Síntese Verde Eficiente em Uma Etapa de Nanopartículas de Ouro Multifuncionais para Imageamento e Terapia de Tumor Direcionados

Resumo

Nanopartículas de ouro (GNPs) sempre foram usadas como vetores de transporte de doxorrubicina (DOX) para diagnóstico e terapia de tumor; no entanto, o processo de síntese desses vetores é preparar GNPs via método de redução química primeiramente, seguido por conjugação com DOX ou peptídeos específicos, então esses métodos enfrentaram alguns problemas comuns incluindo múltiplas etapas, alto custo, tempo consumido, preparação complicada e pós-processamento. Aqui, apresentamos uma estratégia em uma etapa para preparar GNPs conjugados com DOX com base na constituição química do DOX pela primeira vez. Além disso, preparamos GNPs multifuncionais (DRN-GNPs) com método de uma etapa com a ajuda dos grupos funcionais redutores possuídos por DOX, peptídeos RGD e peptídeos de localização nuclear (NLS), que precisam apenas de 30 min. Os resultados de imagens de espalhamento e estudos TEM de células indicaram que os DRN-GNPs poderiam direcionar o núcleo de células Hela. As taxas de inibição tumoral de DRN-GNPs via injeção tumoral e injeção na veia da cauda de camundongos nus foram 66,7% e 57,7%, respectivamente, que foram significativamente aprimoradas comparadas aos grupos controle. A síntese em uma etapa de GNPs multifuncionais não apenas economiza tempo, materiais, mas também está em linha com a direção de desenvolvimento da química verde, e estabeleceria a base para aplicações em larga escala no futuro próximo. Nossos resultados sugeriram que a estratégia de fabricação é eficiente, e nossos DRN-GNPs preparados possuem boa estabilidade coloidal no sistema fisiológico; eles são um agente de contraste potencial e um vetor de transporte de DOX eficiente para diagnóstico e terapia de câncer cervical.

Introdução

Doxorrubicina (DOX) é um fármaco anticâncer comumente usado que tem sido amplamente usado em uma variedade de quimioterapia de câncer, como tumor maligno sanguíneo [1], uma variedade de adenocarcinoma [2-5], sarcoma de tecido mole [6], e assim por diante. No entanto, uso prolongado e altas doses de DOX levarão a resistência ao fármaco [7], náusea [8], perda de cabelo [9], e toxicidade aguda e crônica [10], que pode levar a insuficiência cardíaca congestiva [11]. Portanto, é muito necessário desenvolver um transportador de fármaco com boa biocompatibilidade e alta capacidade de carregamento de fármaco. Nos últimos anos, muitos nanomateriais, como pontos quânticos [12, 13], quitosana [14, 15] nanomateriais de silício [16, 17], nanomateriais poliméricos [18-20], nanopartículas fluorescentes [21-24], e nanomateriais metálicos [25-30] foram desenvolvidos como vetores de transporte de DOX para diagnóstico e terapia de tumor. Nanomateriais de ouro têm sido amplamente usados devido às suas propriedades químicas e ópticas únicas, baixa toxicidade, boa biocompatibilidade e capacidade de controle de modificação de superfície [31, 32] entre esses nanomateriais. Até agora, existem três tipos de abordagens para conjugação de DOX em GNPs. A primeira é conjugar DOX na superfície de GNPs com a ajuda de hidrazina [25], 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida hidrocloreto (EDC) [26], agente sensível a pH [27], sistema DCC/NHS [28]. A segunda é incubar GNPs com DOX por pelo menos 24 h [29]. A terceira é substituir citrato conjugado na superfície de nanopartículas de ouro (GNPs) por DOX [30]. Embora esses GNPs conjugados com DOX tenham sido usados em terapia tumoral, a aplicação ainda é limitada devido à falta de especificidade suficiente. Recentemente, o grupo de El-sayed [27] funcionalizou GNPs com DOX, peptídeos RGD e peptídeos de sinal de localização nuclear (NLS). O destaque de seu trabalho é que os GNPs entram nas células tumorais via endocitose mediada por receptor de peptídeos RGD e então entram no núcleo com a ajuda de peptídeos NLS, o que faz o DOX interferir efetivamente com a síntese de DNA. Infelizmente, precisava de pelo menos 120 h acoplando peptídeos ou fármacos camada por camada nos GNPs, e cada processo precisava de pelo menos 24 h. Similarmente, todos os métodos mencionados acima enfrentaram alguns problemas comuns como múltiplas etapas, alto custo, preparação complicada e pós-processamento. Então é necessário desenvolver um método simples e rápido para síntese de nanomateriais de ouro multifuncionais.

Neste artigo, apresentamos uma estratégia em uma etapa para preparar GNPs conjugados com DOX com base na constituição química do DOX pela primeira vez. Além disso, apresentamos um método sintético conveniente para preparar um vetor de transporte de DOX multifuncional para fazer o DOX funcionar melhor, que pode ser usado em diagnóstico e terapia de tumor. A diferença chave entre nosso trabalho dos outros é que usamos DOX, peptídeos RGD e peptídeos NLS como reagentes redutores e estabilizadores para fabricar os GNPs e fazer todas essas três substâncias conjugarem na superfície dos GNPs para formar DRN-GNPs ao mesmo tempo. Nossos trabalhos anteriores [33-35] tinham provado que RGD e outros peptídeos podem ser usados para reduzir íons de ouro para fabricar nanomateriais de ouro. O N-terminal do NLS pode ser modificado usando sequência cisteína-cisteína-tirosina (CCY) para construir CCYNLS, que pode reduzir íons de ouro enquanto ainda mantém o efeito de direcionamento do NLS [36]. Também descobrimos que DOX possui dois grupos hidroxila fenólicos com forte redutibilidade sob condição básica [37, 38], então pode reduzir íons de ouro para formar GNPs também. Enquanto isso, o efeito antitumoral do DOX pode não ser influenciado porque ele se intercala no DNA pelo grupo amino do carbono 7 e grupo hidroxila do carbono 9 [39]. Ao mesmo tempo, o enxofre, oxigênio e nitrogênio nos peptídeos e DOX podem ser combinados com os GNPs para manter a estabilidade coloidal [33]. Os resultados mostram que os DRN-GNPs foram fabricados com sucesso e funcionaram bem em imageamento, diagnóstico e terapia de tumor (Esquema 1). Para nosso conhecimento, este é o primeiro relato para síntese de DOX, RGD e peptídeos NLS conjugados GNPs multifuncionais com método de uma etapa, e sua aplicação em diagnóstico e terapia de tumor.

Ilustração esquemática da síntese de DRN-GNPs, a captação por células Hela e o diagnóstico de tumor de DRN-GNPs

Materiais e Métodos

Materiais

HAuCl₄ 4H₂O foi adquirido da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, peptídeos RGD cíclicos (a sequência de aminoácido é arginina-glicina-aspartato-tirosina-ácido glutâmico (c(RGDyE))) e hidróxido de sódio foram os mesmos que ref. [35]. Doxorrubicina foi adquirida da Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Peptídeos CCYNLS (a sequência de aminoácido é cisteína-cisteína-tirosina-prolina-prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina, CCYPPKKKRKV) foram fornecidos pela China Peptides Co., Ltd (Shanghai, China). A linha celular Hela e a linha celular MCF-7 foram fornecidas pela Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. Soro bovino fetal (FBS) e meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) foram adquiridos da GibcoBRL Life Technologies. Kit de Ensaio de Proliferação e Citotoxicidade (MTT) foi adquirido da Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.

Síntese de DOX-GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs, DRN-GNPs

Para a preparação dos DOX-GNPs, solução de DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) foi adicionada na solução de ácido cloráurico (0,86 mM, 1,0 mL) sob agitação magnética, então NaOH (2 M, 5 μL) foi adicionado para ajustar pH. Para a preparação dos NLS-GNPs, solução de peptídeos CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) foi adicionada na solução de ácido cloráurico (3,44 mM, 1,0 mL) sob agitação magnética, então NaOH (2 M, 20 μL) foi adicionado para ajustar pH. Para a preparação dos DR-GNPs, solução de DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) e solução de peptídeos RGD (1,0 mM, 1,0 mL) foi adicionada na solução de ácido cloráurico (1,72 mM, 2,0 mL) sob agitação magnética, então NaOH (2 M, 15 μL) foi adicionado para ajustar pH. Para a preparação dos DN-GNPs, solução de DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) e solução de peptídeos CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) foi adicionada na solução de ácido cloráurico (1,72 mM, 2,0 mL) sob agitação magnética, então NaOH (2 M, 20 μL) foi adicionado para ajustar pH. Para a preparação dos DRN-GNPs, soluções de DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL), peptídeos CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) e peptídeos RGD (1,0 mM, 1,0 mL) foi adicionada na solução de ácido cloráurico (1,72 mM, 3,0 mL) sob agitação magnética, então NaOH (2 M, 35 μL) foi adicionado para ajustar pH. Todas as reações continuaram por 30 min a 100 °C em sistema de refluxo e o valor de pH foi 10-12. Todos os GNPs foram purificados por centrifugação a 55.000 rpm por 30 min (Optima MAX-TL, Beckman Coulter). Após remover o sobrenadante, os GNPs foram redispersos em água ultrapura.

Caracterização

As caracterizações dos espectros dos GNPs foram implementadas usando um Espectrofotômetro UV 3150 (Shimadzu, Japão), um espectrômetro Nicolet Avatar FTIR modelo 330 (Thermo, América), e uma espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) ESCALab250 com as mesmas condições analíticas que ref. [35]. As imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) dos GNPs foram obtidas de um TEM (JEM-2100F, JEOL, Japão) operado a uma tensão de aceleração de 200 kV.

Medidas de Espalhamento Dinâmico de Luz e Potencial Zeta

Um Analisador de Potencial Zeta Zeta PALS (Brookhaven Instrument Corporation) foi usado para medir os espalhamentos dinâmicos de luz (DLS) dos DOX-GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs, que funcionou a ângulo de 90° com laser de estado sólido (λ = 670 nm) à temperatura ambiente. Quando equipado com eletrodo AQ-827, o analisador foi usado para medir os potenciais zeta dos GNPs.

Análise ICP

A análise quantitativa de Au nos GNPs foi a mesma que ref. [35].

Estabilidade de DR-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs Dispersos em Soluções PBS, HCl, NaOH, NaCl

Misturamos 100 μL dos GNPs precipitados e 500 μL de alta concentração de 0,2 M PBS, 0,5 M HCl, 0,5 M NaOH e 1,0 M solução de NaCl, respectivamente. Doze horas depois, tiramos suas fotos e testamos seus espectros de absorção UV.

Cultura Celular

As células Hela e MCF-7 foram cultivadas em uma incubadora (umidificada com 5% CO₂ ar balanceado) a 37 °C por 24 h. O meio de cultura foi DMEM com 10% FBS. O número de células vivas são contadas por uma placa de contagem celular.

Ensaio de Citotoxicidade de DOX Livre e DRN-GNPs

As células Hela e MCF-7 na fase exponencial foram adicionadas aos poços de placas de 96 poços (cerca de 5 × 10³ células/poço) e incubadas por 24 h, respectivamente. Então os DRN-GNPs de concentrações 0, 20, 40, 60, 80 e 100 μg/mL (a concentração correspondente de DOX foi 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2 e 39,0 μg/mL) foram incubados com cada poço e incubados por 24 h a 37 °C, respectivamente. O grupo controle foi definido adicionando apenas solução tampão PBS, e sua viabilidade foi definida como 100%. O MTT (20 μL, 5 mg/mL) foi adicionado a cada poço e incubado a 37 °C por cerca de 4 h. Então o meio de cultura foi cuidadosamente sugado para fora, e 150 μL de dimetilsulfóxido dois foi adicionado em cada poço por 10 min até que o cristal fosse totalmente dissolvido. Um leitor de microplacas (Thermo Multiskan Mk3) foi usado para medir o valor OD de cada poço no comprimento de onda de 490 nm. Três poços para cada grupo foram preparados e os valores calculados foram expressos como média ± D.P.

Experimento de Citometria de Fluxo

As células Hela e MCF-7 na fase exponencial foram adicionadas a cada poço de duas placas de 12 poços (cerca de 5 × 10⁴ células/poço) e incubadas por 24 h, respectivamente. Então, a solução de DRN-GNPs foi adicionada em cada um dos poços (concentrações finais com 0, 20, 40, 60, 80 e 100 μg/mL) e incubada a 37 °C por 24 h, respectivamente. Removendo o meio de cultura e adicionando solução de Tripsina (contendo EDTA) nos poços para digerir as células. Então removendo a solução de Tripsina dos poços, adicionando o meio de cultura nos poços, e transferindo as células para tubos de centrífuga. Após centrifugar a 1000 g por 5 min, o sobrenadante foi removido e as células em cada tubo foram coletadas e contadas em solução PBS. Cerca de 5-10 × 10⁴ das células foram levadas para outro tubo de centrífuga e foram centrifugadas a 1000 g por 5 min novamente. Removendo o sobrenadante e adicionando 100 μL solução tampão AnnexinV nos tubos. Adicionando 5 μL de AnnexinV-FITC e 5 μL de iodeto de propídio nos tubos e misturando-os com as células suavemente. Os tubos foram incubados à temperatura ambiente (20-25 °C) por 15 min no escuro e então testados por um citômetro de fluxo (BD Accuri C6).

Estudos de Imageamento por Espalhamento de Campo Escuro Óptico e Microscopia Eletrônica de Transmissão em Cultura Celular

As células Hela e MCF-7 foram implantadas no slide de cultura celular de 8 furos cerca de 7 × 10³ células para cada poço, respectivamente. Os DRN-GNPs foram adicionados em cada poço com concentração final de 35 μg/mL. Após incubação por 24 h, removemos fisicamente e GNPs livremente absorvidos enxaguando essas células com solução PBS por três vezes. Então, fixamos com 4% paraformaldeído por 20 min, revestimos com algumas gotas de glicerol, e selamos esses slides de cultura celular de 8 furos com outra lamínula. Um microscópio de campo escuro (Zeiss Imager Z1) foi usado para avaliar as células em × 200 ampliação e modo reflexivo. O tempo de exposição para imagens de campo claro e campo escuro a uma tensão de 5 V foi 1 ms e 400 ms, respectivamente.

Para estudos TEM, células Hela e MCF-7 foram incubadas com DRN-GNPs (35 μg/mL) por 24 h em um frasco de cultura celular, respectivamente. Após incubar e sugar a solução mista de meio e DRN-GNPs, enxaguamos as células com solução PBS por três vezes e então digerimos com tripsina. As células foram transferidas em um tubo centrífugo com um pequeno volume de meio DMEM. As células foram centrifugadas (1500 rpm) por 10 min, o meio DMEM foi sugado cuidadosamente, e a solução de glutaraldeído 3% (geralmente 40 vezes o volume dos materiais) foi adicionada cuidadosamente no tubo para fixar as células no fundo do tubo por mais de 1 h. As células foram fixadas further adicionando 1% tetróxido de ósmio por 1 h, desidratadas com etanol, e então embedidas em Spurr (Sigma-Aldrich Co., EUA). As células foram retiradas do tubo, cortadas em seções, coradas com acetato de uranila aquoso e citrato de chumbo, e então montadas em grade de cobre (300 mesh). Os espécimes foram medidos usando um microscópio eletrônico de transmissão FEI TECNAI-12 (tensão de trabalho 120 kV).

Experimentos em Animais

Sujeitos Animais

Camundongos fêmeas núbiles atímicos foram adquiridos do Centro Experimental de Animais da Universidade Médica do Sul (Guangzhou, China) para teste de terapia tumoral in vivo. Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com as Regras de Gestão de Animais do Ministério da Saúde da República Popular da China (Documento NO. 55, 2001) e as diretrizes para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade Farmacêutica da China.

Eficácia Terapêutica de DOX Livre e Seus Conjugados em Camundongos Portadores de Tumor

Brevemente, 36 camundongos núbiles (idade 5-6 semanas, peso 16-18 g) foram divididos aleatoriamente em seis grupos. Eles foram injetados subcutaneamente de células Hela (5 × 10⁶ células em PBS) na fossa axilar direita. Cinco dias depois, camundongos no grupo controle foram injetados por veia da cauda com solução salina (0,154 mol/L, 0,2 mL). Camundongos de DOX livre, DR-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs foram injetados por veia da cauda também. A fim de comparar a eficácia antitumoral de DRN-GNPs entre injeção intravenosa e injeção tumoral, definimos um grupo para ser injetado com quantidade igual de DRN-GNPs no local do tumor. Esses cinco grupos mantiveram uma dose de 0,3 mg/kg equivalente de DOX livre ou conjugado em cada camundongo. Cada camundongo passou por injeção na veia da cauda ou injeção tumoral uma vez a cada dia. O peso corporal e o volume do tumor de cada camundongo foi monitorado a cada dia por 14 dias. Para further investigar os efeitos terapêuticos de DOX, DR-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs, os tumores dos seis grupos foram excisados para análise patológica após 14 dias de tratamento. Tumores e os órgãos internos de coração, fígado, baço, pulmão e rim dos camundongos foram isolados dos camundongos, fixados com formalina neutra tamponada a 10%, e embedidos em parafina. Os tecidos tumorais fatiados foram corados com Hematoxilina e Eosina (H&E) e examinados por microscópio óptico Olympus.

Resultados e Discussão

Síntese e Caracterização de DOX-GNPs, NLS-GNPs, DN-GNPs, DR-GNPs, DRN-GNPs

Na síntese dos DOX-GNPs, quando a solução de NaOH foi adicionada na solução mista de DOX e solução de ácido cloráurico, a cor da solução mudou imediatamente de laranja para roxo raso, então tornou-se vinho tinto a 100 °C em sistema de refluxo sob agitação magnética em um minuto, indicando a formação dos DOX-GNPs. O resultado indicou que a capacidade de redução do DOX é muito forte porque DOX possui dois grupos hidroxila fenólicos (carbono No. 6 e No. 11) com forte redutibilidade sob condição básica. A reação continuou por 30 min até a cor não mudar.

A fim de evitar confundir a cor vermelho-laranja do DOX e a cor vermelho-vinho dos GNPs, apresentamos mais evidências caracterizando seus espectros de absorção UV (como mostrado na Fig. 1a). DOX tem um pico de absorção característico próximo a 485 nm e um pico a 530 nm; no entanto, o pico a 480 nm desapareceu no espectro da solução do produto e um pico característico a 520 nm, pico de absorção de ressonância de plasmon de superfície (SPR) característico dos GNPs surgiu. Mesmo assim, a formação de GNPs ainda não é completamente determinada entre o 520 nm dos GNPs e 530 nm do pico do DOX. Levando em conta que os GNPs serão precipitados com centrifugação de alta velocidade, e moléculas de DOX não, podemos ver precipitado roxo no produto do fundo do tubo de centrífuga (inseto da Fig. 1a(3-4)) e DOX não tem nenhum (inseto da Fig. 1a (1-2)).

a Espectros de absorção UV-Visível de DOX e DOX-GNPs preparados, o inseto de (a) são as imagens de DOX (1, 2) e DOX-GNPs (3, 4) antes (1, 3) e depois da centrifugação (2, 4). b Imagem TEM de DOX-GNPs. c Espectros FTIR de DOX e DOX-GNPs preparados. d Espectro XPS de DOX-GNPs

DOX tem fluorescência vermelha sob irradiação de luz ultravioleta de 365 nm; no entanto, a fluorescência de DOX desapareceu após a síntese de GNPs. Existem duas razões possíveis; a primeira é que o coeficiente de extinção dos GNPs é muito forte, eles tendem a extinguir a fluorescência de moléculas quando estão localizadas próximas à superfície dos GNPs (< 5 nm) [40]. Se a distância aumenta para 20 nm ou mais, o campo de plasmon das nanopartículas é muito longe para extinguir seu sinal de fluorescência [41]. A outra razão é que o grupo fluorescente do DOX foi destruído após desempenhar o papel de agente redutor. Como mostrado na Fig. 1c, embora o número do pico de absorção infravermelho dos DOX-GNPs seja significativamente menor que o do DOX, muitas das características do DOX ainda foram retidas, como os picos característicos de absorção IR a 2910 cm⁻¹ (C-H, vibração de estiramento) [42], 1631 cm⁻¹ (vibração de estiramento de carbonila) [43], 1114 cm⁻¹ (vibração de estiramento C-O, C-N) [44], e 867 cm⁻¹ (vibração de flexão fora do plano N-H, C-H) [45], respectivamente. Esses picos representativos do DOX também foram exibidos nos espectros dos DOX-GNPs, indicando que o DOX foi ligado com sucesso aos DOX-GNPs. Curiosamente, o pico a 1214 cm⁻¹ pico característico para vibração de estiramento C-O do grupo hidroxila fenólico [46] desapareceu nos espectros dos DOX-GNPs. O grupo fenólico pode reduzir íons Au em GNPs, e então foi transportado para grupo carbonila. Especulamos que o efeito do DOX não é afetado, porque ele se intercala no DNA pelo grupo amino do carbono 7 e grupo hidroxila do carbono 9 [39].

Podemos observar que o tamanho de partícula dos DOX-GNPs é cerca de 6 nm a partir dos resultados TEM (Fig. 1b). A proporção calculada de Au (I) foi 31,93% a partir do espectro XPS dos DOX-GNPs (Fig. 1d), que é alta o suficiente para manter a estabilidade do coloide. No entanto, quando o depósito de DOX-GNPs disperso em solução tampão PBS 0,2 M com centrifugação de alta velocidade após remover sobrenadante, a cor desta solução tornou-se roxo-preto, e havia flocos insolúveis visíveis. Indicou que a estabilidade dos DOX-GNPs não era muito boa no ambiente de alta concentração de sal. Pode ser explicado que DOX possui apenas um grupo amino mas não possui grupo sulfidrila, que não é suficiente para DOX conectar a superfície de GNPs via ligação Au-S e Au-N. Então mais esforços são necessários se DOX-GNPs é usado como agente de contraste e material antitumoral para imageamento e terapia de tumor.

Sintetizamos DRN-GNPs com DOX, peptídeos RGD e peptídeos NLS como agentes redutores e estabilizadores. Os peptídeos RGD podem especificamente direcionar algumas células tumorais que superexpressam a integrina α_vβ₃, e os peptídeos NLS podem especificamente direcionar o núcleo. A Figura 2a mostra os espectros UV-Vis dos DOX-GNPs, NLS-GNPs, DRN-GNPs fabricados; as características de seu pico de absorção de plasmon de superfície foi 520-530 nm [33]. Também se pode ver do inseto que os GNPs mostraram uma cor vermelho-vinho brilhante. Imagens TEM (Arquivo Adicional 1: Figura S1) mostram que o tamanho de partícula de NLS-GNPs e DRN-GNPs era cerca de 10 nm e 5 nm, e os GNPs são distribuídos uniformemente, nenhuma coagulação óbvia foi encontrada.

a Espectros de absorção UV-Visível e imagens fotográficas de DOX-GNPs (a), NLS-GNPs (b) e DRN-GNPs (c). b Espectros de absorção UV-Visível de DOX básico, peptídeos RGD, peptídeos NLS e sobrenadante de DRN-GNPs. c Espectros FTIR de peptídeos NLS, NLS-GNPs e DRN-GNPs. A distância entre o espectro dos GNPs e espectro dos peptídeos NLS são ampliados para o contraste distintamente

Para validar a síntese de NLS-GNPs e DRN-GNPs, caracterizamos os espectros FTIR de peptídeos NLS e os GNPs na Fig. 2c. Alguns picos FTIR de peptídeos NLS foram encontrados nos espectros de NLS-GNPs e DRN-GNPs, como pico de absorção de vibração de estiramento C-H (2840-2972 cm⁻¹) [47], pico de absorção de vibração de estiramento C=O (1630-1700 cm⁻¹) [48], e pico de vibração de flexão no plano =C-H (1300-1475 cm⁻¹) [49]; indicou que os peptídeos CCYNLS foram conjugados com sucesso na superfície dos GNPs. Também descobrimos que o pico de vibração do esqueleto benzeno do terminal tirosina no peptídeo NLS a 1529 cm⁻¹ e o pico de vibração de estiramento C-O hidroxila fenólica a 1193 cm⁻¹ [49] desapareceram nos espectros infravermelhos de NLS-GNPs e DRN-GNPs, isso significa que o esqueleto benzeno do terminal tirosina foi transportado para uma estrutura quinona após desempenhar seu papel de agente redutor.

Centrifugamos os DRN-GNPs com alta velocidade, coletamos o fluido sobrenadante, que era quase incolor, e então testamos se havia reagentes restantes via espectros UV-Vis na Fig. 2b. Os picos de absorção UV de peptídeos RGD e NLS são derivados de resíduos de tirosina, o pico de absorção estava localizado a 275 nm. No entanto, o grupo hidroxila fenólico tornou-se íons oxigênio negativos sob condições alcalinas, que aumenta a densidade eletrônica do anel benzeno, o pico foi deslocado para o vermelho para 292 nm. Não vimos o pico característico no espectro UV-Vis do sobrenadante dos DRN-GNPs, o que significa que ambos os peptídeos participaram da reação. DOX possui três picos de absorção na faixa de 450-600 nm, mas o sobrenadante dos DRN-GNPs não tem esses picos. Além disso, nenhum DOX foi encontrado no sobrenadante dos DRN-GNPs porque sua cor era marrom claro mas a cor do DOX sob condição básica era roxo claro transparente. Pode-se concluir que os três materiais reagiram quase completamente. Similarmente, os DR-GNPs e DN-GNPs também são explicados dessa forma, ver Arquivo Adicional 1: Figura S2.

Usamos espectroscopia XPS para examinar a valência de Au para os NLS-GNPs e DRN-GNPs. Como mostrado na Fig. 3a, b, dois picos com energias de ligação em torno de 83,6 eV e 87,0 eV são consistentes com a emissão de fotoelétrons Au 4f7/2 e 4f 5/2 [33]. Sua posição de energia de ligação Au 4f7/2 de ambos GNPs é quase 84,0 eV. Para os NLS-GNPs, pode ser desconvoluído em Au (0) (83,5 eV) e Au (I) (84,1 eV), sua proporção de área de pico é 57% e 43%, respectivamente. Similarmente, para os DRN-GNPs, pode ser desconvoluído em Au (0) (83,6 eV) e Au (I) (84,4 eV), as proporções de área de pico são 62% e 38%, respectivamente, assim eles têm uma proporção maior de Au (I). A carga pode formar complexos Au (I)-S, que ajudam a manter a estabilidade coloidal dos GNPs. Curiosamente, identificamos três tipos de S nos espectros XPS de NLS-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs no Arquivo Adicional 1: Figura S3. As curvas azul e preta representam os estados de oxidação de enxofre, curvas roxas representam a ligação S-H, e a curva verde representa a ligação Au-S. A formação de ligação Au-S ilustrou que os peptídeos NLS foram conjugados com sucesso na superfície desses três GNPs.

Espectro XPS do Au 4f do (a) NLS-GNPs, (b) DRN-GNPs. A energia de ligação Au 4f7/2 dos espectros originais (preto) e resultados ajustados (vermelho) poderiam ser desconvoluídos em dois componentes, Au(0)-curva azul e Au(I)-curva roxa. Espectros de absorção UV-Visível e imagens de DRN-GNPs dispersos em PBS, NaCl, NaOH e HCl, respectivamente (c).

Além disso, os picos de N 1s, C 1s e O 1s dos espectros XPS demonstraram que os peptídeos e DOX estavam ligados aos GNPs (Arquivo Adicional 1: Figura S4).

Os espectros XRD (Arquivo Adicional 1: Figura S5) mostraram que a estrutura cristalina desses GNPs são estrutura cristalina cúbica de face centrada, porque todos os seus espectros XRD continham quatro picos a 38,2°, 44,5°, 64,7° e 77,8° correspondentes aos planos (111), (200), (220) e (311) [33].

Estabilidade de DRN-GNPs

Dados de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta desses cinco GNPs foram exibidos na Tabela 1; seu tamanho hidrodinâmico é maior que aquele caracterizado por TEM, que pode ser atribuído a uma certa quantidade de moléculas hidratadas ao redor do núcleo dos GNPs solúveis em água. Seus potenciais zeta foram negativos devido ao grupo carboxil conjugado na superfície dos GNPs. A solução de GNPs mostra boa estabilidade coloidal quando o valor absoluto do potencial zeta é maior que 30 mV; quanto maior o valor absoluto, melhor a estabilidade. Pode-se ver que todos eles possuem boa estabilidade coloidal da Tabela 1. Em comparação, o valor de potencial zeta dos NLS-GNPs foi o mais alto, isso pode ser porque suas superfícies estão cheias de peptídeos NLS que podem formar forte ligação Au-S via grupo tiol. O valor absoluto do potencial zeta dos DOX-GNPs estava próximo a 30 mV; era consistente com o mencionado anteriormente que os DOX-GNPs não eram muito estáveis quando dispersos em solução tampão PBS. Os dados espectrais foram exibidos no Arquivo Adicional 1: Figura S6.

As mudanças das bandas características de ressonância de plasmon de superfície (SPR) dos GNPs podem ser usadas para determinar a agregação de GNPs utilizando espectrometria UV-Vis [49]. Medimos seus espectros UV-Vis e tiramos fotografias dos DRN-GNPs (Fig. 3c) quando dispersos em alto sal (1 M NaCl e 0,2 M PBS), ácido forte (0,5 M HCl) e base forte (0,5 M NaOH) soluções. Nenhuma mudança de cor da solução nem deslocamento de espectros UV-vis foi observado sob várias condições severas exceto na solução de HCl, na qual sua cor mudou para roxo leve e o pico de absorção ultravioleta deslocou para o vermelho cerca de 20 nm, o que significa que GNPs coagularam levemente sob condição de ácido forte. A razão pode ser que a estabilidade coloidal dos GNPs carregados negativamente foi afetada sob condição ácida forte, mas não foi influenciada no tampão PBS neutro e ambiente alcalino. Podemos concluir que os DRN-GNPs são altamente estáveis sob condições de alto sal e alcalinas, indicando que nossos DRN-GNPs sintetizados foram esperados para serem usados para imageamento de células in vitro e terapia antitumoral in vivo.

Imageamento por Espalhamento de Campo Escuro Plasmonico de Células Tumorais e Microscopia TEM Celular

Para o imageamento direcionado específico de células tumorais com DRN-GNPs, selecionamos as células Hela como grupo de teste e as células MCF-7 como grupo controle. A razão é que as células Hela superexpressam a integrina α_vβ₃ [50] mas as células MCF-7 não, então não tem ligação específica de RGD; é um bom grupo controle [51]. A captação de DRN-GNPs por essas duas linhas celulares após incubação por 24 h com concentração final de 35 μg/mL foi avaliada por microscopia de fluorescência vertical no modelo de campo escuro. As células tratadas sem GNPs não mostram espalhamento plasmônico de luz (Fig. 4 A-células Hela, 5C-células MCF-7). Imagens de células Hela tratadas com DRN-GNPs mostram que sinais de espalhamento dos GNPs estão pesadamente localizados no núcleo (Figs. 4b e 5e). No entanto, mal podíamos ver a luz de espalhamento das células MCF-7 após incubadas com DRN-GNPs, mesmo que pequena quantidade de GNPs pudesse ter entrado nas células tumorais através do efeito de permeação e retenção aprimorado passivo das células tumorais (efeito EPR) (Figs. 4d e 5f), o efeito de permeabilidade e retenção aprimorado (EPR) é um fenômeno único de tumores sólidos relacionado às suas diferenças anatômicas e fisiopatológicas de tecidos normais. Por exemplo, angiogênese leva a alta densidade vascular em tumores sólidos, grandes gaps existem entre células endoteliais em vasos sanguíneos tumorais, e tecidos tumorais mostram extravasamento e retenção seletiva de fármacos macromoleculares [52]. Então eles podem não ser claramente detectados sob a mesma condição experimental. Os resultados demonstraram que a endocitose de células Hela via endocitose mediada por receptor foi facilitada pelos peptídeos RGD na superfície dos GNPs. Os peptídeos NLS também poderiam manter sua atividade para especificamente direcionar núcleo. Então nossos DRN-GNPs sintetizados poderiam ser um agente de contraste muito potencial para imageamento direcionado de tumor.

O conteúdo das linhas são listados como segue: "PBS buffer" representa as células incubam com tampão PBS, "DRN-GNPs" representa as células incubam com DRN-GNPs. O subscrito de "1" representa as imagens de campo claro das células, "2" representa as imagens de campo escuro das células, e "3" representa as imagens sobrepostas (campo claro e campo escuro) das células. Todas as barras de escala são 20 μm. A imagem de E é uma pequena região escolhida de B₃ na Fig. 4, a imagem de F é uma pequena região escolhida de D₃ na Fig. 4, as barras de escala são 10 μm

Imagens TEM de DRN-GNPs incubadas em células Hela e MCF-7 por 24 h. A₁, A₂ e A₃ correspondem a células HeLa enquanto B₁ e B₂ correspondem a células MCF-7

A Tabela 2 mostra os valores de razão entre a média cinzenta densitométrica das células e o fundo na mesma imagem, que tem correlação positiva com as quantidades captadas de DRN-GNPs por essas duas linhas celulares. As razões das células incubadas com tampão PBS e as células MCF-7 eram quase 1,0, o brilho das células era quase próximo ao fundo. A razão de células Hela incubadas com DRN-GNPs foi 4,80, isso significa que os DRN-GNPs sintetizados poderiam ser especificamente direcionados e entraram nas células tumorais que superexpressam a integrina α_vβ₃.

Para confirmar a internalização específica do receptor dos DRN-GNPs, investigamos a captação celular dos DRN-GNPs por células Hela e MCF-7 utilizando a técnica TEM (ver Fig. 5). Havia uma grande quantidade de DRN-GNPs localizada nas regiões do núcleo e citoplasma de células Hela α_vβ₃-positivas (Fig. 5(A₁- A₃)). Por outro lado, apenas uma quantidade negligenciável de partículas foi encontrada dentro das regiões do citoplasma de células MCF-7 α_vβ₃-negativas (Fig. 5(B₁-B₂)), eles podem ter sido acumulados nas células MCF-7 por meio do efeito de direcionamento passivo EPR. Encontramos que havia regiões contínuas pretas de alto contraste no núcleo das células MCF-7; eles eram acetato de uranila, que corou o núcleo, e eram diferentes das partículas granulares no núcleo de células Hela. As imagens TEM são consistentes com os resultados de imageamento de campo escuro, indicando que os peptídeos RGD e NLS na superfície dos GNPs facilitaram os DRN-GNPs direcionando núcleo de células Hela. Então nossos DRN-GNPs sintetizados poderiam ser usados como um agente de contraste perfeito para imageamento e diagnóstico direcionado de tumor.

Avaliação de Eficácia Terapêutica Celular

Para avaliar a eficácia terapêutica de DOX e DRN-GNPs no nível celular, ensaio MTT foi primeiramente realizado para estudar viabilidade celular de Hela e MCF-7 sob tratamento dessas duas amostras por 24 h. DRN-GNPs demonstraram quase o mesmo efeito de inibição matando quase 70% das células na mesma concentração de DOX (39,0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). Em linha com os resultados MTT, quando a concentração de DRN-GNPs foi 40 μg/mL, o número e estado das células Hela e MCF-7 eram relativamente bons, então a concentração de 35 μg/mL foi a concentração adequada para imageamento. Observamos que quando a concentração de DRN-GNPs foi alta a 60 μg/mL (Fig. 6(C₃)), as células Hela tornaram-se necróticas obviamente. Quando a concentração de DRN-GNPs vai alta a 100 μg/mL, redução saliente do número de células pode ser observada e clara mudança morfológica celular como característica de necrose foi observada. A mesma concentração de DOX conjugado ainda exibiu quase a mesma eficácia antitumoral comparada com DOX livre. Esses resultados indicaram que nossos DRN-GNPs sintetizados poderiam ser usados não apenas como agente de contraste mas também como um bom sistema de entrega de fármaco.

Ensaio MTT foi usado para exibir qualitativamente atividade antitumoral in vitro de DOX e DRN-GNPs em Hela (a) e células MCF-7 (b) por 24 h (100%). As concentrações de C₀-C₅ são 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL para DRN-GNPs; as concentrações correspondentes de DOX são 0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2, 39,0 μg/mL. Dados são representados como médias ± desvios padrão de amostras triplicadas (n = 3). Imagens de células Hela incubadas com diferentes concentrações de DRN-GNPs (c)

O resultado detectado pela citometria de fluxo na Fig. 7 também demonstra a eficácia antitumoral de DRN-GNPs. Viabilidade de células Hela quando expostas a DRN-GNPs de diferentes concentrações foi medida por ensaios baseados em citometria de fluxo. Dois modos de morte celular, apoptose e necrose, foram medidos usando corantes AnnexinV-FITC e iodeto de propídio (PI), respectivamente (Fig. 7). Similar aos resultados do ensaio MTT, os dados mostraram que DRN-GNPs induziram necrose celular dependente de dose. A proporção de células necróticas foi 8% sem incubar com DRN-GNPs; quando a concentração foi alta a 100 μg/mL, a proporção de células necróticas foi 23,84%; isso significa que nossos DRN-GNPs sintetizados poderiam matar células Hela eficientemente. A diferença entre os resultados de MTT e citometria de fluxo pode ser explicada pela diferença de número de células e os métodos.

Gráficos de densidade de contorno bidimensional representativos para determinar frações de células vivas, apoptóticas e necróticas, quando expostas a DRN-GNPs em diferentes concentrações (0-100 μg/mL) por 24 h, respectivamente. Necrose e apoptose celular foram medidas usando corantes PI e AnnexinV-FITC

Avaliação de Terapia de DRN-GNPs em Camundongos Portadores de Tumor

Para further determinar se DRN-GNPs induziram um efeito terapêutico combinado em células tumorais in vivo, avaliamos o efeito antitumoral de DRN-GNPs em camundongos portadores de tumor para injeção intravenosa de fármacos a longo prazo. O grupo salina e os fármacos de DOX livre, DR-GNPs e DN-GNPs injetados intravenosamente foram definidos como grupos controle, nos quais a concentração de DOX conjugado era a mesma que a do DOX livre. Observamos que os tamanhos de tumor dos grupos tratados com DRN-GNPs eram obviamente menores que os de salina, DOX, DN-GNPs e grupos tratados com DR-GNPs (Fig. 8a). O volume do tumor e peso corporal dos camundongos foram monitorados a cada 2 dias. Variação significativa de volume de tumor e peso do tumor entre todos os grupos tratados é mostrada na Fig. 8d, f; os volumes de tumor e peso do tumor dos grupos tratados com DN-GNPs e DR-GNPs eram menores que o do grupo tratado com DOX livre, mas ainda maiores que os dos grupos tratados com DRN-GNPs por causa da menor atividade direcionada. Isso pode ser porque moléculas de DOX são pequenas, carecem de direcionamento, e têm meia-vida curta in vivo; portanto, podem ser eliminadas rapidamente. No entanto, DRN-GNPs possuem forte estabilidade no sistema sanguíneo, longa meia-vida e alta capacidade de direcionamento, então podem ser direcionados ao local do tumor, e então desempenhar o efeito antitumoral do DOX. Entre os grupos de DRN-GNPs injetados intravenosamente e injetados no tumor, a eficácia antitumoral do último grupo é melhor que a do primeiro grupo porque os fármacos não precisam de um sistema complexo de circulação sanguínea até o foco. A taxa de inibição de tumor de DOX é menor que 50%, e as taxas de todos os GNPs conjugados com DOX são maiores que 50%; eles podem ser altos a 66,7% e 57,7%, respectivamente. Os resultados de coloração HE mostraram que havia certo grau de dano para órgãos do fígado no grupo de DRN-GNPs injetados intravenosamente (Fig. 9). Além disso, a biotoxicidade de DOX, DR-GNPs e DN-GNPs em camundongos portadores de tumor também foram avaliados por análise histológica. Como mostrado na Fig. 8b, volume de células tumorais do grupo salina é comparativamente maior que o dos grupos de tratamento, e células tumorais demonstram com mais figuras mitóticas. Todos os resultados mostraram que o efeito de inibição de tumor de DRN-GNPs foi o melhor entre os GNPs. Assim, nossos DRN-GNPs sintetizados poderiam ser usados como um sistema de entrega de DOX perfeito para terapia de tumor.

a Imagens de tumores isolados de camundongos portadores de tumor após tratamento de salina, DOX livre, DN-GNPs, DR-GNPs e DRN-GNPs (injeção tumoral e injeção intravenosa). b Imagens histológicas de tumores dos camundongos após tratados com salina, DOX livre, DN-GNPs, DR-GNPs e DRN-GNPs (injeção tumoral e injeção intravenosa). c Peso corporal, volume do tumor (d), taxa de inibição de tumor (e) e peso do tumor (f) de camundongos portadores de tumor durante 14 dias de tratamento; dados são representados como médias ± desvios padrão (n = 6)

Imagens histológicas dos órgãos principais (coração, fígado, baço, pulmão e rim) dos camundongos após tratados com salina, DOX livre, DR-GNPs, DN-GNPs e DRN-GNPs (injeção tumoral e injeção intravenosa)

Conclusão

Neste estudo, desenvolvemos com sucesso um método de uma etapa para preparar os DRN-GNPs multifuncionais em cerca de meia hora. Os GNPs também foram aplicados com sucesso ao imageamento direcionado de tumor e terapia de tumor tanto in vitro quanto in vivo. O sucesso mostra que é possível fazer uso total da capacidade redutora e estabilizadora do DOX, peptídeos RGD e peptídeos CCYNLS, que tornarão o processo de síntese de GNPs simples e eficiente. Mais importante, os DRN-GNPs sintetizados em uma etapa ainda possuem boa estabilidade coloidal no sistema fisiológico, e os peptídeos conjugados na superfície mantiveram a capacidade de direcionamento e o DOX ainda possui sua capacidade antitumoral. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relato para síntese de DOX, RGD e peptídeos CCYNLS conjugados GNPs multifuncionais com método de uma etapa, e sua aplicação em imageamento, diagnóstico e terapia de tumor. Esta estratégia está em linha com a direção de desenvolvimento da química verde, e estabeleceria a base para aplicações em larga escala no futuro próximo. Esperamos que nosso relato forneça um novo caminho para a síntese em uma etapa de nanomateriais multifuncionais usados para imageamento e terapia de tumor.

Disponibilidade de Dados e Materiais

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Abreviações

Peptídeos CCYNLS:

A sequência de aminoácido é cisteína-cisteína-tirosina-prolina-prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina

Peptídeos RGD cíclicos:

A sequência de aminoácido é arginina-glicina-aspartato-tirosina-ácido glutâmico

DOX:

Doxorrubicina

DR-GNPs:

DOX-RGD-GNPs, DN-GNPs: DOX-NLS-GNPs, DRN-GNPs: DOX-RGD-NLS GNPs

GNPs:

Nanopartículas de ouro