Toxicidade de nanopartículas de ouro em camundongos devido à nanopartícula / interação medicamentosa induz dano renal agudo

Resumo

Nanomateriais são materiais inovadores com muitas propriedades úteis, mas há preocupação em relação aos seus muitos efeitos desconhecidos em organismos vivos. Nanopartículas de ouro são amplamente utilizadas como materiais industriais devido às suas excelentes propriedades. Os riscos biológicos potenciais das nanopartículas de ouro são desconhecidos e, portanto, examinamos os efeitos in vivo das nanopartículas de ouro de 10, 50 e 100 nm de diâmetro (GnP10, GnP50 e GnP100, respectivamente) e suas interações com drogas em camundongos para esclarecer sua segurança em mamíferos. A cisplatina, o paraquat e o ácido 5-aminossalicílico causam danos ao fígado e aos rins em camundongos. Nenhuma hepatotoxicidade ou nefrotoxicidade foi observada quando qualquer uma das nanopartículas de ouro sozinha foi administrada através da veia da cauda. Em contraste, a co-administração de GnP-10 com cisplatina, paraquat ou ácido 5-aminossalicílico causou danos ao rim por efeito colateral. Isso sugere que nanopartículas de ouro com tamanho de partícula de 10 nm são potencialmente nefrotóxicas devido à sua interação com drogas.

Introdução

A nanotecnologia está desempenhando um papel cada vez mais importante no século XXI, com os nanomateriais subjacentes ao progresso da nanotecnologia. Desenvolvimentos recentes na fabricação de nanopartículas têm auxiliado o uso de nanomateriais inovadores em todo o mundo [1, 2]. Os nanomateriais têm um diâmetro de 100 nm ou menos e os exemplos incluem ouro, prata, sílica, platina e nanopartículas de dióxido de titânio, bem como fulerenos e nanotubos de carbono [3, 4]. Esses materiais podem encontrar aplicação em tecnologia de armazenamento eletrônico, medicina genética / regenerativa e dispositivos eletrônicos, e são a base de novas indústrias no século XXI [5]. No entanto, nanopartículas como o PM2.5 causam poluição ambiental grave, doenças respiratórias como asma e doença isquêmica do coração [6]. Além disso, as partículas de diesel emitidas por automóveis podem ter efeitos biológicos ao entrar no cérebro e nos órgãos reprodutivos [7], partículas finas fibrosas como o amianto induzem mesotelioma e nanomateriais fibrosos industriais, como nanotubos de carbono, podem impactar negativamente a saúde humana [8, 9]. Muitas incógnitas, portanto, permanecem em relação aos efeitos biológicos das nanopartículas.

O ouro (Au) tem baixa tendência à ionização e alta estabilidade, sendo usado como metal precioso para fins decorativos desde a antiguidade. Nanopartículas de ouro desenvolvidas recentemente são amplamente utilizadas em aplicações médicas e de engenharia devido às suas propriedades ópticas características [10, 11], e suas excelentes propriedades optoeletrônicas resultaram em seu uso em células solares orgânicas, sondas sensoras e materiais condutores [12, 13] . Nanopartículas de ouro são utilizadas na indústria química como catalisadores para a síntese de resinas acrílicas. Eles também exibem atividade catalítica superior de baixa temperatura para oxidar CO em comparação com nanopartículas de platina, resultando em seu uso como um catalisador de purificação de gás de exaustão. Outras aplicações de nanopartículas de ouro são esperadas no futuro, mas tem havido pouca pesquisa sobre a toxicidade das nanopartículas de ouro e sua potencial interação com drogas.

O campo da nanotecnologia está se expandindo à medida que os pesquisadores exploram a segurança, farmacologia e farmacocinética das nanopartículas. Foi demonstrado que as nanopartículas de sílica causam citotoxicidade, hepatotoxicidade e danos à placenta [14, 15], e os nanotubos de carbono podem induzir mesotelioma pulmonar [16]. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos farmacológicos decorrentes das interações entre nanopartículas e fármacos. Neste estudo, investigamos a toxicidade das partículas de ouro de 10, 50 e 100 nm de diâmetro (GnP10, GnP50 e GnP100, respectivamente) em camundongos para esclarecer sua segurança em mamíferos. Além disso, examinamos os efeitos dessas nanopartículas sobre a toxicidade do paraquat (PQ, uma hepatotoxina e nefrotoxina bem conhecidas) [17], cisplatina (CDDP, um agente antitumoral amplamente utilizado) [18, 19] e 5-aminossalicílico ácido (5-ASA, um antiinflamatório comum) [20].

Resultados e discussão

Primeiro medimos os tamanhos de partícula das nanopartículas de ouro usando um Zetasizer, depois observamos as partículas usando microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 1a, b, c). Os diâmetros médios das nanopartículas de GnP10, GnP50 e GnP100 foram 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 e 97,0 ± 27,1 nm, respectivamente (Fig. 1 suplementar). Além disso, as nanopartículas de ouro se agregam quando medidas por microscopia eletrônica, mas não se agregam quando administradas a camundongos. Além disso, medimos a concentração de íons de ouro por ICP-MS, mas nenhum íon foi detectado (dados não mostrados). As superfícies das nanopartículas de ouro foram modificadas com ácido cítrico para aumentar a afinidade das nanopartículas por água, mas essa modificação não exibiu nenhuma outra funcionalidade.

Ultraestruturas de nanopartículas de ouro. Micrografias eletrônicas de GnP10 ( a ), GnP50 ( b ) e GnP100 ( c ) nanopartículas

Examinamos se o GnP exibe hepatotoxicidade e nefrotoxicidade pela administração de uma dose máxima de 4 mg / kg em camundongos pela veia da cauda. Nenhuma hepatotoxicidade ou nefrotoxicidade foi observada quando nanopartículas de ouro sozinhas foram administradas (Fig. 2). Os valores de ALT e AST de camundongos administrados com GnP10, 50 e 100 sozinhos (Fig. 2a, b) foram semelhantes aos valores de controle, assim como os valores de BUN e Cr. Uma única administração de GnP a camundongos não induziu danos ao fígado ou rim, nem danos ao coração, pulmão ou baço (Fig. 2 suplementar), indicando que as nanopartículas de ouro não são tóxicas quando administradas sozinhas a camundongos.

Efeito das nanopartículas de ouro na toxicidade induzida pela cisplatina. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com cisplatina (CDDP) a 0 (barras abertas) ou 100 μmol / kg (barras sólidas), juntamente com uma injeção IV de veículo ou nanopartículas de ouro (4 mg / kg). Em 24 horas após a injeção, os níveis séricos das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT; painel a ) e aspartato aminotransferase (AST; painel b ), e os níveis plasmáticos de nitrogênio ureico no sangue (BUN; painel c ) e creatinina (Cr; painel d ) foram determinados usando kits disponíveis comercialmente (consulte a seção “Análises bioquímicas”). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM; n =4). Diferença significativa (* P <0,05, ** P <0,01) entre os grupos tratados com veículo e CDDP

Foi relatado que danos ao fígado e aos rins são induzidos pela co-administração de nanopartículas de sílica, nanopartículas ou nanopartículas de poliestireno com drogas ou produtos químicos [14, 21, 22]. Portanto, co-administramos nanopartículas de ouro com PQ (uma toxina hepática-renal) ou os medicamentos CDDP ou 5-ASA (que causam efeitos adversos nefrotóxicos para o fígado). A Figura 2 mostra os resultados da interação entre nanopartículas de ouro e CDDP. A co-administração de GnP10 ou GnP50 e CDDP aumentou ALT e induziu dano hepático (Fig. 2a), e a co-administração de GnP10 e CDDP aumentou BUN e Cr, induzindo dano renal (Fig. 2c, d). Em seguida, investigamos a interação entre o GnP e o 5-ASA, um antiinflamatório amplamente utilizado que causa danos ao fígado e aos rins. A coadministração de GnP10 ou GnP50 com CDDP aumentou ALT e induziu danos ao fígado (Fig. 3a), enquanto a coadministração com 5-ASA aumentou BUN e Cr e induziu dano renal (Fig. 3c, d). Em seguida, investigamos a interação entre GnP e PQ, um agroquímico amplamente usado que causa danos ao fígado e aos rins. A co-administração de GnP10 e PQ aumentou os níveis de BUN e Cr e induziu dano renal (Fig. 4c, d), mas não dano ao fígado (Fig. 4a, b). A co-administração das menores partículas de ouro testadas, GnP10, com CDDP, 5-ASA ou PQ resultou nos maiores valores de ALT, BUN e Cr observados neste estudo. As partículas 10 × maiores de GnP100 não causaram danos ao fígado ou rins quando coadministradas com CDDP, 5-ASA ou PQ. Estes resultados mostram que o GnP é tóxico quando as partículas com menos de 100 nm de diâmetro são coadministradas com CDDP, 5-ASA ou PQ.

Efeito das nanopartículas de ouro na toxicidade induzida pelo ácido 5-aminossalicílico. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com ácido 5-aminossalicílico (5-ASA) a 0 (barras abertas) ou 500 mg / kg (barras sólidas), juntamente com uma injeção IV de veículo ou nanopartículas de ouro (4 mg / kg). Às 24 horas após a injeção, os níveis séricos das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT; a ) e aspartato aminotransferase (AST; B), e os níveis plasmáticos de nitrogênio ureico no sangue (BUN; c ) e creatinina (Cr; d ) foram determinados usando kits disponíveis comercialmente (consulte a seção “Análises bioquímicas”). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM; n =4). Diferença significativa (* P <0,05, ** P <0,01) entre os grupos tratados com veículo e 5-ASA

Efeito das nanopartículas de ouro na toxicidade induzida pelo paraquat. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com paraquat (PQ) a 0 (barras abertas) ou 50 mg / kg (barras sólidas), juntamente com uma injeção IV de veículo ou nanopartículas de ouro (4 mg / kg). Às 24 horas após a injeção, os níveis séricos das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT; a ) e aspartato aminotransferase (AST; b ), e os níveis plasmáticos de nitrogênio ureico no sangue (BUN; c ) e creatinina (Cr; d ) foram determinados usando kits disponíveis comercialmente (consulte a seção “Análises bioquímicas”). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM; n =4). Diferença significativa (* P <0,05, ** P <0,01) entre os grupos tratados com veículo e PQ

A observação de hematoxilina e eosina renal após co-administração de GnP10 com CDDP, 5-ASA ou PQ (Fig. 5) mostrou lesão tubular, sugerindo a indução de lesão renal aguda. Em seguida, medimos IL-6 e TNF-α no soro para investigar a causa subjacente do dano renal agudo induzido por GnP10. A Figura 6 mostra os níveis séricos de IL-6 3 h após a co-administração de GnP10 com CDDP, 5-ASA ou PQ. IL-6 não foi detectado no grupo GnP10 sozinho, mas um aumento em IL-6 foi observado quando GnP10 foi coadministrado com CDDP, 5-ASA ou PQ. TNF-α não foi detectado em nenhum grupo (dados não mostrados). Esses resultados sugerem que a IL-6 está envolvida na lesão renal aguda induzida por GnP10 e CDDP, 5-ASA ou PQ.

Análise histológica de tecidos renais de camundongos tratados com nanopartículas de ouro. Às 24 horas após a administração IV de apenas GnP10 ( a ), GnP10 com CDDP ( b ), GnP10 com 5-ASA ( c ), e GnP10 com PQ ( d ), os tecidos foram coletados, fixados com paraformaldeído a 4%, seccionados e corados com hematoxilina e eosina. As setas indicam os locais de lesão renal

Níveis de IL-6 no soro, medidos por ELISA. Os camundongos receberam uma injeção IV de GnP10 com CDDP, 5-ASA ou PQ. Os níveis de citocinas foram medidos 3 horas após a administração. Os valores são a média ± erro padrão (SE; n =4)

Nós investigamos o efeito da co-administração de nanopartículas de ouro e drogas sobre os efeitos colaterais (ou seja, danos ao fígado e rins). O menor tamanho de partícula, GnP10, induziu danos renais e hepáticos após co-administração com CDDP, 5-ASA ou PQ. Também co-administramos GnP10 com paracetamol, estreptomicina ou tetraciclina a camundongos e não observamos danos ao fígado ou rins (dados não mostrados). Nós relatamos anteriormente que as nanopartículas de sílica induzem danos ao fígado, dependendo do tamanho da partícula [23], e as nanopartículas de poliestireno podem induzir danos ao fígado após a coadministração com um medicamento, dependendo do tamanho da partícula [24]. Xia et al. relataram que nanopartículas de ouro menores são mais genotóxicas in vitro [25]. Juntas, as nanopartículas de ouro tornam-se altamente tóxicas devido às interações com drogas à medida que o tamanho das partículas é reduzido.

A co-administração de Gnp10 com cisplatina, 5-ASA ou PQ aumentou os níveis de IL-6 (Fig. 6). A IL-6 não foi elevada pela administração de GnP10 sozinha (Fig. 6) ou pela administração de CDDP, PQ ou 5-ASA sozinha (dados não mostrados). Foi relatado anteriormente que IL-6 está envolvida na indução de lesão hepática [26] e renal aguda [27, 28]. Acreditamos que o Gnp10 induz a IL-6, que por sua vez induz danos ao fígado e aos rins, mas o mecanismo subjacente permanece obscuro. Bauza et al. relatam que a IL-6 induz danos ao fígado por meio da indução de fatores de transcrição em hepatócitos [29]. Compreender o envolvimento de fatores de transcrição específicos de células em danos ao fígado e rins induzidos por IL-6 exigirá mais experimentos sobre o mecanismo por trás da citotoxicidade das nanopartículas de ouro.

Recentemente, nanopartículas de ouro têm chamado a atenção como um biomaterial funcional usado em sistemas de liberação de drogas [30], e pesquisas sobre o tratamento do câncer usando nanopartículas de ouro estão sendo ativamente conduzidas. Por exemplo, Anselmo et al. relataram que nanopartículas de sílica-ouro revestidas com PEG aumentaram a temperatura local ao absorver luz e tumores sólidos termicamente dissolvidos [31], mostrando que nanopartículas de ouro são materiais promissores para o tratamento do câncer. No entanto, descobrimos que a interação entre o fármaco anticâncer cisplatina e nanopartículas de ouro induziu dano renal (Fig. 2), sugerindo que o uso de nanopartículas de ouro no tratamento do câncer requer o estudo de sua segurança quando co-administrado com o fármaco.

Conclusões

Em resumo, Gnp10 causou danos renais após coadministração com CDDP, PQ ou 5-ASA. O GnP50 causou danos renais apenas quando coadministrado com 5-ASA, enquanto o GnP100 não. Demonstramos que as nanopartículas de ouro podem causar danos aos rins e que esse efeito pode ser exacerbado sinergicamente como resultado de interações com produtos químicos ou drogas. Novos estudos baseados nesses dados serão necessários para elucidar completamente os perfis toxicológicos das nanopartículas propostas para uso diagnóstico ou terapêutico.

Materiais e métodos

Materiais

As suspensões de partículas de ouro revestidas com citrato-ligante de 10, 50 e 100 nm de diâmetro foram obtidas na NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, EUA). As distribuições de tamanho das partículas foram analisadas usando um Zetasizer (Sysmex Co., Kobe, Japão) e um microscópio eletrônico de transmissão TEM JEOL JEM-1011. Os diâmetros médios foram 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 e 87,0 ± 27,1 nm (Fig. 1, Fig. 1 Suplementar). As suspensões aquosas (1 mg / mL) foram completamente dispersas por sonicação antes do uso e diluídas com água. A presença de ouro ionizado nas suspensões de nanopartículas de ouro foi examinada por ICP-MS, e nenhum ouro ionizado foi detectado. Volumes idênticos de cada suspensão foram injetados em camundongos para cada experiência. Os tamanhos geométricos das partículas foram caracterizados por TEM. Paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), cisplatina e ácido 5-aminossalicílico (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão) foram dissolvidos em solução salina e armazenados a -20 ° C até o uso. Todos os reagentes eram de grau de pesquisa.

Animais

Ratinhos BALB / c machos com oito semanas de idade foram adquiridos a Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Japão). Os animais foram mantidos em ambiente controlado (temperatura 23 ± 1,5 ° C; ciclo claro / escuro de 12 h claro / escuro) com livre acesso a ração padrão para roedores e água. Os ratos receberam 1 semana para se aclimatarem antes de iniciarem as experiências. Os protocolos experimentais estão em conformidade com as diretrizes éticas da Escola de Graduação em Ciências Farmacêuticas da Teikyo Heisei University, compiladas a partir das Diretrizes para Experimentação Animal da Associação Japonesa para Ciências de Animais de Laboratório.

Análises bioquímicas

Alanina aminotransferase sérica (ALT), aspartato aminotransferase sérica (AST), nitrogênio ureico no sangue (BUN) e creatinina (Cr) foram medidos usando kits comercialmente disponíveis (Wako Pure Chemical Industries) de acordo com os protocolos do fabricante. Resumidamente, o soro coletado (10 mL) foi combinado com 1 mL de reagente de cor A (contendo urease) e incubado a 37 ° C por 15 min. Após a adição de 1 mL do reagente de cor B, a amostra foi incubada a 37 ° C por 10 min. A absorvância foi medida em um comprimento de onda de 570 nm. Interleucina (IL) -6 e TNF-α foram analisados usando um kit de ensaio imunoenzimático (ELISA) (BioSource International, CA, EUA). Todas as análises foram realizadas em estrita conformidade com as instruções do fabricante.

Análise histológica

24 horas após a administração da dose, os animais foram sacrificados e os fígados removidos e fixados com paraformaldeído 4%. Após o processamento e corte, cortes finos de tecido foram corados com hematoxilina e eosina para observação histológica.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas com o Statcel add-in forms, 3rd Excel Software (publicação EMS Co., Ltd., Saitama, Japão). Todos os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Diferenças significativas entre os grupos controle e experimental foram determinadas usando o teste de Dunnett; a P valor inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Disponibilidade de dados e materiais

Não aplicável.

Abreviações

ALT:: Alanina aminotransferase
AST:: Aspartato aminotransferase
BUN:: Nitrogênio da uréia no sangue
PQ:: Paraquat
Cr:: Creatinina

Dois efeitos de transparência induzida por plasma selecionáveis em um sistema com ressonadores de grafeno distintos Síntese de Nanopartículas de Ouro de Vários Tamanhos pelo Método de Redução Química com Diferente Polaridade de Solvente

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias