Interações entre Nanopartículas de Ouro e Fármacos Causam Dano Renal Agudo em Camundongos: Estudo de Toxicidade Dependente do Tamanho

Resumo

Nanomateriais são materiais inovadores com muitas propriedades úteis, mas existe preocupação quanto aos seus efeitos desconhecidos em organismos vivos. Nanopartículas de ouro são amplamente utilizadas como materiais industriais devido às suas excelentes propriedades. Os potenciais riscos biológicos das nanopartículas de ouro são desconhecidos; portanto, examinamos aqui os efeitos in vivo de nanopartículas de ouro com 10, 50 e 100 nm de diâmetro (GnP10, GnP50 e GnP100, respectivamente) e suas interações com fármacos em camundongos, para esclarecer sua segurança em mamíferos. Cisplatina, paraquat e ácido 5-aminossalicílico causam danos hepáticos e renais como efeitos colaterais em camundongos. Nenhuma hepatotoxicidade ou nefrotoxicidade foi observada quando qualquer uma das nanopartículas de ouro foi administrada isoladamente via veia caudal. Em contraste, a coadministração de GnP10 com cisplatina, paraquat ou ácido 5-aminossalicílico causou danos renais por efeito colateral. Isso sugere que nanopartículas de ouro com tamanho de partícula de 10 nm são potencialmente nefrotóxicas devido à sua interação com fármacos.

Introdução

A nanotecnologia desempenha um papel cada vez mais importante no século XXI, com os nanomateriais sustentando o progresso na área. Desenvolvimentos recentes na fabricação de nanopartículas auxiliaram o uso de nanomateriais inovadores em todo o mundo. Nanomateriais têm diâmetro de 100 nm ou menos, e incluem nanopartículas de ouro, prata, sílica, platina e dióxido de titânio, além de fulerenos e nanotubos de carbono. Esses materiais podem encontrar aplicação em tecnologia de armazenamento eletrônico, medicina genética/regenerativa e dispositivos eletrônicos, sendo as bases de novas indústrias no século XXI. No entanto, nanopartículas como PM2.5 causam séria poluição ambiental, doenças respiratórias como asma e doença cardíaca isquêmica. Além disso, partículas de diesel emitidas por automóveis podem ter efeitos biológicos ao entrar no cérebro e órgãos reprodutivos, partículas fibrosas finas como amianto induzem mesotelioma, e nanomateriais fibrosos industriais como nanotubos de carbono podem impactar negativamente a saúde humana. Muitos desconhecidos permanecem, portanto, quanto aos efeitos biológicos das nanopartículas.

O ouro (Au) tem baixa tendência à ionização e alta estabilidade, sendo usado como metal precioso para fins decorativos desde a antiguidade. Nanopartículas de ouro desenvolvidas recentemente são amplamente utilizadas em aplicações médicas e de engenharia devido às suas propriedades ópticas características, e suas excelentes propriedades optoeletrônicas resultaram em seu uso em células solares orgânicas, sondas de sensores e materiais condutores. Nanopartículas de ouro são usadas na indústria química como catalisadores para síntese de resina acrílica. Também exibem atividade catalítica superior em baixa temperatura para oxidação de CO comparadas a nanopartículas de platina, resultando em seu uso como catalisador de purificação de gases de escape. Esperam-se mais aplicações de nanopartículas de ouro no futuro, mas pouca pesquisa foi feita sobre a toxicidade das nanopartículas de ouro e sua potencial interação com fármacos.

O campo da nanotecnologia está se expandindo à medida que pesquisadores exploram a segurança, farmacologia e farmacocinética das nanopartículas. Nanopartículas de sílica demonstraram causar citotoxicidade, hepatotoxicidade e dano placentário, e nanotubos de carbono podem induzir mesotelioma pulmonar. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos farmacológicos resultantes de interações entre nanopartículas e fármacos. Neste estudo, investigamos a toxicidade de partículas de ouro com 10, 50 e 100 nm de diâmetro (GnP10, GnP50 e GnP100, respectivamente) em camundongos para esclarecer sua segurança em mamíferos. Além disso, examinamos os efeitos dessas nanopartículas na toxicidade de paraquat (PQ, hepatotoxina e nefrotoxina bem conhecida), cisplatina (CDDP, agente antitumoral amplamente utilizado) e ácido 5-aminossalicílico (5-ASA, anti-inflamatório comum).

Resultados e Discussão

Primeiro, medimos os tamanhos das nanopartículas de ouro usando um Zetasizer e observamos as partículas por microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 1a, b, c). Os diâmetros médios das nanopartículas GnP10, GnP50 e GnP100 foram 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 e 97,0 ± 27,1 nm, respectivamente (Fig. Suplementar 1). Além disso, nanopartículas de ouro agregam quando medidas por microscopia eletrônica, mas não agregam quando administradas a camundongos. Também medimos a concentração de íons de ouro por ICP-MS, mas nenhum íon foi detectado (dados não mostrados). As superfícies das nanopartículas de ouro foram modificadas com ácido cítrico para aumentar a afinidade das nanopartículas pela água, mas essa modificação não exibiu outra funcionalidade.

Ultraestruturas das nanopartículas de ouro. Micrografias eletrônicas de nanopartículas GnP10 (a), GnP50 (b) e GnP100 (c)

Examinamos se GnP exibe hepatotoxicidade e nefrotoxicidade administrando uma dose máxima de 4 mg/kg a camundongos via veia caudal. Nenhuma hepatotoxicidade ou nefrotoxicidade foi observada quando nanopartículas de ouro foram administradas isoladamente (Fig. 2). Os valores de ALT e AST de camundongos administrados com GnP10, 50 e 100 isoladamente (Fig. 2a, b) foram semelhantes aos valores de controle, assim como os valores de BUN e Cr. Uma única administração de GnP a camundongos não induziu dano hepático ou renal, nem cardíaco, pulmonar ou esplênico (Fig. Suplementar 2), indicando que nanopartículas de ouro são não tóxicas quando administradas isoladamente a camundongos.

Efeito das nanopartículas de ouro na toxicidade induzida por cisplatina. Camundongos foram injetados intraperitonealmente com cisplatina (CDDP) a 0 (barras abertas) ou 100 μmol/kg (barras sólidas), junto com injeção IV de veículo ou nanopartículas de ouro (4 mg/kg). Em 24 h pós-injeção, níveis séricos das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT; painel a) e aspartato aminotransferase (AST; painel b), e níveis plasmáticos de nitrogênio ureico sanguíneo (BUN; painel c) e creatinina (Cr; painel d) foram determinados usando kits comerciais disponíveis (ver seção "Análises bioquímicas"). Dados apresentados como média ± erro padrão da média (SEM; n = 4). Diferença significativa (*P < 0,05, **P < 0,01) entre grupos tratados com veículo e CDDP

Dano hepático e renal foi relatado como induzido pela coadministração de nanopartículas de sílica, nanoclay ou nanopartículas de poliestireno com fármacos ou químicos. Portanto, coadministramos nanopartículas de ouro com PQ (toxina hepato-renal) ou os fármacos CDDP ou 5-ASA (que causam efeitos adversos hepáticos e nefrotóxicos). A Figura 2 mostra os resultados da interação entre nanopartículas de ouro e CDDP. A coadministração de GnP10 ou GnP50 com CDDP aumentou ALT e induziu dano hepático (Fig. 2a), e a coadministração de GnP10 com CDDP aumentou BUN e Cr, induzindo dano renal (Fig. 2c, d). Em seguida, investigamos a interação entre GnP e 5-ASA, anti-inflamatório amplamente utilizado que causa dano hepático e renal. A coadministração de GnP10 ou GnP50 com CDDP aumentou ALT e induziu dano hepático (Fig. 3a), enquanto a coadministração com 5-ASA aumentou BUN e Cr e induziu dano renal (Fig. 3c, d). Depois, investigamos a interação entre GnP e PQ, agrotóxico amplamente utilizado que causa dano hepático e renal. A coadministração de GnP10 com PQ aumentou níveis de BUN e Cr e induziu dano renal (Fig. 4c, d), mas não dano hepático (Fig. 4a, b). A coadministração das menores partículas de ouro testadas, GnP10, com CDDP, 5-ASA ou PQ resultou nos maiores valores de ALT, BUN e Cr observados neste estudo. As partículas 10× maiores de GnP100 não causaram dano hepático ou renal quando coadministradas com CDDP, 5-ASA ou PQ. Esses resultados mostram que GnP é tóxico quando partículas com menos de 100 nm de diâmetro são coadministradas com CDDP, 5-ASA ou PQ.

Efeito das nanopartículas de ouro na toxicidade induzida por ácido 5-aminossalicílico. Camundongos foram injetados intraperitonealmente com ácido 5-aminossalicílico (5-ASA) a 0 (barras abertas) ou 500 mg/kg (barras sólidas), junto com injeção IV de veículo ou nanopartículas de ouro (4 mg/kg). Em 24 h pós-injeção, níveis séricos das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT; a) e aspartato aminotransferase (AST; b), e níveis plasmáticos de nitrogênio ureico sanguíneo (BUN; c) e creatinina (Cr; d) foram determinados usando kits comerciais disponíveis (ver seção "Análises bioquímicas"). Dados apresentados como média ± erro padrão da média (SEM; n = 4). Diferença significativa (*P < 0,05, **P < 0,01) entre grupos tratados com veículo e 5-ASA

Efeito das nanopartículas de ouro na toxicidade induzida por paraquat. Camundongos foram injetados intraperitonealmente com paraquat (PQ) a 0 (barras abertas) ou 50 mg/kg (barras sólidas), junto com injeção IV de veículo ou nanopartículas de ouro (4 mg/kg). Em 24 h pós-injeção, níveis séricos das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT; a) e aspartato aminotransferase (AST; b), e níveis plasmáticos de nitrogênio ureico sanguíneo (BUN; c) e creatinina (Cr; d) foram determinados usando kits comerciais disponíveis (ver seção "Análises bioquímicas"). Dados apresentados como média ± erro padrão da média (SEM; n = 4). Diferença significativa (*P < 0,05, **P < 0,01) entre grupos tratados com veículo e PQ

A observação de hematoxilina e eosina renal após coadministração de GnP10 com CDDP, 5-ASA ou PQ (Fig. 5) mostrou dano tubular, sugerindo indução de lesão renal aguda. Em seguida, medimos IL-6 e TNF-α no soro para investigar a causa subjacente do dano renal agudo induzido por GnP10. A Figura 6 mostra níveis séricos de IL-6 3 h após coadministração de GnP10 com CDDP, 5-ASA ou PQ. IL-6 não foi detectada no grupo GnP10 isolado, mas um aumento de IL-6 foi observado quando GnP10 foi coadministrado com CDDP, 5-ASA ou PQ. TNF-α não foi detectado em nenhum grupo (dados não mostrados). Esses resultados sugerem que IL-6 está envolvida no dano renal agudo induzido por GnP10 com CDDP, 5-ASA ou PQ.

Análise histológica de tecidos renais de camundongos tratados com nanopartículas de ouro. Em 24 h pós-administração IV de apenas GnP10 (a), GnP10 com CDDP (b), GnP10 com 5-ASA (c) e GnP10 com PQ (d), tecidos foram coletados, fixados com 4% paraformaldeído, seccionados e corados com hematoxilina e eosina. Setas indicam locais de dano renal

Níveis de IL-6 no soro, medidos por ELISA. Camundongos receberam injeção IV de GnP10 com CDDP, 5-ASA ou PQ. Níveis de citocinas foram medidos 3 h após administração. Valores são média ± erro padrão (SE; n = 4)

Investigamos o efeito da coadministração de nanopartículas de ouro e fármacos sobre efeitos colaterais (isto é, dano hepático e renal). A menor partícula testada, GnP10, induziu dano renal e hepático na coadministração com CDDP, 5-ASA ou PQ. Também coadministramos GnP10 com paracetamol, estreptomicina ou tetraciclina a camundongos e não observamos dano hepático ou renal (dados não mostrados). Relatamos anteriormente que nanopartículas de sílica induzem dano hepático dependendo do tamanho da partícula, e nanopartículas de poliestireno podem induzir dano hepático na coadministração com um fármaco, dependendo do tamanho da partícula. Xia et al. relataram que nanopartículas de ouro menores são mais genotóxicas in vitro. Juntos, nanopartículas de ouro tornam-se altamente tóxicas devido a interações com fármacos à medida que o tamanho da partícula é reduzido.

A coadministração de GnP10 com cisplatina, 5-ASA ou PQ aumentou níveis de IL-6 (Fig. 6). IL-6 não foi elevada pela administração isolada de GnP10 (Fig. 6) nem pela administração isolada de CDDP, PQ ou 5-ASA (dados não mostrados). IL-6 foi previamente relatada como envolvida na indução de dano hepático e renal agudo. Acreditamos que GnP10 induz IL-6, que por sua vez induz dano hepático e renal, mas o mecanismo subjacente permanece obscuro. Bauza et al. relatam que IL-6 induz dano hepático induzindo fatores de transcrição em hepatócitos. Entender o envolvimento de fatores de transcrição específicos de células no dano hepático e renal induzido por IL-6 exigirá mais experimentos sobre o mecanismo por trás da citotoxicidade de nanopartículas de ouro.

Recentemente, nanopartículas de ouro têm atraído atenção como biomaterial funcional usado em sistemas de liberação de fármacos, e pesquisa sobre tratamento de câncer usando nanopartículas de ouro está sendo ativamente conduzida. Por exemplo, Anselmo et al. relataram que nanopartículas de sílica-ouro revestidas com PEG aumentaram a temperatura local ao absorver luz e dissolveram termicamente tumores sólidos, mostrando que nanopartículas de ouro são materiais promissores para tratamento de câncer. No entanto, descobrimos que a interação entre o fármaco anticâncer cisplatina e nanopartículas de ouro induziu dano renal (Fig. 2), sugerindo que o uso de nanopartículas de ouro no tratamento de câncer requer estudo de sua segurança quando coadministradas com o fármaco.

Conclusões

Em resumo, GnP10 causou dano renal na coadministração com CDDP, PQ ou 5-ASA. GnP50 causou dano renal apenas quando coadministrado com 5-ASA, enquanto GnP100 não causou. Demonstramos que nanopartículas de ouro podem causar dano renal e que esse efeito pode ser exacerbado sinergicamente como resultado de interações com químicos ou fármacos. Estudos adicionais baseados nesses dados serão necessários para elucidar completamente os perfis toxicológicos de nanopartículas propostas para uso diagnóstico ou terapêutico.

Materiais e Métodos

Materiais

Suspensões de partículas de ouro com ligante citrato de 10, 50 e 100 nm de diâmetro foram obtidas da NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, EUA). As distribuições de tamanho das partículas foram analisadas usando um Zetasizer (Sysmex Co., Kobe, Japão) e um microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM-1011. Os diâmetros médios foram 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 e 87,0 ± 27,1 nm (Fig. 1, Fig. Suplementar 1). Suspensões aquosas (1 mg/mL) foram completamente dispersas por sonicação antes do uso e diluídas com água. A presença de ouro ionizado nas suspensões de nanopartículas de ouro foi examinada por ICP-MS, e nenhum ouro ionizado foi detectado. Volumes idênticos de cada suspensão foram injetados em camundongos para cada experimento. Os tamanhos geométricos das partículas foram caracterizados por MET. Paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), cisplatina e ácido 5-aminossalicílico (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão) foram dissolvidos em salina e armazenados a −20 °C até o uso. Todos os reagentes eram de grau de pesquisa.

Animais

Camundongos BALB/c machos de oito semanas foram comprados da Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Japão). Os animais foram mantidos em ambiente controlado (temperatura 23 ± 1,5 °C; ciclo luz/escuro 12 h) com acesso livre a ração padrão para roedores e água. Os camundongos tiveram 1 semana para aclimatação antes de iniciar os experimentos. Os protocolos experimentais conformaram-se às diretrizes éticas da Escola de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Teikyo Heisei, compiladas a partir das Diretrizes para Experimentação Animal da Associação Japonesa de Ciências de Animais de Laboratório.

Análises Bioquímicas

Alanina aminotransferase sérica (ALT), aspartato aminotransferase sérica (AST), nitrogênio ureico sanguíneo (BUN) e creatinina (Cr) foram medidos usando kits comerciais disponíveis (Wako Pure Chemical Industries) de acordo com os protocolos do fabricante. Brevemente, soro coletado (10 mL) foi combinado com 1 mL do reagente cor A (contendo urease) e incubado a 37 °C por 15 min. Após adição de 1 mL do reagente cor B, a amostra foi incubada a 37 °C por 10 min. Absorbância foi medida em comprimento de onda de 570 nm. Interleucina (IL)-6 e TNF-α foram analisados usando kit de ensaio imunoenzimático (ELISA) (BioSource International, CA, EUA). Todas as análises foram realizadas em estrita conformidade com as instruções do fabricante.

Análise Histológica

Em 24 h após administração da dose, os animais foram sacrificados e os fígados removidos e fixados com 4% paraformaldeído. Após processamento e seccionamento, secções finas de tecido foram coradas com hematoxilina e eosina para observação histológica.

Análise Estatística

Análises estatísticas foram realizadas com os formulários complementares Statcel, 3rd Excel Software (EMS publication Co., Ltd., Saitama, Japão). Todos os dados são apresentados como médias ± erro padrão da média (SEM). Diferenças significativas entre grupos controle e experimentais foram determinadas usando o teste de Dunnett; valor P menor que 0,05 foi considerado significativo.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Não aplicável.

Abreviações

ALT:

Alanina aminotransferase

AST:

Aspartato aminotransferase

BUN:

Nitrogênio ureico sanguíneo

PQ:

Paraquat

Cr:

Creatinina