Síntese rápida e verde em uma etapa de nanopartículas de ouro multifuncionais para terapia e imagens direcionadas a tumores

Resumo

Nanopartículas de ouro (GNPs) sempre foram usadas como vetores de transporte de doxorrubicina (DOX) para diagnóstico e terapia de tumor; no entanto, o processo de síntese desses vetores é preparar GNPs através do método de redução química em primeiro lugar, seguido pela conjugação com DOX ou peptídeos específicos, portanto, esses métodos enfrentaram alguns problemas comuns, incluindo etapas múltiplas, alto custo, demorado, preparação complicada e pós-processamento. Aqui, apresentamos uma estratégia de uma etapa para preparar os GNPs conjugados com DOX com base na constituição química do DOX pela primeira vez. Além disso, preparamos um GNPs multifuncional (DRN-GNPs) com um método de uma etapa com o auxílio dos grupos funcionais redutivos possuídos por DOX, peptídeos RGD e peptídeos de localização nuclear (NLS), que só precisa de 30 min. Os resultados de imagens de dispersão e estudos de células TEM indicaram que os DRN-GNPs podem ter como alvo o núcleo das células Hela. As taxas de inibição tumoral de DRN-GNPs via tumor e injeção na veia da cauda de camundongos nus foram de 66,7% e 57,7%, respectivamente, que foram significativamente aumentadas em comparação com os grupos de controle. A síntese de uma etapa de PNB multifuncionais não só economiza tempo e materiais, mas também está em linha com a direção de desenvolvimento da química verde e estabeleceria a base para aplicações em grande escala em um futuro próximo. Nossos resultados sugeriram que a estratégia de fabricação é eficiente, e nossos GNPs DRN preparados possuem boa estabilidade coloidal no sistema fisiológico; eles são um agente de contraste potencial e um vetor de transporte DOX eficiente para o diagnóstico e terapia do câncer cervical.

Introdução

A doxorrubicina (DOX) é uma droga anticâncer comumente usada que tem sido amplamente utilizada em uma variedade de quimioterapia do câncer, como tumor maligno do sangue [1], uma variedade de adenocarcinoma [2,3,4,5], sarcoma de tecidos moles [6 ], e assim por diante. No entanto, a longo prazo e altas dosagens de DOX levarão à resistência aos medicamentos [7], náuseas [8], queda de cabelo [9] e toxicidade aguda e crônica [10], o que pode levar à insuficiência cardíaca congestiva [11]. Portanto, é muito necessário desenvolver um carreador de fármaco com boa biocompatibilidade e alta capacidade de carga de fármaco. Nos últimos anos, muitos nanomateriais, como pontos quânticos [12, 13], quitosana [14, 15] nanomateriais de silício [16, 17], nanomateriais poliméricos [18,19,20], nanopartículas fluorescentes [21,22, 23,24] e nanomateriais de metal [25,26,27,28,29,30] foram desenvolvidos como vetores de transporte DOX para diagnóstico e terapia de tumor. Os nanomateriais de ouro têm sido amplamente utilizados devido às suas propriedades químicas e ópticas únicas, baixa toxicidade, boa biocompatibilidade e modificação da superfície da capacidade de controle [31, 32] entre esses nanomateriais. Até agora, existem três tipos de abordagens para a conjugação de DOX em GNPs. O primeiro é conjugar DOX na superfície de GNPs com o auxílio de hidrazina [25], cloridrato de 1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) [26], agente sensível ao pH [27], DCC / Sistema NHS [28]. A segunda é incubar GNPs com DOX por pelo menos 24 h [29]. O terceiro é substituir o citrato conjugado na superfície das nanopartículas de ouro (GNPs) por DOX [30]. Embora esses GNPs conjugados com DOX tenham sido usados ​​na terapia de tumor, a aplicação ainda é limitada devido à falta de especificidade suficiente. Recentemente, o grupo de El-sayed [27] funcionalizou GNPs com DOX, peptídeos RGD e peptídeos de sinal de localização nuclear (NLS). O destaque de seu trabalho é que os GNPs entram nas células tumorais via endocitose mediada por receptor de peptídeos RGD e, em seguida, entram no núcleo com o auxílio de peptídeos NLS, o que faz com que o DOX interfira efetivamente na síntese de DNA. Infelizmente, foram necessários pelo menos 120 horas por acoplamento de peptídeos ou drogas camada por camada nos GNPs, e cada processo precisou de pelo menos 24 horas. Da mesma forma, todos os métodos mencionados acima enfrentaram alguns problemas comuns, como várias etapas, alto custo, preparação complicada e pós-processamento. Portanto, é necessário desenvolver um método simples e rápido para síntese de nanomateriais multifuncionais de ouro.

Neste artigo, apresentamos uma estratégia de uma etapa para preparar os GNPs conjugados com DOX com base na constituição química do DOX pela primeira vez. Além disso, apresentamos um método sintético conveniente para preparar um vetor de transporte DOX multifuncional para fazer o DOX funcionar melhor, que pode ser usado no diagnóstico e na terapia de tumores. A principal diferença entre o nosso trabalho de outros é que usamos DOX, peptídeos RGD e peptídeos NLS como reagentes redutores e reagentes estabilizadores para fabricar os GNPs e fazer com que todas essas três substâncias se conjugem na superfície dos GNPs para formar os GNPs DRN enquanto isso. Nossos trabalhos anteriores [33,34,35] provaram que o RGD e outros peptídeos podem ser usados ​​para reduzir íons de ouro para fabricar nanomateriais de ouro. O N-terminal do NLS pode ser modificado usando a sequência de cisteína cisteína tirosina (CCY) para construir CCYNLS, que pode reduzir os íons de ouro enquanto ainda mantém o efeito de direcionamento do NLS [36]. Também descobrimos que DOX possui dois grupos hidroxila fenólicos com forte redutibilidade sob condição básica [37, 38], portanto, pode reduzir íons de ouro para formar os GNPs também. Além disso, o efeito antitumoral do DOX pode não ser influenciado porque se incorpora ao DNA pelo grupo amino do carbono 7 e pelo grupo hidroxila do carbono 9 [39]. Nesse ínterim, o enxofre, oxigênio e nitrogênio nos peptídeos e DOX podem ser combinados com os GNPs para manter o coloidal estável [33]. Os resultados mostram que os DRN-GNPs foram fabricados com sucesso e funcionaram bem em imagens, diagnóstico e terapia de tumores (Esquema 1). Até onde sabemos, este é o primeiro relatório para a síntese de GNPs multifuncionais conjugados de peptídeos DOX, RGD e NLS com um método de uma etapa e sua aplicação no diagnóstico e terapia de tumores.

Ilustração esquemática da síntese de GNPs DRN, a absorção por células Hela e o diagnóstico de tumor de GNPs DRN

Materiais e métodos

Materiais

HAuCl ₄ 4H ₂ O foi adquirido de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, peptídeos cíclicos RGD (a sequência de aminoácido é arginina-glicina-aspartato-tirosina-ácido glutâmico (c (RGDyE))) e hidróxido de sódio foram os mesmos que a ref. [35]. A doxorrubicina foi adquirida da Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Os peptídeos CCYNLS (a sequência do aminoácido é cisteína-cisteína-tirosina-prolina-prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina, CCYPPKKKRKV) foram fornecidos por China Peptides Co., Ltd (Xangai, China). A linha celular Hela e a linha celular MCF-7 foram fornecidas por Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. Soro fetal bovino (FBS) e meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) foram adquiridos de GibcoBRL Life Technologies. O kit de ensaio de proliferação e citotoxicidade (MTT) foi adquirido de Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.

Síntese de DOX-GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs, DRN-GNPs

Para a preparação de DOX-GNPs, solução de DOX (0,2 mg / mL, 1,0 mL) foi adicionada à solução de ácido cloroáurico (0,86 mM, 1,0 mL) sob agitação magnética e, em seguida, NaOH (2 M, 5 μL) foi adicionado a ajustar o pH. Para a preparação de NLS-GNPs, solução de peptídeos CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) foi adicionada à solução de ácido cloroáurico (3,44 mM, 1,0 mL) sob agitação magnética, então NaOH (2 M, 20 μL) foi adicionado para ajustar o pH . Para a preparação de DR-GNPs, solução DOX (0,2 mg / mL, 1,0 mL) e solução de peptídeos RGD (1,0 mM, 1,0 mL) foram adicionados à solução de ácido cloroáurico (1,72 mM, 2,0 mL) sob agitação magnética, em seguida NaOH (2 M, 15 μL) foi adicionado para ajustar o pH. Para a preparação de DN-GNPs, solução de DOX (0,2 mg / mL, 1,0 mL) e solução de peptídeos CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) foram adicionados à solução de ácido cloroáurico (1,72 mM, 2,0 mL) sob agitação magnética, em seguida NaOH (2 M, 20 μL) foi adicionado para ajustar o pH. Para a preparação de DRN-GNPs, soluções de DOX (0,2 mg / mL, 1,0 mL), peptídeos CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) e peptídeos RGD (1,0 mM, 1,0 mL) foram adicionados à solução de ácido cloroáurico (1,72 mM, 3,0 mL) sob agitação magnética, em seguida, NaOH (2 M, 35 μL) foi adicionado para ajustar o pH. Todas as reações continuaram por 30 min a 100 ° C em um sistema de refluxo e o valor de pH foi de 10-12. Todos os GNPs foram purificados por centrifugação a 55.000 rpm durante 30 min (Optima MAX-TL, Beckman Coulter). Após retirar o sobrenadante, os GNPs foram redispersos em água ultrapura.

Caracterização

As caracterizações dos espectros dos GNPs foram implementadas usando um espectrofotômetro UV 3150 (Shimadzu, Japão), um espectrômetro Nicolet Avatar FTIR modelo 330 (Thermo, América) e uma espectroscopia de fotoelétrons de raios X ESCALab250 (XPS) com as mesmas condições analíticas como ref. [35]. As imagens do microscópio eletrônico de transmissão (TEM) dos GNPs foram obtidas de um TEM (JEM-2100F, JEOL, Japão) operado a uma tensão de aceleração de 200 kV.

Espalhamento dinâmico de luz e medições de potencial Zeta

Um Zeta PALS Zeta Potential Analyzer (Brookhaven Instrument Corporation) foi usado para medir a dispersão de luz dinâmica (DLS) do DOX – GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs, que trabalharam a 90 ° ângulo com um laser de estado sólido (λ =670 nm) à temperatura ambiente. Quando equipado com um eletrodo AQ-827, o analisador foi usado para medir os potenciais zeta dos GNPs.

Análise ICP

A análise quantitativa do Au nos PIBs foi a mesma da ref. [35].

A estabilidade de DR-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs dispersos em PBS, HCl, NaOH, solução de NaCl

Misturamos 100 μL dos GNPs precipitados e 500 μL de alta concentração de 0,2 M de PBS, 0,5 M de HCl, 0,5 M de NaOH e 1,0 M de solução de NaCl, respectivamente. Doze horas depois, tiramos suas fotos e testamos seus espectros de absorção de UV.

Cultura de células

As células Hela e MCF-7 foram cultivadas em uma incubadora (umidificada com 5% de CO ₂ ar equilibrado) a 37 ° C por 24 h. O meio de cultura foi DMEM com 10% de FBS. O número de células vivas é contado por um painel de contagem de células.

Ensaio de citotoxicidade de DOX livre e GNPs DRN

As células Hela e MCF-7 na fase exponencial foram adicionadas aos poços das placas de 96 poços (cerca de 5 × 10 ³ células / poço) e incubados por 24 h, respectivamente. Em seguida, os DRN-GNPs de concentrações 0, 20, 40, 60, 80 e 100 μg / mL (a concentração de DOX correspondente foi de 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2 e 39,0 μg / mL) foram incubados com cada poço e incubado por 24 h a 37 ° C, respectivamente. O grupo controle foi definido pela adição de apenas solução tampão PBS, e sua viabilidade foi definida como 100%. O MTT (20 μL, 5 mg / mL) foi adicionado a cada poço e incubado a 37 ° C por cerca de 4 h. Em seguida, o meio de cultura foi sugado com cuidado e 150 μL de dois dimetilsulfóxidos foram adicionados por poço por 10 min até que o cristal estivesse totalmente dissolvido. Um leitor de microplaca (Thermo Multiskan Mk3) foi usado para medir o valor de OD de cada poço a 490 nm. Três poços para cada grupo foram preparados e os valores calculados foram expressos como média ± D.P.

Experiência de citometria de fluxo

As células Hela e MCF-7 na fase exponencial foram adicionadas a cada poço de duas placas de 12 poços (cerca de 5 × 10 ⁴ células / poço) e incubados por 24 h, respectivamente. Em seguida, a solução DRN-GNPs foi adicionada a cada um dos poços (concentrações finais com 0, 20, 40, 60, 80 e 100 μg / mL) e incubada a 37 ° C por 24 h, respectivamente. Remover o meio de cultura e adicionar a solução de Tripsina (contendo EDTA) aos poços para digerir as células. Em seguida, remover a solução de Tripsina dos poços, adicionar o meio de cultura nos poços e transferir as células para tubos de centrifugação. Após centrifugação a 1000 g por 5 min, o sobrenadante foi removido e as células em cada tubo foram coletadas e contadas em solução de PBS. Cerca de 5–10 × 10 ⁴ das células foram levadas para outros tubos de centrifugação e foram centrifugadas a 1000 g por 5 min novamente. Remover o sobrenadante e adicionar 100 μL de solução tampão de AnexinV aos tubos. Adicionar 5 μL de AnexinV-FITC e 5 μL de iodeto de propídio aos tubos e misturá-los suavemente com as células. Os tubos foram incubados em temperatura ambiente (20–25 ° C) por 15 min no escuro e, em seguida, testados por um citômetro de fluxo (BD Accuri C6).

Imagens ópticas de espalhamento de campo escuro e estudos de microscopia eletrônica de transmissão em cultura de células

As células Hela e MCF-7 foram implantadas na lâmina de cultura de células de 8 orifícios cerca de 7 × 10 ³ células para cada poço, respectivamente. Os DRN-GNPs foram adicionados a cada poço com a concentração final de 35 μg / mL. Após incubação por 24 h, removemos os GNPs fisicamente e livremente absorvidos, lavando essas células com solução de PBS por três vezes. Em seguida, fixamos com paraformaldeído 4% por 20 min, revestidos com algumas gotas de glicerol, e selamos essas lâminas de cultura de células de 8 orifícios com outras lamelas. Um microscópio de campo escuro (Zeiss Imager Z1) foi usado para avaliar as células em aumento de 200 × e modo reflexivo. O tempo de exposição para imagens de campo claro e escuro a uma voltagem de 5 V foi de 1 ms e 400 ms, respectivamente.

Para estudos de TEM, células Hela e MCF-7 foram incubadas com DRN-GNPs (35 μg / mL) por 24 h em um frasco de cultura de células, respectivamente. Após incubar e sugar a solução mista de meio e DRN-GNPs, lavamos as células com solução de PBS por três vezes e depois as digerimos com tripsina. As células foram transferidas para um tubo centrífugo com um pequeno volume do meio DMEM. As células foram centrifugadas (1500 rpm) por 10 min, o meio DMEM foi sugado cuidadosamente e a solução de glutaraldeído a 3% (geralmente 40 vezes o volume dos materiais) foi adicionada cuidadosamente ao tubo para fixar as células no fundo do tubo por mais de 1 h. As células foram fixadas adicionalmente pela adição de tetróxido de ósmio a 1% por 1 h, desidratadas com etanol e, em seguida, incluídas em Spurr (Sigma-Aldrich Co., EUA). As células foram retiradas do tubo, cortadas em seções, coradas com acetato de uranila aquoso e citrato de chumbo e montadas em uma grade de cobre (malha 300). Os espécimes foram medidos usando um microscópio eletrônico de transmissão FEI TECNAI-12 (voltagem de trabalho 120 kV).

Experimentos com animais

Animais

Ratinhos nus fêmeas atímicos foram adquiridos no Animal Experimental Center da Southern Medical University (Guangzhou, China) para r in vivo teste de terapia de tumor. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com as Regras de Manejo Animal do Ministério da Saúde da República Popular da China (Documento NO. 55, 2001) e as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da China Pharmaceutical University.

Eficácia terapêutica de DOX livre e seus conjugados em camundongos com tumor

Resumidamente, 36 camundongos nus (com idades entre 5–6 semanas, pesando 16–18 g) foram divididos aleatoriamente em seis grupos. Eles foram injetados por via subcutânea de células Hela (5 × 10 ⁶ células em PBS) na fossa axilar direita. Cinco dias depois, os camundongos do grupo controle foram injetados pela veia da cauda com solução salina (0,154 mol / L, 0,2 mL). Camundongos de DOX livre, DR-GNPs, DN-GNPs e grupos DRN-GNPs também foram injetados pela veia da cauda. A fim de comparar a eficácia antitumoral dos DRN-GNPs entre a injeção intravenosa e a injeção do tumor, definimos um grupo a ser injetado com quantidade igual de DRN-GNPs no local do tumor. Esses cinco grupos mantiveram uma dose de 0,3 mg / kg equivalente de DOX livre ou conjugado em cada camundongo. Cada rato foi submetido à veia da cauda ou injeção de tumor uma vez por dia. O peso corporal e o volume do tumor de cada camundongo foram monitorados todos os dias durante 14 dias. Para investigar ainda mais os efeitos terapêuticos de DOX, DR-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs, os tumores dos seis grupos foram excisados ​​para análise patológica após 14 dias de tratamento. Os tumores e os órgãos internos do coração, fígado, baço, pulmão e rim dos camundongos foram isolados dos camundongos, fixados com formalina tamponada neutra a 10% e incluídos em parafina. Os tecidos tumorais fatiados foram corados com Hematoxilina e Eosina (H&E) e examinados por microscópio óptico Olympus.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização de DOX-GNPs, NLS-GNPs, DN-GNPs, DR-GNPs, DRN-GNPs

Na síntese de DOX-GNPs, quando a solução de NaOH foi adicionada à solução mista de DOX e solução de ácido cloroáurico, a cor da solução mudou imediatamente de laranja para roxo raso, tornando-se vermelho vinho a 100 ° C em um sistema de refluxo sob agitação magnética em um minuto, indicando a formação dos DOX-GNPs. O resultado indicou que a capacidade de redução de DOX é muito forte porque DOX possui dois grupos hidroxila fenólicos (o carbono nº 6 e nº 11) com forte redutibilidade em condições básicas. A reação continuou por 30 min até que a cor não mudou.

A fim de evitar confundir a cor vermelha laranja do DOX e a cor vinho tinto dos GNPs, apresentamos mais evidências caracterizando seus espectros de absorção de UV (como mostrado na Fig. 1a). DOX tem um pico de absorção característico próximo a 485 nm e um pico a 530 nm; no entanto, o pico em 480 nm desapareceu no espectro da solução do produto e um pico característico em 520 nm de pico de absorção de ressonância plasmônica de superfície característica (SPR) dos GNPs surgiu. Mesmo assim, a formação dos GNPs ainda não está completamente determinada entre os 520 nm dos GNPs e 530 nm do pico da DOX. Levando em consideração que os GNPs serão precipitados com centrifugação em alta velocidade, e as moléculas de DOX não, podemos ver o precipitado roxo no produto do fundo do tubo de centrifugação (inserção da Fig. 1a (3-4)) e DOX do não tem nenhum deles (inserção da Fig. 1a (1-2)).

a Espectros de absorção UV-Visíveis de DOX e do como-preparado DOX – GNPs, a inserção de ( a ) são as imagens de DOX (1, ​​2) e DOX-GNPs (3, 4) antes (1, 3) e após a centrifugação (2, 4). b Imagem TEM de DOX – GNPs. c Espectros de FTIR de DOX e os DOX – GNPs preparados. d Espectro XPS de DOX – GNPs

DOX tem fluorescência vermelha sob a irradiação de luz ultravioleta 365 nm; entretanto, a fluorescência do DOX desapareceu após a síntese dos GNPs. Existem duas razões possíveis; a primeira é que o coeficiente de extinção dos GNPs é muito forte, eles tendem a extinguir a fluorescência das moléculas quando estão localizadas próximas à superfície dos GNPs (<5 nm) [40]. Se a distância aumentar para 20 nm ou mais, o campo de plasmon das nanopartículas está muito longe para extinguir seu sinal de fluorescência [41]. A outra razão é que o grupo fluorescente do DOX foi destruído após desempenhar o papel de agente redutor. Conforme mostrado na Fig. 1c, embora o número do pico de absorção infravermelho do DOX-GNPs seja significativamente menor do que o do DOX, muitas das características do DOX ainda foram mantidas, como os picos de absorção IR característicos a 2.910 cm ⁻¹ (C-H, vibração de estiramento) [42], 1631 cm ⁻¹ (vibração de estiramento de carbonila) [43], 1114 cm ⁻¹ (Vibração de estiramento C-O, C-N) [44] e 867 cm ⁻¹ (N-H, C-H, vibração de flexão fora do plano) [45], respectivamente. Esses picos representativos de DOX também foram exibidos nos espectros do DOX-GNPs, indicando que o DOX foi ligado com sucesso aos DOX-GNPs. Curiosamente, o pico em 1214 cm ⁻¹ pico característico para vibração de estiramento C-O do grupo hidroxila fenólico [46] desapareceu no espectro de DOX-GNPs. O grupo fenólico pode reduzir os íons Au em GNPs e, então, ser transportado para o grupo carbonila. Especulamos que o efeito do DOX não é afetado, porque se incorpora ao DNA pelo grupo amino do carbono 7 e pelo grupo hidroxila do carbono 9 [39].

Podemos observar que o tamanho de partícula do DOX-GNPs é de cerca de 6 nm a partir dos resultados de TEM (Fig. 1b). A proporção calculada de Au (I) foi de 31,93% do espectro XPS do DOX-GNPs (Fig. 1d), que é alto o suficiente para manter a estabilidade do colóide. No entanto, quando o depósito de DOX-GNPs disperso em solução tampão de PBS 0,2 M com centrifugação em alta velocidade após a remoção do sobrenadante, a cor desta solução torna-se preto púrpura, e havia flocos insolúveis visíveis. Isso indicou que a estabilidade do DOX-GNPs não estava muito bem no ambiente de alta concentração de sal. Pode-se explicar que DOX possui apenas um grupo amino, mas não possui grupo sulfidrila, o que não é suficiente para que DOX conecte a superfície dos GNPs via ligação Au-S e Au-N. Portanto, mais esforços são necessários se o DOX-GNPs for usado como agente de contraste e material antitumoral para imagens e terapia de tumor.

Nós sintetizamos DRN-GNPs com DOX, os peptídeos RGD e os peptídeos NLS como agentes redutores e estabilizadores. Os peptídeos RGD podem ter como alvo específico algumas células tumorais superexpressas em α _v β ₃ integrain e os peptídeos NLS podem ter como alvo específico o núcleo. A Figura 2a mostra os espectros de UV-Vis dos DOX-GNPs, NLS-GNPs, DRN-GNPs fabricados; as características de seu pico de absorção de plasmão de superfície foi de 520-530 nm [33]. Também se pode ver pela inserção que os PNB mostraram uma cor de vinho tinto brilhante. Imagens TEM (arquivo adicional 1:Figura S1) mostram que o tamanho de partícula de NLS-GNPs e DRN-GNPs era de cerca de 10 nm e 5 nm, e os GNPs são distribuídos uniformemente, nenhuma coagulação óbvia foi encontrada.

a Espectro de absorção UV-visível e as imagens fotográficas de DOX – GNPs ( a ), NLS-GNPs ( b ), e DRN-GNPs ( c ) b Espectro de absorção UV-visível de DOX básico, peptídeos RGD, peptídeos NLS e o sobrenadante de GNPs DRN. c Espectros de FTIR de peptídeos NLS, NLS-GNPs e DRN-GNPs. A distância entre o espectro de GNPs e o espectro de peptídeos NLS é ampliada para o contraste distintamente

A fim de validar a síntese de NLS-GNPs e DRN-GNPs, caracterizamos os espectros de FTIR de peptídeos NLS e os GNPs na Fig. 2c. Alguns picos FTIR de peptídeos NLS foram encontrados nos espectros de NLS-GNPs e DRN-GNPs, como pico de absorção de vibração de alongamento C-H (2840-2972 cm ⁻¹ ) [47], pico de absorção de vibração de alongamento C =O (1630–1700 cm ⁻¹ ) [48], e =pico de vibração de flexão no plano C-H (1300–1475 cm ⁻¹ ) [49]; indicou que os peptídeos CCYNLS foram conjugados com sucesso na superfície dos GNPs. Também descobrimos que o pico de vibração do esqueleto de benzeno do terminal de tirosina no peptídeo NLS em 1529 cm ^-1 e o pico de vibração de alongamento de hidroxil C-O fenólico em 1193 cm ⁻¹ [49] desapareceu no espectro infravermelho de NLS-GNPs e DRN-GNPs, o que significa que o esqueleto de benzeno do terminal de tirosina foi transportado para uma estrutura de quinona após desempenhar seu papel de agente redutor.

Centrifugamos o DRN-GNPs com alta velocidade, coletamos o fluido sobrenadante, que era quase incolor, e então testamos se havia reagentes restantes via espectros de UV-Vis na Fig. 2b. Os picos de absorção de UV dos peptídeos RGD e NLS são derivados de resíduos de tirosina, o pico de absorção foi localizado a 275 nm. No entanto, o grupo hidroxila fenólico tornou-se íons de oxigênio negativos em condições alcalinas, o que aumenta a densidade de elétrons do anel benzeno, o pico foi desviado para o vermelho para 292 nm. Não vimos o pico característico no espectro de UV-Vis do sobrenadante de DRN-GNPs, o que significa que ambos os peptídeos participaram da reação. O DOX possui três picos de absorção na faixa de 450-600 nm, mas o sobrenadante do DRN-GNPs não tem esses picos. Além disso, nenhum DOX foi encontrado no sobrenadante do DRN-GNPs porque sua cor era marrom claro, mas a cor do DOX sob condição básica era roxo claro transparente. Pode-se concluir que os três materiais reagem quase completamente. Da mesma forma, os GNPs DR e GNPs DN também são explicados desta forma, consulte Arquivo adicional 1:Figura S2.

Usamos espectroscopia XPS para examinar a valência de Au para os NLS-GNPs e DRN-GNPs. Conforme mostrado na Fig. 3a, b, dois picos com energias de ligação em torno de 83,6 eV e 87,0 eV são consistentes com a emissão de fotoelétrons Au 4f7 / 2 e 4f 5/2 [33]. Sua posição de energia de ligação Au 4f7 / 2 de ambos os GNPs é de quase 84,0 eV. Para os NLS-GNPs, ele pode ser deconvoluído em Au (0) (83,5 eV) e Au (I) (84,1 eV), sua razão de área de pico é de 57% e 43%, respectivamente. Da mesma forma, para DRN-GNPs, pode ser deconvoluído em Au (0) (83,6 eV) e Au (I) (84,4 eV), as razões de área de pico são 62% e 38%, respectivamente, portanto, eles têm uma proporção maior de Au (I). A carga pode formar complexos de Au (I) -S, que ajudam a manter a estabilidade coloidal dos GNPs. Curiosamente, identificamos três tipos de S nos espectros XPS de NLS-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs no arquivo adicional 1:Figura S3. As curvas azuis e pretas representam os estados de oxidação do enxofre, as curvas roxas representam a ligação S-H e a curva verde representa a ligação Au-S. A formação da ligação Au-S ilustrou que os peptídeos NLS foram conjugados com sucesso na superfície desses três GNPs.

Espectro XPS do Au 4f do ( a ) NLS-GNPs, ( b ) GNPs DRN. A energia de ligação Au 4f7 / 2 dos espectros originais (preto) e resultados ajustados (vermelho) pode ser deconvoluída em dois componentes, curva Au (0) -azul e curva Au (I)-roxa. Espectros de absorção UV-visíveis e imagens de DRN-GNPs dispersos em PBS, NaCl, NaOH e HCl, respectivamente ( c )

Além disso, os picos de N 1s, C 1s e O 1s de espectros de XPS demonstraram que os peptídeos e DOX foram anexados a GNPs (arquivo adicional 1:Figura S4).

Os espectros de XRD (arquivo adicional 1:Figura S5) mostraram que a estrutura cristalina desses GNPs é uma estrutura cristalina cúbica de face centrada, porque todos os seus espectros de XRD continham quatro picos a 38,2 °, 44,5 °, 64,7 ° e 77,8 ° correspondendo aos planos (111), (200), (220) e (311) [33].

Estabilidade de DRN-GNPs

Os dados de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta desses cinco GNPs foram exibidos na Tabela 1; seu tamanho hidrodinâmico é maior do que aquele caracterizado por TEM, o que pode ser atribuído a uma certa quantidade de moléculas hidratadas ao redor do núcleo dos PNB solúveis em água. Seus potenciais zeta eram negativos por causa do grupo carboxila conjugado na superfície dos GNPs. A solução de GNPs mostra boa estabilidade coloidal quando o valor absoluto do potencial zeta é maior que 30 mV; quanto maior o valor absoluto, melhor é a estabilidade. Pode-se ver que todos eles possuem boa estabilidade coloidal na Tabela 1. Em comparação, o valor de potencial zeta dos NLS-GNPs foi o mais alto, isso pode ser porque sua superfície está cheia de peptídeos NLS que podem formar uma forte ligação Au-S via o grupo tiol. O valor absoluto do potencial zeta do DOX-GNPs era próximo a 30 mV; era consistente com o mencionado anteriormente que os DOX-GNPs não eram muito estáveis ​​quando dispersos em solução tampão de PBS. Os dados espectrais foram exibidos no arquivo adicional 1:Figura S6.

As mudanças nas bandas de ressonância plasmônica de superfície (SPR) características dos GNPs podem ser usadas para determinar a agregação de GNPs utilizando espectrometria UV-Vis [49]. Medimos seus espectros de UV-Vis e tiramos as fotografias dos DRN-GNPs (Fig. 3c) quando eles foram dispersos em alto teor de sal (1 M NaCl e 0,2 M PBS), ácido forte (0,5 M HCl) e base forte ( Soluções de NaOH 0,5 M). Nem a mudança de cor da solução nem a mudança de espectro de UV-vis foram observadas sob várias condições adversas, exceto na solução de HCl, na qual sua cor mudou para um leve roxo e o pico de absorção ultravioleta mudou para o vermelho de cerca de 20 nm, o que significa que os GNPs coagularam levemente sob condições ácidas fortes . A razão pode ser que a estabilidade coloidal de GNPs carregados negativamente foi afetada sob forte condição ácida, mas não foi influenciada no tampão PBS neutro e ambiente alcalino. Podemos concluir que os DRN-GNPs são altamente estáveis ​​em condições de alto sal e álcalis, indicando que se esperava que nossos DRN-GNPs sintetizados fossem usados ​​para imagens de células in vitro e terapia antitumoral in vivo.

Imagem de espalhamento de campo escuro plasmônico de células tumorais e microscopia TEM celular

Para a imagem específica direcionada de células tumorais com DRN-GNPs, selecionamos as células Hela como grupo de teste e as células MCF-7 como o grupo de controle. A razão é que as células Hela superexpressam a integrina α _v β ₃ [50] mas as células MCF-7 não, portanto, não tem ligação específica de RGD; é um bom grupo de controle [51]. A captação de DRN-GNPs por essas duas linhas celulares após incubação por 24 h com uma concentração final de 35 μg / mL foi avaliada por uma microscopia de fluorescência vertical no modelo de campo escuro. As células sendo tratadas sem GNPs não mostram dispersão de luz plasmônica (Fig. 4 células A-Hela, células 5C-MCF-7). Imagens de células Hela sendo tratadas com os GNPs DRN mostram que os sinais de dispersão dos GNPs estão fortemente localizados no núcleo (Figs. 4b e 5e). No entanto, dificilmente pudemos ver a dispersão de luz das células MCF-7 após terem sido incubadas com os GNPs DRN, embora uma pequena quantidade de GNPs possa ter entrado nas células tumorais através do efeito passivo de permeação e retenção aumentada das células tumorais (EPR effect) (Figs. 4d and 5f), the enhanced permeability and retention (EPR) effect is a unique phenomenon of solid tumors related to their anatomical and pathophysiological differences from normal tissues. For example, angiogenesis leads to high vascular density in solid tumors, large gaps exist between endothelial cells in tumor blood vessels, and tumor tissues show selective extravasation and retention of macromolecular drugs [52]. So they might not be clearly detected under the same experimental condition. The results demonstrated that the endocytosis of Hela cells via receptor-mediated endocytosis was facilitated by the RGD peptides on the GNPs’ surface. The NLS peptides could also maintain their activity to specifically targeted nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be a very potential contrast agent for tumor targeted imaging.

The contents of the rows are listed as follows:“PBS buffer” represents the cells incubate with PBS buffer, “DRN-GNPs” represents the cells incubate with DRN-GNPs. The subscript of “1” represents the bright field images of cells, “2” represents the dark field images of cells, and “3” represents the overlapping images (bright-field and dark-field) of cells. All of the scale bars are 20 μm. The picture of E is a small region chosen from B₃ in Fig. 4, the picture of F is a small region chosen from D₃ in Fig. 4, the scale bars are 10 μm

TEM images of DRN-GNPs incubated in Hela and MCF-7 cells for 24 h. A ₁ , A₂ , and A₃ are corresponding to HeLa cells while B₁ and B₂ are to MCF-7 cells

Table 2 shows the ratio values between the cells’ densitometric mean grey and the background in the same image, which has a positive correlation with the taken up amounts of DRN-GNPs by these two cell lines. The ratios of the cells incubated with PBS buffer and the MCF-7 cells were nearly 1.0, the brightness of cells was nearly close to the background. The ratio of Hela cells incubated with DRN-GNPs was 4.80, that means the synthesized DRN-GNPs could be specifically targeted and entered the tumor cells overexpressed the integrin α_v β ₃ .

To confirm receptor-specific internalization of the DRN-GNPs, we investigated the cellular uptake of the DRN-GNPs by Hela and MCF-7 cells utilizing the TEM technique (see Fig. 5). There was a large amount of DRN-GNPs localized in the nucleus and cytoplasm regions of α_v β ₃ -positive Hela cells (Fig. 5(A₁ - A₃ )). On the other hand, only a negligible amount of particles was found inside the cytoplasm regions of α_v β ₃ -negative MCF-7 cells (Fig. 5(B₁ -B ₂ )), they might be accumulated in the MCF-7 cells by means of the passive targeting EPR effect. We found that there were high contrast black continuous regions in the MCF-7 cells’ nucleus; they were uranyl acetate, which stained the nucleus, and they were different from the granular particles in the nucleus of Hela cells. The TEM images are consistent with the dark-field imaging results, indicating that the RGD and NLS peptides on the surface of GNPs facilitated the DRN-GNPs targeting Hela cells’ nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect contrast agent for tumor targeted imaging and diagnosis.

Cellular Therapeutic Efficacy Evaluation

To evaluate the therapeutic efficacy of DOX and DRN-GNPs at cell level, MTT assay was firstly carried out to study cell viability of Hela and MCF-7 cells under the treatment of these two samples for 24 h. DRN-GNPs demonstrated almost the same inhibition effect by killing nearly 70% of cells at the same DOX’s concentration (39.0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). In line with the MTT results, when the concentration of DRN-GNPs was 40 μg/mL, the number and state of the Hela and MCF-7 cells were relatively good, so the concentration of 35 μg/mL was the suitable concentration for imaging. We observed that when the DRN-GNPs’ concentration was high to 60 μg/mL (Fig. 6(C₃ )), the Hela cells became necrosis obviously. When the concentration of DRN-GNPs goes high to 100 μg/mL, salient reduction of the number cells can be observed and clear cellular morphological change as the characteristic of necrosis was observed. The same concentration of conjugated DOX still exhibited nearly the same anti-tumor efficacy compared with the free DOX. These results indicated that our synthesized DRN-GNPs could be used not only as a contrast agent but also as a good drug delivery system.

MTT assay was used to qualitatively display in vitro anti-tumor activity of DOX and DRN-GNPs on Hela (a ) and MCF-7 cells (b ) for 24 h (100%). The concentrations of C₀ -C₅ are 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL for DRN-GNPs; the corresponding DOX’s concentrations are 0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2, 39.0 μg/mL. Data are represented as means ± standard deviations of triplicate samples (n =3). Images of Hela cells incubated with different concentration of DRN-GNPs (c )

The result detected by the flow cytometry in Fig. 7 also demonstrates the anti-tumor efficacy of DRN-GNPs. Viability of Hela cells when exposed to DRN-GNPs of different concentrations was measured by flow cytometry based assays. Two modes of cell death, apoptosis and necrosis, were measured using Annexinv-FITC and propidium iodide (PI) dyes, respectively (Fig. 7). Similar to the results of MTT assay, the data showed that DRN-GNPs induced cell necrosis was dose-dependent. The proportion of necrotic cells was 8% without incubating with DRN-GNPs; when the concentration was high to 100 μg/mL, the proportion of necrotic cells was 23.84%; that means our synthesized DRN-GNPs could kill Hela cells efficiently. The difference between the results of MTT and flow cytometry can be explained that the difference of cell number and the methods.

Representative two-dimensional contour density plots to determine fractions of live, apoptotic, and necrotic cells, when exposed to DRN-GNPs at different concentrations (0–100 μg/mL) for 24 h, respectively. Cell necrosis and apoptosis were measured by using PI and Annexinv-FITC dyes

Therapy Evaluation of DRN-GNPs in Tumor-Bearing Mice

To further determine whether DRN-GNPs induced a combined therapeutic effect on tumor cells in vivo, we evaluated the anti-tumor effect of DRN-GNPs in tumor-bearing mice for long-term intravenously injection of drugs. The saline group and the drugs of free DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs intravenously injected groups were set as the control groups, in which the concentration of conjugated DOX was the same as that of the free DOX. We observed that the tumor sizes of DRN-GNPs-treated groups were obviously smaller than that of the saline, DOX, DN-GNPs, and DR-GNPs-treated groups (Fig. 8a). The tumor volume and body weight of the mice were monitored every 2 days. Significant variation of tumor volume and tumor weight among all of the treated groups is shown in Fig. 8d, f; the tumor volumes and tumor weight of DN-GNPs and DR-GNPs-treated groups were smaller than that of the free DOX-treated group, but still larger than that of the DRN-GNPs-treated groups because of the less targeted activity. That might be because DOX molecules are small, lack targeting, and they have a short half-life in vivo; therefore, they might be cleared out quickly. However, DRN-GNPs possess of strong stability in the blood system, long half-life, and highly targeted ability, so they can be targeted to the tumor site, and then play the anti-tumor effect of DOX. Between the DRN-GNPs intravenously injected and tumor-injected groups, the anti-tumor efficacy of the latter group is better than that of the former group because the drugs do not need a complex system of blood circulation into the focus. The tumor inhibition rate of DOX is less than 50%, and the rates of all of the DOX-conjugated GNPs are larger than 50%; they can be high to 66.7% and 57.7%, respectively. The HE stain results showed that there was a certain degree of damage for liver organs in the intravenous injected DRN-GNPs group (Fig. 9). Furthermore, the bio-toxicity of DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs on tumor-bearing mice were also assessed by histological analysis. As shown in Fig. 8b, tumor cell volume of saline group is comparatively larger than that of treatment groups, and tumor cells demonstrate with more mitotic figures. All the results showed that the tumor inhibition effect of DRN-GNPs was the best among the GNPs. Thus, our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect DOX delivery system for tumor therapy.

a Tumor images isolated from tumor-bearing mice after treatment of saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). b The histological images of tumors of the mice after treated with saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). c Body weight, tumor volume (d ), tumor inhabitation rate (e ), and tumor’s weight (f ) of tumor-bearing mice during 14 days treatment; data are represented as means ± standard deviations (n =6)

The histological images of the main organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of the mice after treated with saline, free DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection)

Conclusão

In this study, we have successfully developed a one-step method to prepare the multifunctional DRN-GNPs in about half an hour. The GNPs have also been successfully applied to the tumor targeted imaging and tumor therapy both in vitro and in vivo. The success shows that it is possible to make a fully use of the reducing and stabilizing ability of the DOX, RGD peptides, and CCYNLS peptides, which will make the GNPs’ synthesis process simple and efficient. More importantly, the one-step synthesized DRN-GNPs still possess good colloidal stability in the physiological system, and the peptides conjugated on the surface remained the targeted ability and DOX still possesses its anti-tumor ability. To our knowledge, this is the first report for synthesis of DOX, RGD and CCYNLS peptides conjugated multifunctional GNPs with a one-step method, and their application in tumor imaging, diagnosis, and therapy. This strategy is in line with the development direction of green chemistry, and it would lay the foundation for large-scale applications within the near future. We expect that our report will provide a new way for the one-step synthesis of multifunctional nanomaterials used for tumor imaging and therapy.

Disponibilidade de dados e materiais

All datasets are presented in the main paper or in the additional supporting files.

Abreviações

CCYNLS peptides:

The sequence of amino acid is cysteine-cysteine-tyrosine-proline-proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine

Cyclic RGD peptides:

The sequence of amino acid is arginine-glycine-aspartate-tyrosine-glutamic acid

DOX:

Doxorrubicina

DR-GNPs:

DOX-RGD-GNPs, DN-GNPs:DOX-NLS-GNPs, DRN-GNPs:DOX-RGD-NLS GNPs

GNPs:

Nanopartículas de ouro

Comutação analógica e comportamento sináptico artificial de Ag / SiOx:Ag / TiOx / p ++ - Dispositivo Memristor Si Nanofibras de carbono cerâmicas de SiOC poroso hierárquico sustentado para absorção de micro-ondas eficiente