos e suas implicações terapêuticas limitadas não são claras devido à perseverança de longo prazo de resultados de testes biomoleculares positivos em pacientes que se recuperaram completamente [9, 11]. Portanto, é necessário projetar um método que possa superar todas as limitações do teste mencionadas acima e, ao mesmo tempo, potencializar suas vantagens.

O aprimoramento de dispositivos de biossensor com limites de detecção baixos se tornou um componente importante das pesquisas de detecção de biomarcadores porque, na última década, um grande número de estudos foi dedicado a encontrar procedimentos apropriados para melhorar a sensibilidade de diferentes plataformas de detecção em biossensor [12, 13] . Os biossensores são usados ​​para detectar e quantificar de um analito, gerando um sinal de interações que incluem componentes biológicos. Recentemente, o aumento da sensibilidade dos transdutores ópticos combinada com a incomparável especificidade das interações biomoleculares levaram ao desenvolvimento de muitos biossensores ópticos diferentes [14]. Devido à facilidade de aplicação, sensibilidade à baixa temperatura e geração de sinal confiável, conforme evidenciado por um redshift na banda de absorção em resposta a interações biológicas, os testes que são baseados nas propriedades ópticas únicas de nanopartículas são econômicas para detectar marcadores biológicos [ 15,16,17]. Esses métodos de detecção usam as características biofísicas de moléculas como peso molecular, carga e índice de refração para monitorar a atividade de uma molécula específica. A ressonância de plasmon de superfície é um fenômeno causado pela oscilação coletiva de elétrons de superfície após a exposição à luz incidente que tem sido usada para detectar biomoléculas ligadas à superfície de forma rápida e fácil [18, 19]. SPR consiste em dois métodos principais, localizado (LSPR) ou propagador (PSPR) [20, 21]. Entre eles, biossensores ópticos baseados em plasmon de superfície localizada desenvolveram-se notavelmente devido ao seu potencial de aplicação significativo [12, 22]. Esta técnica vem da interação entre elétrons de superfície de nanopartículas condutoras, que são mais curtas que o comprimento de onda da luz incidente, e a onda de luz que ocorre quando na banda de condução a luz incidente interage com elétrons de superfície [23, 24]. Em comparação com outras plataformas semelhantes, os biossensores baseados em ressonância de plasmon de superfície localizada têm várias vantagens (por exemplo, ressonância de plasmon de superfície), como ter um comprimento de decaimento de campo eletromagnético mais curto, sendo insensíveis a alterações do índice de refração em massa causadas por variações de temperatura ou os componentes do meio circundante e capacidade de ser excitado pela propagação livre da luz [12]. Portanto, na tecnologia de nanobiossensores, os nanobiossensores baseados em LSPR são considerados uma das ferramentas mais poderosas para a detecção de biomoléculas.

Em suma, por um lado, as estratégias laboratoriais ainda são a principal base para o diagnóstico da brucelose. Por outro lado, os métodos clínicos atuais enfrentam muitas limitações. Portanto, propor um novo método alternativo que possa superar as deficiências das técnicas existentes é considerado um dos principais componentes dos protocolos de tratamento. Portanto, este estudo teve como objetivo introduzir um nanobiossensor baseado em LSPR rápido, conveniente, barato, seguro e sensível para detectar anticorpos anti-Brucella em amostras biológicas para o diagnóstico de brucelose. Para este propósito, os lipopolissacarídeos (LPS) de B. melitensis e B. abortus foram revestidos em nanopartículas de ouro (GNPs) e a especificidade, sensibilidade, valor preditivo positivo (PPV) e valor preditivo negativo (NPV) da técnica foram avaliados comparando os resultados obtidos com o ensaio de cultura de soro. Além disso, o estudo atual realizou um ensaio de imunoabsorção enzimática para medir os anticorpos anti-Brucellae (IgM e IgG) e o teste de aglutinação em tubo padrão para avaliar a capacidade da tecnologia atualmente projetada para detectar a brucelose, em oposição aos métodos convencionais.

Métodos

Cultura bacteriana e extração de LPS

As cepas suaves de B. melitensis e B. aborto foram cultivados em Luria – Bertani [3] ágar. Na próxima etapa, as bactérias foram colhidas e os LPS foram extraídos usando um método modificado de água com fenol quente [25]. Para confirmar a qualidade do LPS extraído, foi aplicada eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) com coloração com nitrato de prata. A quantificação de LPS foi realizada usando 1,9-dimetil metileno azul (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) usando Salmonella typhimurium como um padrão. Para avaliar a contaminação por proteínas e ácidos nucléicos, foi utilizado o método de Bradford e absorbância a 260 nm.

Síntese de nanopartículas esféricas de ouro

Uma redução química do sal de ouro (HAuCl ₄ ) foi usado para sintetizar as nanopartículas de ouro, que é um procedimento de síntese rápido, barato e verde para nanopartículas de Au em temperatura ambiente [26]. De acordo com o método descrito, 15 mg de citrato de sódio (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) foram dissolvidos em 50 ml de água destilada deionizada e mantidos em banho de gelo e misturados em agitador magnético (150 RPM) . Ao mesmo tempo, foram adicionados 600 µl de solução de sal de ouro (17,3 mM). Posteriormente, foi adicionado 1,2 ml de solução de boro-hidreto de sódio (20 mM). A solução foi misturada durante 2 h sob condições semelhantes e então mantida a 4 ° C para aplicação posterior. De acordo com estudos anteriores, neste tipo de síntese, o citrato de sódio atua simultaneamente como um agente redutor (conduzindo a redução de AuIII para Au0), agente de capeamento (estabilizando eletrostaticamente a solução coloidal de nanopartículas de ouro) e mediador de pH (modificando a reatividade do Au espécies envolvidas na reação). Neste ensaio, a produção de uma solução de cor vermelha a partir de uma solução de HAuCl4 de cor amarela mostra a formação de ouro em um estado de oxidação zero.

A microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi usada para estudar a morfologia das nanopartículas de ouro e o Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, Reino Unido) foi usado para avaliar a distribuição de tamanho. O espalhamento dinâmico de luz (DLS), em um ângulo de espalhamento de 90º, foi usado como o princípio básico para medir o tamanho das partículas. O Zetasizer Nano usou um laser com comprimento de onda de 633 nm. Com esta técnica, a propagação de partículas causada pelo movimento browniano é medida e convertida em distribuição de tamanho pela relação de Stokes-Einstein [27]. O potencial zeta também foi aplicado para determinar a carga elétrica superficial das nanopartículas. Os espectros de absorção das nanopartículas foram registrados por um espectrofotômetro Cary 500 UVeviseNIR (ultravioleta-visível próximo ao infravermelho) (Varian, Austrália).

Construção de Nanossonda (Biossensor)

Carboxilação de nanopartículas de ouro

Nanopartículas de ouro foram revestidas com ligantes de ácido tioglicólico para preparar a superfície de GNPs para carregar LPS. Resumindo, 1 ml de solução de TGA (1 mM) foi misturado com 1 ml de solução de nanopartículas de ouro e mantido em temperatura ambiente por 24 h. Para o isolamento das nanopartículas de ouro revestidas, a solução foi centrifugada a 12.000 g por 15 min. Em seguida, duas etapas de lavagem com água desionizada duplamente destilada foram utilizadas para remover o excesso de TGA. Finalmente, a espectrofotometria foi usada para avaliar o revestimento de ácido tioglicólico na superfície dos GNPs.

Otimizando o revestimento de ácido tioglicólico em nanopartículas de ouro

O revestimento de TGA foi feito em tempos diferentes, incluindo 12, 18, 24, 36 e 48 h para otimizar a proporção de revestimento de TGA em nanopartículas de ouro. Posteriormente, a densidade óptica foi medida e representada graficamente para obter o melhor tempo de incubação.

Anexo covalente de LPS a nanopartículas de ouro modificadas por TGA

Para estimular a ligação covalente entre o grupo carboxila do TGA e o grupo amina do LPS, os grupos carboxila foram ativados por EDC (o reticulador de comprimento zero mais popular para conjugações bioquímicas) e moléculas de N-hidroxisuccinimida (NHS) [28]. Nanopartículas de ouro sedimentadas foram suspensas em solução 0,1 mM de EDC / NHS e incubadas por 30 min em temperatura ambiente. No passo seguinte, foram adicionados 2 ml de solução salina tampão de fosfato (PBS) contendo Tween-20 a 0,05% (PBST) (pH 7,4). Após um vórtice vigoroso, as nanopartículas foram centrifugadas a 12.000 RPM por 15 min. Após centrifugação, a solução de LPS foi adicionada após a remoção do sobrenadante. Posteriormente, a mistura foi incubada em banho de ultrassom por 10 min seguido de 3 h de incubação em temperatura ambiente. Depois disso, 2 mL de PBST foram adicionados e agitados vigorosamente em vórtice seguido por centrifugação por 15 min a 12.000 RPM, e o sobrenadante foi removido. Finalmente, as nanossondas foram então ressuspensas em 500 µl de PBS e os espectros LSPR foram medidos por espectrofotômetro. Após a confirmação da fixação do LPS às nanopartículas de ouro, a solução foi mantida a 4 ° C para estudos posteriores. A Figura 1 mostra as equações de interação química, a síntese de nanopartículas de ouro modificadas por TGA e a fixação de LPS.

Interações químicas de fixação de LPS às nanopartículas de ouro. A Molécula TGA, B Interação EDC + NHS e C Fixação covalente de LPS a nanopartículas de ouro modificadas por TGA. Número 1:nanopartículas; número 2:LPS

Otimizando a concentração de LPS

Para maximizar a ligação de LPS a grupos de carboxila TGA ativados, a otimização da proporção de nanopartículas de LPS para Au foi realizada avaliando o deslocamento de pico nos espectros LSPR como uma função das concentrações de LPS (100, 150, 200, 300 e 560 µg / ml) em uma quantidade fixa de nanopartículas de Au.

Detecção de anticorpos anti-LPS por nanossonda

100 µl das amostras diluídas (1:50 em PBS) foram misturados com 200 µl do biossensor e misturados por pipetagem. Na etapa seguinte, os biossensores foram centrifugados a 12.000 g por 15 min após 30 min de incubação em temperatura ambiente. Finalmente, os biossensores foram suspensos em 200 µl de PBS, e a absorbância foi medida conforme descrito anteriormente. Para validar a função do nanobiossensor, controles positivos e negativos também foram fornecidos a partir de um kit ELISA disponível comercialmente (Pishtazteb Zaman, Irã).

Declaração de Ética

O uso de soros humanos foi aprovado pelos Comitês de Ética da Fasa University of Medical Sciences da Fasa, Irã (IR.FUMS.1396.324). As identidades dos doadores de soro foram codificadas e não reveladas a ninguém envolvido neste estudo. Além disso, todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes éticas de acordo com as regulamentações nacionais. Além disso, todas as amostras eram de indivíduos que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

Avaliação da função do método projetado

Quarenta amostras contendo 20 casos (verdadeiros positivos) e 20 controles (verdadeiros negativos) foram fornecidas para avaliar a funcionalidade do método projetado. Por esse motivo, o desempenho do método desenhado no presente estudo foi comparado com os resultados da cultura. Além disso, kits comerciais disponíveis (Pishtaz Teb, Teerã, Irã) foram usados ​​para avaliar os níveis séricos de anticorpos IgM e IgG. O preparo da amostra e a avaliação dos anticorpos foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante (Especificidade:99,85%, Sensibilidade:99,4%). Além disso, o teste de aglutinação em tubo padrão foi realizado em todas as amostras de soro para comparar e validar o desempenho do método baseado em LSPR. Para avaliar o desempenho do método projetado, os resultados obtidos do método baseado em LSPR foram comparados com os testes convencionais mencionados com o cálculo de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo com base na fórmula comum como segue:
$$ \ begin {align} {\ text {Sensitivity}} &=\ frac {{{\ text {Number}} \, {\ text {of}} \, {\ text {True}} \, {\ text {Positivos}}}} {{{\ text {Número}} \, {\ text {of}} \, {\ text {True}} \, {\ text {Positivos}} \, + \, {\ text {Número}} \, {\ text {of}} \, {\ text {False}} \, {\ text {Negativos}}}} \\ {\ text {Especificidade}} &=\ frac {{{\ text {Number}} \, {\ text {of}} \, {\ text {True}} \, {\ text {Negativos}}}} {{{\ text {Number}} \, {\ text {of }} \, {\ text {Verdadeiro}} \, {\ text {Negativos}} \, + {\ text {Número}} \, {\ text {de}} \, {\ text {False}} \, {\ text {Positivos}}}} \\ {\ text {PPV}} &=\ frac {{{\ text {Number}} \, {\ text {of}} \, {\ text {True}} \ , {\ text {Positivos}}}} {{{\ text {Número}} \, {\ text {of}} \, {\ text {Verdadeiro}} \, {\ text {Positivos}} \, + \ , {\ text {Número}} \, {\ text {de}} \, {\ text {Falso}} \, {\ text {Positivos}}}} \\ {\ text {NPV}} &=\ frac {{{\ text {Número}} \, {\ text {of}} \, {\ text {Verdadeiro}} \, {\ text {Negativos}}}} {{{\ text {Número}} \, { \ text {of}} \, {\ text {True}} \, {\ text {Negativos}} \, + \, {\ text {Número}} \, {\ text {of}} \, {\ text {Falso}} \, {\ text {Negativos}}}} \\ \ end {alinhados} $$

Análise estatística

Este estudo foi analisado como um experimento de desempenho diagnóstico clássico avaliando a concordância de um teste proposto, o LSPR-nanossensor e um teste padrão de referência, a cultura e alguns testes convencionais, incluindo ELISA e SAT para determinar sua capacidade de identificar uma condição alvo . Os valores de corte foram calculados pela média dos soros controles (verdadeiro negativo) mais valores de desvio padrão de duas vezes (2SD). O teste de Kolmogorov ‐ Smirnov foi realizado para determinar a normalidade e avaliar a distribuição dos dados. Com base nos resultados de normalidade, que revelaram a distribuição paramétrica, o teste ANOVA foi utilizado para comparar os grupos. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism para Windows versão 8 e SPSS para Windows versão 9.

Resultados

Análise de extração de lipopolissacarídeos

O SDS-PAGE mostrou que o rendimento da extração de LPS foi de aproximadamente 1 por cento do peso úmido da bactéria usada. Além disso, a concentração de ácido nucleico foi ≤ 0,2% da concentração de LPS. É importante ressaltar que o método de Bradford demonstrou a ausência de qualquer contaminação de proteína.

Caracterização de nanopartículas de ouro

A distribuição de tamanho das nanopartículas determina a qualidade de um biossensor. De acordo com os estudos anteriores, as nanopartículas devem possuir um tamanho específico. A este respeito, o tamanho apropriadamente pequeno das nanopartículas resulta em estabilidade coloidal adequada, altas razões de superfície para volume e movimento rápido para altas taxas de ligação resulta em alta afinidade, alta sensibilidade e alta seletividade em interação com alvos biológicos. Além disso, as nanopartículas devem ser o maior possível para permitir a presença de vários ligantes na superfície da partícula e também obter interações multivalentes [29,30,31]. Como Gu et al. relataram, a comparabilidade do tamanho das nanopartículas com o tamanho dos alvos biológicos é particularmente importante na interação de proteínas [32]. De acordo com o tamanho dos anticorpos anti-Brucella, que é de 2–5 nm [33], este estudo preparou nanopartículas de ouro com um tamanho médio de 10 nm e realizou a determinação da distribuição do tamanho das nanopartículas por um instrumento Zetasizer NanoZS90, que usa um laser com comprimento de onda de 633 nm. Esta técnica se beneficia da equação de Stokes-Einstein, que pode converter a difusão de partículas, causada pelo movimento browniano, em uma distribuição de tamanho. De acordo com a Figura 2, os PNBs foram distribuídos uniformemente na escala de 10 nm. Os valores do potencial Zeta revelaram detalhes sobre a carga superficial e a estabilidade dos GNPs. As partículas tinham carga negativa e seu potencial zeta era de aproximadamente - 28 mV. Além disso, a Tabela 1 mostra o comprimento de onda de absorbância máxima dos GNPs. Os comprimentos de onda visual e ultravioleta foram medidos por espectrofotômetro e a absorbância máxima foi de 530 nm. Usamos o método de Turkevich para produzir nanopartículas de ouro. As vantagens deste método é a produção de nanopartículas de ouro, incluindo processo de produção fácil e barato, capacidade de controlar o tamanho das nanopartículas e estabilidade coloidal adequada [34].

Estrutura de nanopartículas de ouro em MEV. A distribuição igual de nanopartículas de ouro é bem refletida na figura

Caracterização da Nano-bio-Probe

Como mencionado acima, este estudo usou moléculas de TGA para conectar as nanopartículas de ouro com LPS, resultando em uma ligeira diminuição de 4,55% no pico LSPR em 530 nm. Além disso, o presente estudo realizou vários tempos de incubação para determinar a aderência máxima do TGA às nanopartículas de ouro. De acordo com os resultados apresentados na Fig. 3, 24 h de incubação de TGA com GNPs resultou no revestimento máximo de TGA na superfície das nanopartículas de ouro.

Otimizando o revestimento de ácido tioglicólico em nanopartículas de ouro. Como a figura revela, não há alteração significativa na absorbância após 24 h de incubação, apesar do alongamento do tempo adjacente. Portanto, 24 horas foi selecionado como o tempo otimizado para o revestimento de ácido tioglicólico em PNB. O Y -eixo mostra a intensidade de absorbância em 530 nm (absorbância máxima de nanopartículas). Os experimentos foram feitos em triplicata. Os dados são apresentados como média ± SEM. a.u .:Unidade de absorção

Em relação à determinação da concentração otimizada de LPS, o presente estudo investigou concentrações incluindo 100, 150, 200, 300 e 560 ug / ml. Conforme mostrado na Fig. 4, conforme a concentração aumentou, a absorbância diminui. De acordo com os resultados, o presente estudo selecionou uma concentração de 300 ug / ml de LPS para revestir a superfície de GNPs modificados por TGA, porque não houve qualquer diminuição notável na intensidade do pico de absorção com o aumento da concentração de LPS.

Otimizando a concentração de LPS. À medida que a concentração de LPS aumentou, a absorvância diminuiu significativamente. No entanto, após o incremento nas concentrações de LPS de mais de 300 mg / ml, não houve redução significativa na absorbância de LSPR. Assim, a concentração mencionada foi selecionada como a concentração otimizada. O Y -eixo mostra a intensidade de absorbância em 530 nm (absorbância máxima de nanopartículas). Os experimentos foram feitos em triplicata. Os dados são apresentados como média ± SEM. a.u .:Unidade de absorção

Avaliação das funções Nano-bio-Probe

Como a técnica LSPR é um método óptico sensível à superfície, ela pode detectar a interação entre anticorpos anti-LPS e antígenos na superfície das nanopartículas de ouro por meio da imagem de alterações no pico de absorção LSPR que é causado pela interação eletrostática entre o anticorpo e antígeno. Para confirmar o funcionamento correto do biossensor, este estudo preparou controle positivo composto por anticorpos anti-Brucella LPS com título de 1:80 e controle negativo, e registrou o espectro LSPR do biossensor após incubação com os controles. Conforme mostrado na Fig. 5, a incubação com controle negativo não afetou a absorbância de LSPR. No entanto, a incubação com controle positivo causou uma mudança na absorbância máxima de LSPR, que era anteriormente conhecida como redshift. Portanto, a ligação de anticorpos anti-Brucella aos antígenos LPS limita a incidência de luz que atinge a superfície das nanossondas.

Pico da nanossonda LSPR na presença de controles positivos e negativos. Os controles foram fornecidos a partir de kits ELISA disponíveis comercialmente

Determinando o valor de corte

Para este propósito, este estudo obteve 40 soros de verdadeiros indivíduos positivos e negativos com base na cultura e observações clínicas. Como mostrado na Fig. 6, o desvio para o vermelho médio em amostras negativas verdadeiras (controles) foi de 1,70 nm, o que foi significativamente diferente dos pacientes positivos verdadeiros ( P valor <0,001). Além disso, os resultados indicaram que o desvio para o vermelho de 4,38 nm deve ser usado como valor de corte. Curiosamente, apenas 5% dos controles tiveram um desvio para o vermelho acima do valor de corte, e o desvio para o vermelho em todos os pacientes estava acima do valor de corte, indicando que o desempenho do método é aceitável e a determinação do valor de corte é confiável.

O desvio para o vermelho do pico LSPR no soro de pacientes verdadeiros e indivíduos de controle. Após a interação entre os anticorpos, que se apresentaram no soro dos indivíduos infectados, ocorreu um redshift que foi significativamente diferente quando comparado aos controles. Além disso, a figura demonstra os valores de DP e 2SD preciosos para a definição do ponto de corte. Os experimentos foram feitos em triplicata para cada amostra. P valor <0,05 foi considerado significativo

Validação da função do biossensor

Nas etapas anteriores, este estudo apresentou um método rápido e barato para identificar anticorpos anti-Brucella nas amostras. No entanto, é necessário verificar a funcionalidade de um novo método. Para tanto, este estudo conduziu uma série de subestudos incluindo teste de aglutinação em tubo padrão, níveis de anti-IgG e anti-IgM no soro de amostras negativas e positivas com base nos resultados da cultura. Conforme mostrado na Tabela 2, a sensibilidade do método atual foi menor do que a do SAT sozinho. É importante ressaltar que a especificidade do método baseado em LSPR mostrou o resultado mais aceitável que foi 100%. Semelhante à especificidade, o valor preditivo positivo do método atual foi maior do que outros testes convencionais (100%). Em última análise, o NPV dos métodos baseados em SAT, IgG, IgM e LSPR foram 90%, 90%, 81% e 86%, respectivamente.

Discussão

A brucelose é provavelmente considerada a primeira infecção humana após a domesticação de bovinos, ovinos e caprinos [35]. A brucelose é a zoonose bacteriana mais prevalente no mundo, com 500.000 novos casos humanos da doença diagnosticados globalmente a cada ano [9, 36]. Os sintomas da brucelose humana não são patognomônicos porque a infecção pode afetar qualquer órgão do corpo [37]. Embora os achados laboratoriais ainda sejam um fator confiável na detecção da doença, as estratégias atuais, incluindo cultura, sorologia e testes de amplificação de ácido nucléico, mostraram falhas graves [9, 38,39,40]. Portanto, este estudo tenta introduzir um novo método diagnóstico baseado em LSPR para remover as limitações.

Nos últimos anos, a ressonância de plasmon de superfície localizada tem sido usada como base para o desenvolvimento de biossensores. As vantagens das pesquisas atuais com nanopartículas de ouro e os avanços da nanotecnologia têm sido consideradas os principais fatores para melhorar o desempenho diagnóstico. A cor única e as propriedades ópticas dos GNPs, devido aos seus efeitos plasmônicos e ajustáveis, são duas características excelentes e benéficas dessas partículas em comparação com outras partículas [12, 41].

Neste estudo, um desvio para o vermelho no pico LSPR foi usado como um indicador de interação entre antígenos LPS e anticorpos anti-Brucella. Por outras palavras, em comparação com as amostras de controlo, a presença de anticorpos no soro das amostras de caso causou um desvio para o vermelho significativo do pico de absorção LSPR que pode ser assumido como um indicador de brucelose. Embora haja uma diferença significativa no redshift entre as amostras de controle e caso, essa diferença não pode quantificar a concentração de anticorpos no soro, o que pode ser considerado uma das sérias limitações desse método. No entanto, devemos lembrar que alguns métodos comuns, como estratégias relacionadas ao ELISA, são geralmente considerados como um ponto de corte [42, 43].

É importante ressaltar que este estudo validou o desempenho da técnica baseada em LSPR, comparando os resultados obtidos com outros métodos atuais, avaliando vários parâmetros. O primeiro parâmetro analisado foi a sensibilidade que determina a probabilidade de um teste de brucelose positivo em um paciente [44]. Como Yagupsky et al. discutiram [9], a sensibilidade da hemocultura, que é considerada o padrão-ouro atual, é reduzida especialmente em doenças crônicas e infecções focais. Além disso, este método também enfrentou outras limitações graves, como problemas de segurança laboratorial, o crescimento lento de bactérias, e um resultado positivo é uma evidência indiscutível da doença [45, 46]. Esta técnica baseada em LSPR representou um resultado confiável e competitivo em comparação com os métodos convencionais em sensibilidade, como cultura, SAT e kits dependentes de ELISA. Ao mesmo tempo, foi avaliada a especificidade, que é a probabilidade de um teste negativo se o paciente não estiver infectado [45, 47]. Como os resultados mostraram, em comparação com a outra estratégia diagnóstica, a técnica baseada em LSPR projetada teve o resultado mais significativo em termos de especificidade. É uma característica importante desse método porque os estudos anteriores questionaram a validade e a especificidade dos métodos sorodiagnósticos da brucelose humana, uma vez que episódios assintomáticos e autolimitados dessa infecção ocorrem em áreas de endemicidade de zoonoses [48,49,50]. No entanto, como os métodos relacionados a anticorpos, o método atual resiste à possível persistência de longo prazo de anticorpos anti-Brucella no soro, mesmo após a recuperação completa da brucelose.

Semelhante a estudos anteriores, o valor preditivo positivo foi definido como a razão entre os resultados positivos verdadeiros e a soma de todos os resultados positivos [51]. Da mesma forma, o NPV foi descrito como a razão dos resultados negativos verdadeiros para a soma de todos os resultados negativos [51]. Em comparação com as estratégias de diagnóstico convencionais, o método atual projetado representou os resultados de PPV mais maravilhosos, demonstrando sua capacidade de distinguir entre indivíduos infectados e não infectados. Além disso, a avaliação dos resultados do NPV revelou o potencial promissor do método baseado em LSPR para excluir não pacientes de pacientes reais.

Conclusão

Este estudo apresentou um método rápido, simples, de baixo custo, confiável e econômico para o diagnóstico da brucelose. Embora existam algumas limitações menores, incluindo os resultados qualitativos e a possibilidade de ser positivo em indivíduos recuperados, as vantagens discutidas mostram que ele tem boas capacidades em comparação com os procedimentos diagnósticos laboratoriais atuais.

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados usados ​​e / ou analisados ​​durante o estudo atual estão disponíveis junto ao autor correspondente, mediante solicitação razoável.

Abreviações

LPS:

Lipopolissacarídeos

GNPs:

Nanopartículas de ouro

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

LSPR:

Ressonância de plasmon de superfície localizada

SAT:

Teste de aglutinação em tubo padrão

ELISA:

Ensaio de imunoabsorção enzimática

PPV:

Valor preditivo positivo

NPV:

Valor preditivo negativo

PSPR:

Ressonância de plasma de superfície de propagação

SDS-PAGE:

Eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

TGA:

Ácido tioglicólico

NHS:

N-hidroxisuccinimida

EDC:

N - (3-dimetilaminopropil) - N Cloridrato de ′-etilcarbodiimida

PBS:

Solução salina tampão de fosfato

Emissão multicolor da estrutura ultravioleta de nanopiramida quasicristal fotônica baseada em GaN com InxGa1 semipolar − xN / GaN vários poços quânticos Análise de Actina e Organização de Adesão Focal em Células U2OS em Nanoestruturas Poliméricas